全 文 ：的限速酶,且 HSL 过表达抑制了甘油三酯在脂肪
细胞中的堆积。本研究发现, 决明子提取物能上调
脂肪组织 HSL 和 TGH 的转录表达, 1 h 达到显著
水平 (P < 01 01) ,这一结果与人类及啮齿类动物肥
胖个体中 HSL 表达量下降的结论相一致[ 10] , 说明
TGH 与 HSL 相同, 其表达量高低与个体肥胖程度
存在着相关性。用决明子提取物处理后的肌肉组
织, TGH 和 HSL 的表达量总体呈下降趋势, 且
HSL 的趋势更显著, 这与先前的研究相一致[ 11] ,
HSL基因 mRNA 的表达量与哈萨克羊肌内脂肪量
呈负相关,同样说明决明子提取物处理高血脂模型
小鼠能增加其肌内脂肪的量。
本实验主要针对决明子提取物对高血脂小鼠的
血脂和聚脂基因的影响展开的研究,结果证实决明
子提取物在调血脂和调节聚脂基因表达上的确发挥
着重要的作用。然而决明子提取物本身富含多种有
效成分,是功能多样的一种中药, 其作用机制、作用
途径也并非单一,这就造成了决明子研究的复杂性,
因此对其调脂有效成分的研究有待进一步深入。
参考文献:
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肾康注射液对慢性马兜铃酸肾病模型大鼠肾间质纤维化的拮抗作用
乔颖进1, 2 ,谌贻璞1* ,芮宏亮1 ,董鸿瑞1 ,刘章锁2
( 11 卫生部中日友好医院 肾病中心,北京 100029; 21 郑州大学第一附属医院 肾病风湿科, 河南 郑州 450052)
摘 要:目的 研究肾康注射液对慢性马兜铃酸肾病 ( CAAN) 模型大鼠肾间质纤维化的拮抗效应。方法 雄性
SD 大鼠随机分为对照组、模型组和干预组,每组 6 只。于 0、1、4、8、12 周末分别检测体质量、尿糖、24 h 尿蛋白定
量和肌酐清除率 (Ccr) ;第 12 周末处死大鼠留取肾组织,行 Masson 染色观察肾间质纤维化程度;并用逆转录实时
定量聚合酶链反应和免疫组织化学方法检测肾组织中转化生长因子2B1 ( TGF2B1 )、结缔组织生长因子 (CTGF)、纤
溶酶原激活物抑制物21 ( PAI21)、金属蛋白酶组织抑制物21 ( TIMP21) 和Ñ型胶原 ( Col I) mRNA 及蛋白表达。结
果 与对照组比较,模型组和干预组大鼠体质量明显减轻 ( P< 01 01) ,但干预组大鼠体质量明显高于模型组, 12 周
末时存在显著差异 (P < 01 05)。与对照组相比,模型组大鼠 24 h 尿蛋白定量显著上升 ( P< 01 01) , Ccr 显著下降
( P< 01 01) ; 12 周时肾间质纤维化面积显著增加 ( P< 01 01) ;肾组织内上述各检测指标的 mRNA 及蛋白表达均显
著上调 ( P< 01 01)。与模型组相比,干预组大鼠各时间点 Ccr 均显著升高 ( P< 01 01) ;第 12 周时 24 h 尿蛋白定量
及肾间质纤维化面积均显著降低 (P < 01 05、01 01) ;上述高表达的 mRNA 及蛋白指标均被显著抑制 ( P< 01 05)。
结论 肾康注射液可能通过抑制肾组织促细胞外基质 ( ECM) 合成因子 ( T FG2B1、CTGF) 及抗 ECM 降解因子
( TIMP21、PAI21) 生成, 而改善 CAAN 的肾间质纤维化及肾功能。
#587#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
* 收稿日期: 2008207209 基金项目:卫生部属 (管) 医疗机构临床学科重点项目作者简介:乔颖进( 1982 ) ) ,女,河南洛阳人,肾病专业硕士生,研究方向为慢性肾衰竭的防治。
T el : ( 0371) 66862202 E2mail: ab bie0616@sina. com
* 通讯作者 谌贻璞 T el: ( 010) 84206174 E2mail: Chen yipu@medmail. com. cn
关键词:肾康注射液; 马兜铃酸; 肾间质纤维化; 转化生长因子2B1
中图分类号: R2851 5 文献标识码: A 文章编号: 025322670( 2009)0420587206
Antagonizing effects of Shenkang Injection on renal interstitial fibrosis in model rat
of chronic aristolochic acid nephropathy
QIAO Ying2jin1, 2 , CHEN Yi2pu1 , RUI Hong2liang1 , DONG Hong2rui1 , LIU Zhang2suo2
( 11 Centre of Nephrology, China2 Japan F riendship H ospital, Beijing 100029, China; 2. Department of Nephrology
and Rheumatology, The First Affiliated H ospital of Zhengzhou U niversit y, Zhengzhou 450052, China)
Abstr act: Objective To study the antagonizing effects of Shenkang Inject ion ( SKI) on renal inter st i2
t ial fibr osis in model rats with chr onic aristolochic acid nephropathy ( CAAN) . Methods Eighteen male
SD rats were equal ly divided into the following thr ee groups: control gr oup, model gruop, and intervent ion
