全 文 ：中国生态农业学报 2016年 2月 第 24卷 第 2期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Feb. 2016, 24(2): 210217


* 国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2011AA10A104)、国家重点基础研究发展计划(973 计划)项目(2015CB150206)、国家公益性
行业(农业)科研专项(200903002-04)、现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-13)、国家自然基金项目(31460356)和国家农业科技
成果转化项目(2014G10000317)资助
** 通讯作者: 孙万仓, 主要从事油菜育种及十字花科种质资源研究。E-mail: 18293121851@163.com
† 同等贡献者: 杨刚, 研究方向为作物生理, E-mail: yangang1018@163.com; 史鹏辉, 研究方向为作物遗传育种, E-mail: shiph150@163.com
收稿日期: 20151015 接受日期: 20151120
 This study was supported by the National High-tech R&D Program of China (863 Program) (No. 2011AA10A104), the National Basic
Research Program of China (973 Program) (No. 2015CB150206), the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (No.
200903002-04), Special Fund for the Industrial Technology System Construction of Modem Agriculture (No. CARS-13), the National Natural
Science Foundation of China (No. 31460356) and the National Agricultural Science and Technology Achievement Transformation Project (No.
2014G10000317).
** Corresponding author, E-mail: 18293121851@163.com
† Equal contributors
Received Oct. 15, 2015; accepted Nov. 20, 2015
http://www.ecoagri.ac.cn
DOI: 10.13930/j.cnki.cjea.151113
白菜型冬油菜质外体抗冻蛋白研究*
杨 刚† 史鹏辉† 孙万仓** 刘自刚 曾秀存 武军艳 方 彦
李学才 陈 奇 刘林波 杨建胜 方 园 张 娟
(甘肃省油菜工程技术研究中心/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室/甘肃省干旱生境作物重点实验室/
甘肃农业大学农学院 兰州 730070)
摘 要 为探明冬油菜抗寒机理, 采用大田试验和盆栽试验, 对低温胁迫的白菜型冬油菜品种‘陇油 6号’叶片
和根的质外体蛋白进行抗冻活性检测, 通过 SDS-PAGE 分离质外体蛋白并结合 MALDI-TOF/TOF 质谱技术对
部分高表达蛋白进行了鉴定。结果表明, ‘陇油 6号’经人工气候室冷驯化后, 叶片质外体蛋白质含量显著增加
(P<0.05), 在第 5 d达 92.31 µgg1(FW), 比对照增加 246.12%。质外体蛋白含量在冷驯化第 10 d和第 15 d与
第 5 d相比虽有所降低, 但仍显著高于对照(P<0.05)。在冷驯化第 20 d和第 25 d质外体蛋白含量继续显著增加,
第 25 d达到最高值(P<0.05)。室温恢复生长 10 d后, 质外体蛋白含量比之前显著下降(P<0.05), 但仍高于对照
和冷驯化第 10 d。在冷驯化过程中, ‘陇油 6号’叶片的质外体中出现明显的蛋白质积累, 室温恢复生长 10 d后, 质
外体中的蛋白质含量显著降低, 可见冷驯化的‘陇油 6号’质外体蛋白属低温诱导蛋白。抗冻活性检测发现其具
有重结晶抑制活性。质谱鉴定发现多种功能尚不明确的蛋白质, 其中 β-1-3-葡聚糖酶与冬黑麦中报道的抗冻蛋
白一致。对质谱检测到的类葡聚糖酶回收及抗冻活性测试发现其有较弱的冰晶形态修饰作用, 表明这个类葡
聚糖酶是一种低活性抗冻蛋白。低温胁迫下冬油菜叶片和根质外体中合成分泌了抗冻蛋白, 在抵御外界低温
中起到积极作用, 同时推测超强抗寒性冬油菜质外体中可能存在多种未被发现的抗冻蛋白。
关键词 冬油菜 质外体 抗冻蛋白 葡聚糖酶 SDS-PAGE 质谱技术
中图分类号: Q946.1; Q945.78 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2016)02-0210-08
Study on apoplast anti-freeze proteins in winter turnip rape (Brassica rape L.)*
YANG Gang†, SHI Penghui†, SUN Wancang**, LIU Zigang, ZENG Xiucun, WU Junyan, FANG Yan,
LI Xuecai, CHEN Qi, LIU Linbo, YANG Jiansheng, FANG Yuan, ZHANG Juan
