全 文 ：#综述 #
修订适合中药体外致突变性检验的 Ames检测体系思路
金建玲* , 刘 波,高培基*
(山东大学生命科学学院 微生物技术国家重点实验室,山东 济南 250100)
摘 要: Ames 测验是遗传毒理实验(致畸致癌致突变)的初筛方法, 是食品药品安全性检验中心的必检项目之一。
结合部分中药体外致突变性( Ames 检测)结果的混乱情况, 提出修订现行 Ames 检测体系的必要性和紧迫性。通
过对生物类样品中因含有组氨酸成分对 Ames 测验结果的影响作用(易产生假阳性)进行深入分析, 并对目前国际
上相关的 Ames 检测的修订方法进行综述和比较, 指出了目前国内外尚没有适合中药致突变性检验的修订体系。
在此基础上,提出了几条修订常规的 Ames 测验以适合中药体外致突变性检验的思路,以期引起应有的重视。
关键词: Ames 检测;致突变性; 中药;修订
中图分类号: R2851 53 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 07-1155-03
Thinking of revising Ames system suited to in vitro mutagenicity test for Chinese materia medica
JIN Jian- ling , LIU Bo , GAO Pe-i ji
( State Key Labo rato ry o f M icr obial T echnolog y, Schoo l o f Life Sciences, Shandong Univ eristy , Jinan 250100, China)
Key words: Ames test ; mutagenicity; Chinese mater ia medica ( CMM ) ; revision
Ames 检测是国际上食品、药品及其他相关产品获得生
产许可证之前必须进行的安全性检测项目之一,通常作为遗
传毒理实验(致畸致癌致突变)的初筛方法[ 1~ 3]。目前我国
的国家标准采用 2003 年修订版本( GB 15193-94. 2003)。
Ames 检测是利用鼠伤寒沙门氏菌 S almonell a ty phy-
mur ium 的组氨酸( histidine)营养缺陷型突变株( his- )发生
回复突变的性质,对化学物质致突变性进行初步筛选的短期
体外实验方法。实验体系采用 4 株组氨酸缺陷的沙门氏菌
作实验菌株,组氨酸缺陷系由碱基置换和不同类型的移码突
变造成。另外,引入的深度粗糙突变型 ( rfa) 有利于待测物
能够更好地进入细菌细胞, 引入 DNA 损伤修复缺陷型
( uvrB)有利于更加灵敏的检出待测物的致突变性。Ames
试验的常规方法有斑点试验和平板掺入试验。平板掺入试
验可定量测试样品致突变性的强弱。此法较斑点试验敏感。
平板掺入试验的流程主要包括:一定量的组氨酸缺陷型细胞
均匀分布在组氨酸限量的选择平板上,其中加入的组氨酸量
可保持涂布细胞有限次的细胞分裂 ( 1~ 2 次) ,在此过程中,
细菌细胞可发生自发或诱发突变成为原养型回复子, 从而能
够在选择平板上形成肉眼可见的回复子菌落,若添加待测物
的实验组的回复子菌落数相比于阴性对照组高出 2 倍或以
上,而且回复子菌落数与待测物浓度有剂量依赖关系, 据此
可以判定待测物 Ames 检测阳性,即意味着具有潜在的致癌
致畸的可能性[4]。
1 Ames检测的影响因素
Ames 检测最重要的影响因素是检测体系中的组氨酸
及其前体物(如多肽,蛋白质等)的量[ 5~ 8]。因为它们可以支
持 his- 缺陷型细胞生长和分裂, 增加最终回复子菌落数, 从
而造成假阳性。因此, 现行的 Ames 检测体系不适合含组氨
酸成分样品的致突变性检验。如食品、某些化妆品、中药水
提物等。
2 Ames 检测的修订
国外文献报道的修订方法[ 9~ 17]主要分为两类。第一类:
通过对样品预处理,如通过萃取、色谱等技术, 去除组氨酸及
其相关物, 仅保留有效成分[ 10]。由于预处理可能造成中药的
某些有效成分丢失,预处理后中药样品的致突变性不能很好
的代表原始中药的致突变性。因此, 此法不适合中药致突变
性检测。第二类[11, 14, 15] : 利用其他菌株(如大肠杆菌、夏威夷
弧菌等)和其他突变(如抗性突变等) ,避开组氨酸等成分对最