(Gansu Research Center of Rapeseed Engineering and Technology / Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement
of Gansu Province / Gansu Provincial Key Laboratory of Arid Land Crop Sciences / College of Agronomy, Gansu Agricultural
University, Lanzhou 730070, China)
Abstract The objective of this paper was to lay the basis for studying cold resistance of winter rapeseed. The anti-freeze
activities of apoplast proteins were determined in the ‘Longyou 6’ winter rape leaves and roots under cold vernalization. The
apoplast proteins were separated by SDS-PAGE and high expression proteins identified in MALDI-TOF/TOF mass
第 2期 杨 刚等: 白菜型冬油菜质外体抗冻蛋白研究 211


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spectrometry under field and pot experiments. The results showed that apoplast protein content of ‘Longyou 6’ leaves
increased significantly (P < 0.05) after cold acclimation in an artificial climate chamber, reaching 92.31 µgg1(FW) on the
fifth day, which represented an increase of 246.12% over CK. Apoplast protein content after 10–15 days of cold acclimation
dropped compared with that after 5 days, but was still significantly higher than that of CK (P < 0.05). Apoplast protein content
continued to increase with increasing cold acclimation time from 20 to 25 days (P < 0.05). Apoplast protein content decreased
significantly with after 10 days of de-acclimation. In the process of cold acclimation, apoplast protein content of ‘Longyou 6’
leaves significantly accumulated. However, it decreased significantly after de-acclimation. Obviously, apoplast proteins of
‘Longyou 6’ winter rape belonged to low temperature induced proteins. Anti-freeze activity detection analysis suggested that
apoplast proteins had re-crystallization inhibition activity. Mass spectrometry identification revealed a variety of proteins with
unclear functions along with β-1-3-glucanase consistent anti-freeze proteins reported in winter rye. The class glucanase
detected by mass spectrometry was found to have weaker ice crystal forms due to modification effect with reclamation and
anti-freeze activity test. The test suggested that this class glucanase was a low activity anti-freeze protein. Many anti-freeze
proteins were synthesized and secreted by winter rape in apoplast of leaves and roots under low temperature stress. The
proteins likely played a positive role against outside low temperature. Furthermore, it was speculated that there were many
undetected anti-freeze apoplast proteins responsible for the strong winter hardiness of winter rapeseed.
Keywords Winter turnip rape; Apoplast; Anti-freeze protein; Glucanase; SDS-PAGE; Mass spectrometry
冬油菜是我国重要的冬季油料作物, 但严寒的
气候严重制约着我国北方冬油菜的发展。自孙万仓
等[1]提出冬油菜向我国北方旱寒区北移的可行性后,
冬油菜种植面积日益扩大, 产生了巨大的生态效益
和经济效益。冬油菜的成功北移, 主要依赖于超强
抗寒品种的成功选育。陇油系列白菜型冬油菜品种
抗寒性优异, 但其抗寒机理尚不完全清楚。冬油菜
抗冻蛋白(antifreeze proteins, AFPs)的研究, 为进一
步探明冬油菜抗寒机理和冬油菜北移奠定理论依
据。1992 年, Griffith 等[2]首次证明了冷驯化的冬黑
麦(Secale cereale)质外体中存在抗冻蛋白 , 开启了
植物中抗冻蛋白研究的先河。Hon 等[3]对冬黑麦质
外体提取液进行 SDS-PAGE 电泳, 然后直接回收凝
胶上的蛋白质带并对其研究, 发现了至少 4 个抗冻
多肽, 虽然在 SDS-PAGE 样品的 2-ME 还原和沸水
预处理过程中, 抗冻蛋白活性会消失, 但 Hon 等在
冬黑麦抗冻多肽研究时发现, 从 SDS-PAGE 电泳凝
胶上回收的抗冻多肽经丙酮沉淀后仍具有修饰冰晶
形态功能, 这种方法现已成为分离抗冻蛋白最简便
的方法。研究表明, 许多越冬植物中都存在抗冻蛋
白, 而且具有鱼类 AFPs类似的特性, 在提高植物细
胞的抗冰冻能力中扮演重要角色。之后不同学者在
沙冬青(Ammopiptanthus monglicus)[45]、高山植物唐古
特红景天 (Rhodiola algida var. tangutica)[6]、胡萝卜
(Daucus carota)[7]、珠芽蓼(Polygonum viviparum)[8]和冬
小麦 (Triticum aestivum)[9]等许多植物中发现了
AFPs。我们之前的研究表明, 冷驯化的冬油菜在冰
点下低温环境中能维持根细胞的溶液状态(过冷却
态), 推测冬油菜中可能存在抗冻蛋白[10]。重结晶抑
制活性(RI)是抗冻蛋白的一个重要特性 , 所谓重结
晶是指在已经形成的冰晶体颗粒大小的重新分布 ,
即一些冰晶增大, 而另一些减小, 并且大的冰晶越
长越大, 小的越来越小, 直至消失。抗冻蛋白(AFPs)
作为一类能直接和冰晶相互作用的蛋白质, 具有修
饰冰晶形态、抑制冰的重晶化等作用[11], 在动植物
抵御外界低温冻害中起着积极作用, 然而冬油菜中
是否存在抗冻蛋白尚少见研究报道。本研究采用冰
晶重结晶效应的显微观察法, 测试冷驯化后冬油菜
叶片和根部的质外体粗提物的抗冻活性 , 结合
SDS-PAGE 和蛋白串联质谱鉴定技术, 探讨冬油菜
质外体抗冻蛋白抗冻活性, 以期为白菜型冬油菜抗
寒机理研究提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究以超强抗寒冬油菜品种‘陇油 6 号’为试
验材料, 种子由甘肃农业大学农学院提供。
1.2 试验方法
1.2.1 试验材料处理
田间种植 : 在甘肃省兰州市沙井驿试验基地 ,
于2013年8月15日播种, 田间常规管理, 分别于10月
5日(温度为19 /7 )℃ ℃ 、11月15日(温度为12 /1℃ )℃ 、
12月1日(温度为5 /℃ 6 )℃ 采取新鲜叶片, 提取蛋
白样品。
盆栽试验: 采用普通的 15 cm×13 cm的营养钵,
以营养土做基质, 在室温播种后, 待幼苗生长至 5~6
叶期开始试验处理。第 1 阶段: 室温非冷驯化处理
(non-acclimation, NA), 光照 14 h, 25 ; ℃ 黑暗 10 h,
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20 ; ℃ 生长 7 d 取样。第 2 阶段: 冷驯化处理(cold
acclimation, CA), 光照 8 h, 6 ; ℃ 黑暗 16 h, 4 ℃; 连
续处理 25 d, 每 5 d取样 1次。第 3阶段: 室温恢复
生长(non-acclimation, NA), 光照 14 h, 25 ; ℃ 黑暗
10 h, 20 ; 10 d℃ 后取样 1次。取样完毕, 提取蛋白
质, 设 3个重复。
1.2.2 质外体蛋白的提取和定量
参考龚束芳等[12]的方法, 稍作改进: 先用流水将叶
片冲洗干净, 用ddH2O冲洗2遍, 滤纸吸干表面水分后,
切成 1.0 cm 左右长条, 用提取缓冲液(50 mmol·L1
Tris-HCl pH 8.0, 10 mmol·L1 EDTA, 20 mmol·L1 Vc)
浸洗去掉渗出物, 将叶片浸入上述缓冲液中, 室温抽真
空 30 min, 再用滤纸吸去叶片表面溶液, 放入 50 mL注
射器, 将注射器放入离心管中, 平衡后 7 000 rmin1,
4 , 20 min℃ 离心, 收集离心管底部溶液, 即为质外
体粗提物。
蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定[13]。
1.2.3 SDS电泳(SDS-PAGE)
SDS-PAGE参考郭尧君[14]的方法, 采用 4%浓缩
胶和 15%的分离胶。
1.2.4 质外体粗提液抗冻活性测定
采用冰晶重结晶效应的显微观察法, 测试冷驯
化后冬油菜叶片和根部的质外体粗提物的抗冻活性,
参考 Knight等[15]的方法, 略有改动。
1.2.5 SDS-PAGE蛋白质条带回收