终实验结果的影响。此类方法因为缺少国际性的标准操作指
南,各实验室间的实验结果缺乏可比性,不适合世界范围内推
广使用。因此,修订 Ames检测体系, 建立一套可以适合中药
致突变性检验的方法,有理论和实践双重意义。
3 Ames 检测体系及国家标准急需修订以适合中药致突变
性检验
表 1 列举了部分文献报道的经 Ames 检 测的中
药[ 18~ 40]。从结果中可以看出部分中药 Ames 测验结果相当
紊乱, 且与哺乳动物骨髓细胞染色体畸变 (或红细胞微核实
验)及精子实验的结果的符合度也远低于化学物质(纯合物)
#1155#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40卷第 7期 2009 年 7 月
* 收稿日期: 2009- 01-17
* 通讯作者 金建玲( 1965 ) ) ,女,副教授,博士。研究方向为微生物遗传学、医学微生物学、中西药结合及细菌抗药性等。目前的研究工作集中在新型抗真菌抗生素的开发及中药致突变性检验等。
Fax : ( 0531) 88565610 T el : ( 0531) 88369495 E-mail: jinj ianl ing@ sdu. edu. cn
表 1 部分经 Ames检测的中药
Table 1 Some Chinese materia medica
tested by Ames method
中药 Ames
染色体畸变
或微核实验 精子实验
黄芪 + 殷学军( 1989) + 张春颖( 2001)
- 赵泽贞( 1991) - 龚太平( 1998)
- 刘明哲( 1992)
槐花 + 殷学军( 1989) + 殷学军( 1989)
+ 张春颖( 2001)
+ 董伟华( 1991)
红花 + 渡到富士雄( 1983) + 董伟华( 1991)
- 殷学军( 1989) + 殷学军( 1989)
- 苗明三( 2002) + 苗明三( 2002)
灵芝 + 张建清( 1999) - 肖志勇( 2006) - 肖志勇( 2006)
- 肖志勇( 2006) - 陈新霞( 1996) - 陈新霞( 1996)
- 陈新霞( 1996)
冬虫夏草 + 张建清( 1999) - 马继霞( 1995) - 马继霞( 1995)
- 刘明哲( 1992) - 孔祥环( 1995) - 孔祥环( 1995)
- 孔祥环( 1995) - 金少华( 1997) - 金少华( 1997)
- 金少华( 1997)
马兜铃酸 + 郭晓昕( 2005) + 郭晓昕( 2005)
+ 谢大英( 1987) + 谢大英( 1987)
+ 苗明三( 2002)
马兜铃 - 陆华 ( 2007) + 陆华( 2007)
银杏水提物 - 张卫明( 2005) - 张卫明( 2005) - 张卫明( 2005)
- 陈世伟( 1999) - 陈世伟( 1999) - 陈世伟(孕鼠 1999)
银杏醇提物 + 吴金龙( 1996) - 吴金龙( 1996)
- 陈世伟( 1999) - 陈世伟( 1999)
Ames 检测阳性与致畸致癌阳性符合率大于 90% 的水平。
原因在于: 不经修订的 Ames 检测, 往往因为中药中含组氨
酸成分而导致假阳性结果,如灵芝和冬虫夏草。因此, 如何
排除中药药液(尤其是水提物 )中组氨酸等成分对实验结果
的影响, 排除假阳性结果的出现,提高 Ames 检测的结果与
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变实验(或红细胞微核实验)和
精子实验检测结果,及致癌性检测结果之间的符合度, 是遗
传毒理检验中迫切需要解决的问题。
4 适合中药致突变性检验的 Ames 检测体系的修订思路
由于采用其他微生物和其他突变检测待测物的致突变
性没有在国际上被广泛接受和推广使用,因此本文将依据遗
传学和遗传毒理学原理, 提出几条适合中药致突性检验的
Ames 检测体系的修订思路。
4. 1 通过改变阴性对照体系, 排除待测样品中组氨酸对
Ames测验结果的影响: 经典的 Ames 检测体系中根据实验
组与阴性对照组回复子菌落数之比是否大于等于 2 来判定
Ames检测是否为阳性。含中药的实验组中最终出现的回复
子包含 3 个来源:其一, 出发细胞利用检测培养基内限量的
组氨酸进行生长和细胞分裂,此过程中细胞所发生的自发回