参见 Hon 等[3]的方法。SDS-PAGE 电泳结束后,
凝胶用冷 ddH2O 冲洗, 用 0.1% (w/v)考马斯亮蓝
R-250染色, 再在脱色液中脱色。用锋利的小刀切下
相应位置的凝胶, 粉碎, 放入透析袋, 加入 5倍体积
含有 25 mmol·L1 TriS, pH8.3, 192 mmol·L1 Gly,
0.1%SDS 的洗脱液, 在 100 mA 恒流电泳至凝胶无
色, 12 000 rmin1离心 30 min, 弃沉淀, 上清液超滤
冻干。将沉淀稀释成合适浓度后测定抗冻活性。
1.2.6 差异蛋白质谱检测
在电泳图选取处理后的差异条带切胶取出脱
色、酶解后, 采用 ABI 公司的串联飞行时间质谱仪
(4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer)分析。将获得
的质谱数据通过 Mascot 程序 (http://www.matrix
sciece.com) 在 NCBInr(NCBI-National center for
biotechnology information non-redundant database)上
进行检索。符合质谱鉴定要求的蛋白质序列在
Geneontology 数据库 (http://amigo.geneontology.org/
cgi-bin/amigo/blast.cgi)中进行功能分类。
2 结果与分析
2.1 冷驯化过程中‘陇油 6 号’叶片质外体蛋白含量
变化
如图 1所示, 室温下生长的‘陇油 6号’叶片的质
外体蛋白含量为 26.67 µgg1(FW)。经人工气候室冷
驯化后, 质外体蛋白质含量显著增加(P<0.05), 在第
5 d达 92.31 µgg1(FW), 相比对照增加 246.12%。质
外体蛋白含量在冷驯化第 10 d和第 15 d与第 5 d相
比虽有降低, 但仍明显高于对照(P<0.05)。在冷驯化
第 20 d和第 25 d质外体蛋白含量继续增加(P<0.05)。
将幼苗重新转移到室温恢复生长(脱锻炼)10 d 后 ,
质外体蛋白含量相比之前显著下降(P<0.05)。在冷驯
化过程中, ‘陇油 6号’叶片的质外体中出现明显的蛋
白质积累, 在脱锻炼后, 质外体中的蛋白质含量显
著降低, 可见, 低温下叶片质外体中积累的蛋白质
和油菜的冷驯化处理密切相关。

图 1 冷驯化盆栽试验中‘陇油 6 号’叶片质外体蛋白含量
变化
Fig. 1 Protein content change of apoplast in ‘Longyou 6’
leaves of pot experiment with different treatments
NA: 室温处理 ; CA5: 冷驯化5 d; CA10: 冷驯化10 d;
CA15: 冷驯化15 d; CA20: 冷驯化20 d; CA25: 冷驯化25 d;
NA10: 室温恢复生长(脱锻炼)10 d。下同。NA: non acclimation;
CA5: cold acclimation for 5 days; CA10: cold acclimation for 10
days; CA15: cold acclimation for 15 days; CA20: cold acclimation
for 20 days; CA25: cold acclimation for 25 days; NA10:
de-acclimation for 10 days. The same below.

2.2 冷驯化过程中‘陇油 6 号’质外体蛋白的 SDS-
PAGE分析
在对冷驯化过程中‘陇油 6 号’叶片质外体蛋白
含量分析的基础上, 进一步对其进行了 SDS-PAGE
分析, 如图 2a 所示, 电泳图谱分析与蛋白定量得出
的结果一致。室温下, 叶片质外体中的蛋白含量较
少(图 2a, 泳道 NA), 在冷驯化后, 蛋白的种类及其
表达量显著增加, 特别是分子量在 38 kD 左右的蛋
第 2期 杨 刚等: 白菜型冬油菜质外体抗冻蛋白研究 213


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图 2 冷驯化盆栽试验(a)和大田试验(b)‘陇油 6 号’叶片质外体蛋白 SDS-PAGE 电泳图谱
Fig. 2 SDS-PAGE electrophoretograms of apoplast proteins in ‘Longyou 6’ leaves of pot experiment with cold-acclimation (a)
and planted on field (b)
图 2a中 NA、CA5、CA10、CA15、CA20、CA25、NA10见图 1。图 2b中, 1和 4为 10月 5日(温度为 19 /7 )℃ ℃ 的叶片和根样
本, 2和 5为 11月 15日(温度为 12 /1 )℃ ℃ 的叶片和根样本、3和 6为 12月 1日(温度为 5 /℃ 6 )℃ 的叶片和根样本。In figure a, NA, CA5,
CA10, CA15, CA20, CA25, NA10 were shown in the figure 1. In the figure b, 1 and 4 were leaf and root samples at Oct. 5 at 19 /7 , ℃ ℃
2 and 5 were leaf and root samples at Nov. 15 at 12 /1 , 3 and ℃ ℃ 6 were leaf and root samples at Dec. 1 at 5 /℃ 6 .℃

白(S1), 在脱锻炼后表达量又显著降低, 表明此蛋白
与冷胁迫密切相关, 可作为抗冻蛋白的候选对象。
为验证盆栽试验结果的可靠性, 对田间生长的
‘陇油 6 号’叶片和根的质外体蛋白做电泳分析。
SDS-PAGE分析表明(图 2b), 其与人工气候室冷驯化
处理得到的结果一致。由于质外体蛋白含量较少, 导
致人工气候室处理得到的样品有限, 所以我们主要
以冬季田间生长的‘陇油 6号’为材料进行后续研究。
2.3 冷驯化的‘陇油 6号’质外体蛋白的抗冻活性分析
采用冰晶重结晶效应的显微观察法分析了‘陇
油 6 号’叶片和根的质外体粗提液中冰晶的生长特
性。如图 3所示, 与未驯化的‘陇油 6号’质外体粗提
液中的冰晶生长状态(图 3A、图 3C)相比, 冷驯化后
其质外体粗提液中的冰晶明显变小 , 且比较均匀 ,
数目也多(图 3B)。表明叶片质外体蛋白粗提物有重
结晶抑制活性。图 3D展示了冷驯化的‘陇油 6号’根
部质外体粗提液中冰晶的生长情况, 表现出了极强
的重结晶抑制活性。
2.4 冷驯化的‘陇油 6号’质外体蛋白取样及质谱鉴定
田间生长的冬油菜‘陇油 6 号’叶片和根部质外
体蛋白的 SDS-PAGE 电泳图(12 月 1 日样品), 对其
中表达量较高的多肽取样进行串联质谱 (MALDI-
TOF-TOF-MS)鉴定, 取样编号如图 4 所示。15个差
异的蛋白质经质谱分析后通过 Mascot检索, 结果见
表 2。这些蛋白按照其生物学功能可分为抗病防御
类(6个)和代谢相关蛋白(9个)2种类型。其中类枯草
菌素蛋白酶(Prl)、黑芥子酶(Myrosinase)、热休克蛋
白(HSPs)、病程相关蛋白(PRs)、β-1,3-葡聚糖酶和类
葡聚糖酶属抗病防御类蛋白, 磷酸甘油酸激酶、甘
油醛-3-磷酸脱氢酶、烯醇化酶、乙醇脱氢酶、异柠
檬酸脱氢酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、过氧化
物酶和谷胱甘肽转移酶属代谢相关蛋白。
2.5 ‘陇油 6 号’质外体中类葡聚糖酶的回收及活性
测试
SDS-PAGE 电泳结果表明低温诱导过程中叶片
质外体类葡聚糖酶(No.11)的表达与温度变化表现出
很好的相关性, 作为质外体中表达量很高的一类蛋
白, 其表现与抗冻蛋白类似, 且 β-1-3-葡聚糖酶已在
冬黑麦中被证明其具有抗冻活性, 是一种抗冻蛋白[26],
所以主要对它进行了回收及抗冻活性测试。实际上
叶片质外体粗提物 SDS-PAGE 凝胶中包含两种分
子量很相近的葡聚糖酶(图 2b 和图 4 的 11 和 12),
而根部只有其中 1 种(图 4 的 11)。在低温诱导的叶
片质外体蛋白中, 这是两种表达量很高的蛋白, 由
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图 3 未冷驯化与冷驯化的田间栽培‘陇油 6 号’叶片和根
质外体粗提物重结晶的抑制效应
Fig. 3 Inhibiting effect of recrystallization for crude extracts from
apoplast of ‘Longyou 6’ roots and leaves with cold-acclimation
and no-cold-acclimation in the field experiment
A: 未冷驯化的叶片质外体粗提液在7 ℃恒温 50 min后的
冰晶生长情况; B: 冷驯化的叶片质外体粗提液在7 ℃恒温 50 min
后的冰晶生长情况, 表现出较强的重结晶抑制活性; C: 未冷驯
化的根部质外体粗提液在7 ℃恒温 50 min 后的冰晶生长情况;
D: 冷驯化的根部质外体粗提液在7 ℃恒温 50 min后的冰晶生
长情况, 表现出极强的重结晶抑制活性。未冷驯化样品为 10月 5
日(温度为 19 /7℃ ℃)采集, 冷驯化的叶片和根为 11月 15日(温
度为 12 /1 ℃ ℃)采集。上述均在在 10×物镜下观察。A: ice crystal
growth of crude extract from apoplast of ‘Longyou 6’ leaves with
no-cold-acclimation after 50 min at 7 ; B℃ : ice crystal growth of
crude extract from apoplast of ‘Longyou 6’ leaves with
cold-acclimation after 50 min in 7 , and it showed a greater ℃
recrystallization inhibition activity. C: ice crystal growth of crude
extract from apoplast of ‘Longyou 6’ roots with no-cold-
acclimation after 50 min in 7 ; D℃ : ice crystal growth of crude
extract from apoplast of ‘Longyou 6’ roots with cold-acclimation
after 50 min in 7 , and it showed a strong recrystallization ℃
inhibition activity. Samples of no-cold-acclimation were collected
on October 5 at 19 /7 ℃ ℃, and samples of cold-acclimation were
collected on November 15 at 12 /1 ℃ ℃. All figures were observed
under 10× object lens.