复由突变所致;其二, 因为引入中药组分而导致测验体系中
组氨酸量增加,从而增加了出发细胞发生细胞分裂的次数,
进而增加因自发突变产生的回复子数目; 其三,由于待测物
的诱变作用所致。不难看出,第一种来源的回复子数, 就是
常规 Ames 检测中阴性对照组的回复子数。如果不对 Ames
检测体系加以修订, 第二种来源的回复子将不被区别地与第
三种来源的回复子混为一谈, 都被误认为是中药诱变作用所
致, 因此易出现假阳性结果。
若在常规的阴性对照中加入一定量的组氨酸 ,这些组氨
酸对应于不同浓度的中药中所含的组氨酸量, 则经修订后
Ames 检测的阴性对照就包含第一种和第二种来源的回复
子, 就可以排除因中药中组氨酸成分造成的假阳性结果, 提
高 Ames 检测结果与致畸致癌检测结果的符合度。
4. 2 将常规 Ames 检测用的组氨酸限量的培养基改为组氨
酸过量的培养基: 不同样品不同浓度引入测试体系的少量组
氨酸对最终的实验结果的影响微乎其微 ,而被忽略不计。如
此, Ames 检测体系中的超量组氨酸将掩盖样品中少量组氨
酸对最终结果的影响。
4. 3 以回复突变频率为检测指标: 利用 Ames 检测的菌株,
以回复突变频率取代回复子绝对数量作为检测指标,可以避
免样品中组氨酸对最终结果的影响。回复突变频率为回复
子细胞数与存活细胞总数的比值。样品中存在组氨酸,不仅
回复子细胞的数目增加,细胞总数同时也增加, 因此若样品
无致突变性则回复突变频率不会改变。
5 结语
国内外现有的 Ames 检测体系的修订方法都不适合中
药致突变性检验, 我国现行的国家标准会导致假阳性出现。
目前在各个具有国家认证的检验资质的遗传毒理实验室中,
对某些食品、化妆品、保健品等, 对于可能因含有组氨酸成分
而导致假阳性结果的样品, 其致突变性检验往往只采用小鼠
实验或红细胞实验而避开 Ames 检测。因为体外致突变性
检验所具有的无法替代的简便性, 说明建立适合中药体外致
突变性检验的 Ames 检测体系, 并对现有的国家标准进行修
订, 具有重要意义和迫切性。
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冬虫夏草化学成分研究进展
王 征,刘建利*
(西北大学生命科学院 西部资源生物与现代生物技术省部共建教育部重点实验室,陕西 西安 710069)
摘 要:冬虫夏草是我国的名贵中药材, 是冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫的子座及幼虫尸体的复合体。含
有氨基酸、核苷、多糖、甾醇及甘露醇等多种活性成分, 另外还含有脂肪酸、挥发油以及无机元素等多种成分。对近
年来国内外关于冬虫夏草化学成分的研究进行综述。
关键词:冬虫夏草; 冬虫夏草菌;活性成分
中图分类号: R2841 1 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 07-1157-04
Advances in studies on chemical constituents of Cordycep s
WANG Zheng, LIU Jian- li
( Key Labo rato ry o f Resource Biolog y and Biotechno lo gy in Western China, M inistr y o f Educat ion, Schoo l of L ife Science,
Nor thw est Univer sity, Xican 710069, China)
Key words: Cordy cep s; Cor dy cep s sinensi s ( Berk1 ) Sacc1 ; act iv e constituent
#1157#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40卷第 7期 2009 年 7 月
* 收稿日期: 2008- 12-12 基金项目:国家自然科学基金( 30070905, 20872118) ;陕西省重点实验室基金资助( 08JZ74)作者简介:王 征( 1986 ) ) ,男,陕西咸阳人,硕士, 现从事天然产物的仿生合成及结构修饰研究。
T el : (029) 88302013 E-mail: w azh0405@ 126. com