于在电泳胶上这两条带距离很近, 回收时并没有将
两者完全分离。对回收产物进行纯度检测显示(图 5),
SDS-PAGE 胶上为谱带较宽的一条带, 表明可能包
含了两种类葡聚糖酶。回收产物抗冻活性测试表明,
类葡聚糖酶具有冰晶形态修饰效应, 冰晶生长呈六
边形状(图 6), 是一种低活性抗冻蛋白, 但尚未明确
两种类葡聚糖酶中的哪一种有抗冻活性或是都具有
抗冻活性。
3 讨论
3.1 冬油菜在低温胁迫下合成分泌抗冻蛋白
本研究初步证实了冬油菜叶片和根的质外体在
冷驯化过程中积累蛋白质。对冷驯化的‘陇油 6 号’
的叶和根质外体粗提物的抗冻活性检测表明, 叶片
和根质外体粗提物具有明显的冰晶形态修饰效应和

图 4 冷驯化的田间栽培‘陇油 6 号’叶片和根(12 月 1 日取
样, 温度为 5 ℃/6 ℃)质外体蛋白质谱鉴定取样编号图
Fig. 4 Numbers of mass spectrometric identification of apoplast
proteins in ‘Longyou 6’ roots and leaves with cold-acclimation
(sampled on Dec. 1 at 5 ℃/6 ℃) in the field experiment
重结晶抑制效应, 表明冷驯化后其质外体粗提物中
存在抗冻蛋白。强抗寒性冬油菜在越冬期间, 经过
低温短日照驯化后, 某种避免细胞结冰的机制被激
活, 使得强抗寒性冬油菜根细胞能在冰点下低温中
保持非冰冻状态, 从而避免了胞内结冰带来的致死
性损伤, 利于安全越冬, 而抗冻蛋白可能在这个过
程中发挥了重要作用。因为冬油菜质外体中产生抗
冻蛋白, 抗冻蛋白能通过修饰冰晶形态和抑制冰的
重结晶, 将冰晶的形成控制在质外体中, 调节了细
胞的过冷却态, 同时还避免了大冰晶对细胞的机械
损伤。
3.2 冷驯化的‘陇油 6号’质外体蛋白功能的探讨
通过质谱检测到的蛋白按照其生物学功能可分
为抗病防御类(6个)和代谢相关蛋白(9个) 2种类型。
3.2.1 抗病防御类蛋白
类枯草菌素蛋白酶(Prl)能降解昆虫体壁, 是昆
虫病原真菌侵染宿主时产生的一种毒力因子[16]。黑
芥子酶(Myrosinase)主要作为硫苷黑芥子酶系统的
重要组分发挥作用, 其最重要的功能就是介导植物
与其他生物环境之间的相互作用, 从而影响植物自
第 2期 杨 刚等: 白菜型冬油菜质外体抗冻蛋白研究 215


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表 2 冷驯化的田间栽培‘陇油 6 号’叶片和根(12 月 1 日取样, 温度为 5 /℃ 6 ℃)质外体蛋白质谱鉴定结果
Table 2 Mass spectrometry results of apoplast proteins in‘Longyou 6’ roots and leaves with cold-acclimation (sampled on Dec. 1
at 5 ℃/6 ℃) in the field experiment
蛋白编号
Spot no.
NCBI登录号
NCBI
accession No.
蛋白名称
Protein name
有机体名称
Organism
分值
Score
序列覆盖度
Sequence
coverage (%)
1 gi|757534 类枯草菌素蛋白酶 Subtilisin-like protease Arabidopsis thaliana 146 3
2 gi|166919370 叶绿体热休克蛋白 70-1
Chloroplast heat shock protein 70-1
Ipomoea nil 291 6
3 gi|11034734 黑芥子酶 Myrosinase Raphanus sativus 98 6
4 gi|34597330 烯醇化酶 Enolase Brassica rapa subsp. 466 14
5 gi|32967699 S-腺苷-L-同半胱氨酸水解酶
S-adenosyl-L-homocystein hydrolase
Arabidopsis thaliana 290 29
6 gi|15218869 异柠檬酸脱氢酶 Isocitrate dehydrogenase Arabidopsis thaliana 181 6
7 gi|330414748 乙醇脱氢酶 Alcohol dehydrogenase Brassica rapa 491 18
8 gi|15219412 磷酸甘油酸激酶 Phosphoglycerate kinase Arabidopsis thaliana 361 8
9 gi|120675 3-磷酸甘油醛脱氢酶
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
Sinapis alba 433 34
10 gi|120675 3-磷酸甘油醛脱氢酶
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
Sinapis alba 332 32
11 gi|118763538 基本葡聚糖酶 Basic glucanase Brassica juncea 315 53
12 gi|62361691 β-1,3-葡聚糖酶 Beta-1,3-glucanase Brassica rapa subsp. 348 48
13 gi|464365 过氧化物酶 7 Peroxidase 7 Brassica rapa subsp. 86 27
14 gi|2462929 谷胱甘肽转移酶 Glutathione transferase Arabidopsis thaliana 161 44
15 gi|722274 病程相关蛋白 1 Pathogenesis-related protein-1 Brassica juncea 78 41


图 5 ‘陇油 6 号’质外体中类葡聚糖酶回收后的
SDS-PAGE 检测
Fig. 5 SDS-PAGE detection of class glucanase reclaimed
from apoplast of ‘Longyou 6’
身防御[1718]。热休克蛋白(HSPs)受逆境(高低温、干
旱等)诱导表达, 在细胞内还具有抗氧化及“分子伴
侣”功能[19]。病程相关蛋白(PRs)是植物体内的一类
蛋白, 受病原体或其他许多外界因子诱导表达, 在
植物响应外界压力、抵御疾病方面扮演重要角色 ,
葡聚糖酶(PR-2)就是其中之一。β-1,3-葡聚糖酶的表
达不仅与病原菌侵染有关, 还与其他非生物诱导等
诸多因素有关。PR-1也是 PR蛋白中重要的一族, 但
其在植物中的功能仍不清楚[2021]。

图 6 回收后的‘陇油 6 号’质外体中类葡聚糖酶的重结晶
抑制效应的观察
Fig.6 Observation of recrystallization inhibition of class
glucanase reclaimed from apoplast of ‘Longyou 6’
A: 质外体蛋白溶解液在7 ℃恒温 50 min后的冰晶生长情
况; B: 回收的类葡聚糖酶在7 ℃恒温 50 min后的冰晶生长情况,
表现出较强的重结晶抑制活性。A: ice crystal growth of apoplast
protein dissolved liquid at 7 ℃ for 50 min; B: ice crystal growth
of reclaimed class glucanase at 7 ℃ for 50 min, and it showed a
greater recrystallization inhibition activity.

3.2.2 代谢相关蛋白
磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和烯醇
化酶是糖酵解过程中的重要酶类。但在低温胁迫中
的功能尚未见报道。乙醇脱氢酶是植物非正常呼吸
链的重要水解酶之一, 对乙醇代谢具有显著的调控
作用, 与植物体内活性氧的清除、脂类过氧化的保
护相关[21]。异柠檬酸脱氢酶是三羧酸循环途径中的
调控酶。但近期研究发现它参与多种逆境胁迫的应答
过程, 在植物抗氧化胁迫中起着比较重要的作用[22]。
216 中国生态农业学报 2016 第 24卷


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S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(SAHH)主要参与细胞
代谢中的甲基化作用, 在细胞的脂类代谢中起着重
要的调节作用, 一些研究表明 SAHH 在低温下可能
通过调节膜脂的成分来提高对低温胁迫的耐受性[23]。
过氧化物酶(POD)是植物在逆境条件下抗氧化酶系
统的关键酶之一[24]。谷胱甘肽转移酶(GST)在植物的
初级代谢、次级代谢和细胞信号转导过程中发生作用,
从而影响植物的生长和发育, 受逆境诱导表达[25]。
3.3 冷驯化的‘陇油 6 号’叶片质外体中的类葡聚糖
酶可能是一种抗冻蛋白
通过变性 SDS-PAGE 凝胶电泳直接分离质外体
中的抗冻蛋白, 结合 MALDI-TOF/TOF 质谱鉴定及
重结晶效应的显微观察, 发现从 SDS-PAGE 凝胶回
收的类葡聚糖酶具有一定的重结晶抑制活性, 表明
冷驯化的‘陇油 6 号’叶片质外体类葡聚糖酶可能是
一种活性较弱的抗冻蛋白, 与冬黑麦中发现的抗冻
多肽类似。虽然尚不明确两种类葡聚糖酶中的哪一
种有抗冻活性或者都具有抗冻活性。但我们认为
No.11 应是抗冻蛋白, 因为其在冷驯化过程中表达
量显著增强, 而在脱锻炼后表达量显著降低, 其功
能还需要进一步的论证。
3.4 强抗寒性冬油菜中可能存在多种未知的抗冻
蛋白
冬黑麦的质外体中曾发现存在多种活性的抗冻
蛋白, 强抗冻植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)
中也发现存在不止一种抗冻蛋白 [5,26]。本研究中 ,
SDS-PAGE 凝胶电泳表明, 冬油菜质外体中存在的
蛋白质种类也比较丰富, 特别是在根中, 且根部的
质外体粗提物重结晶抑制活性极强, 所以推测强抗
寒冬油菜中也可能存在多种不同的抗冻蛋白。这需
要对根部的质外体蛋白进行分离纯化, 并对每一种
蛋白进行单独研究等更深入的试验论证。从对低温
诱导的冬油菜质外体蛋白质谱鉴定结果分析, 一些
蛋白的定位不是很明确, 某些表达量低的蛋白是否
是由于低温或其他因素所导致细胞膜损伤引起的胞
内蛋白泄露, 需要进一步的论证。从现有的资料未
见这些蛋白存在于质外体空间的报道, 如异柠檬酸
脱氢酶、乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶等。从
已有资料分析, 虽然许多蛋白与冷胁迫有一定关系,
但无法判定哪些蛋白为抗冻蛋白。某些蛋白在细胞
中的定位已很明确, 仅存在于质外体中, 且在低温
诱导过程中表达量上升, 故这些蛋白必定和冷胁迫
相关, 如葡聚糖酶等病程相关蛋白。这些冷诱导的
质外体蛋白在叶片和根中均有分布, 只是表达量不
同。此外, 许多研究证明质外体中的抗冻蛋白常常
是一种双功能蛋白[26], 冬油菜中的抗冻蛋白是否也
是这种情况, 仍需要进一步研究。
4 结论
本研究发现在冷驯化过程中, ‘陇油 6号’叶片的
质外体中出现明显的蛋白质积累 , 室温恢复生长
10 d 后 , 质外体中的蛋白质含量显著降低, 可见冷
驯化的‘陇油 6号’质外体蛋白属低温诱导蛋白。通过
冰晶重结晶的显微观察法对白菜型冬油菜叶片和根
的质外体粗提物的抗冻活性进行了检测, 利用 SDS-
PAGE 分离质外体蛋白并结合 MALDI-TOF/TOF 质
谱技术对部分高表达蛋白进行了鉴定。发现冷驯化
的白菜型冬油菜质外体粗提物有明显的重结晶抑制
活性, 证明了冷驯化的冬油菜叶片和根的质外体中
存在抗冻蛋白。其中类葡聚糖酶与冬黑麦中报道的
抗冻蛋白一致。对此类葡聚糖酶回收及抗冻活性测
试发现其具有较弱的重结晶抑制活性, 表明此类葡
聚糖酶是一种低活性抗冻蛋白。推测冬季强抗寒性
白菜型冬油菜质外体中可能存在多种未被发现的抗
冻蛋白。
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