group. Body weight , urinar y glucose, 24 h urinary protein excret ion, and creat inine clearance (Ccr) were
measured at the end of 0, 1, 4, 8, and 12 week, respect ively. At the end of the 12 week, all the rats were
sacr ificed and the renal pathological examination of each rat was performed. The mRNA and protein ex2
pression of t ransforming growth factor2B1( TGF2B1 ) , connect ive t issue growth factor (CTGF) , plasmino2
gen act ivator inhibitor21 ( PAI21) , tissue inhibitor of metalloproteinase21 (T IMP21) , and type I collagen
(Col I) in kidney t issue were determined by real2t ime (RT)2PCR and immunohistochemistry staining, re2
spectively. Results Compared with control group, body weight of rats in intervent ion group and interven2
t ion group wer e significant ly decr eased (P < 01 01) ; body weight of rats in inter vent ion group was higher
than that in inter vent ion group, with a significant difference at the end of 12 week (P< 01 05) . Compar ed
with contr ol group, the 24 h ur inary protein excret ion of r ats in model gr oup and intervention gr oup in2
creased significant ly (P< 01 01) ; but the 24 h urinary protein excr et ion of r ats in intervent ion group was
lower than that in model group (P < 01 05) . Compar ed with control group, the Ccr of model rats decreased
significant ly (P< 01 01) ; the Ccr of rats in intervention group was significant ly higher than that in model
group (P < 01 01) . Compared with control group, the relative ar ea of interst it ial fibrosis of kidney tissue,
in model rats was significantly enlar ged (P < 01 01) . The mRNA and protein expression of TGF2B1 , CT2
GF, PAI21, T IMP21, Col I in kidney t issue was significant ly up2regulated ( P < 01 01) in the model r ats.
Compar ed with the control group. T he increased mRNA and protein expression of TGF2B, CTGF, PAI21,
TIMP21, Col I were all significant ly down2regulated in intervent ion group ( P < 01 05) . Conclusion SKI
could inhibit the product ion of promoting extracellular matrix (ECM) synthesis factors ( TGF2B1 and CT2
GF) and antagonizing ECM degradat ion factors ( TIMP21 and PAI21) in kidney t issue, which might be the
mechanism that SKI alleviates the renal interst it ial fibrosis and improves the renal funct ion in CAAN r ats.
Key words: Shenkang Inject ion; aristolochic acid; renal interst it ial fibrosis. ; t ransforming growth fac2
tor2B1( TGF2B1)
近年来, 服用含马兜铃酸 ( ar istolochic acid,
AA) 中药引起的慢性马兜铃酸肾病 ( chronic aris2
tolochic acid nephropathy, CAAN) 已日益受到重
视。该病临床以慢性进行性肾衰竭、病理以寡细胞
性肾间质纤维化为主要特点, 至今尚无成熟治疗方
案[ 1]。本课题组通过细胞生物学实验证实,由丹参、
红花、大黄、黄芪组成肾康注射液能拮抗 AA 引起
的人近端肾小管上皮细胞的促纤维化效应[ 2]。本研
究在上述工作基础上, 进一步采用肾康注射液对本
课题组建立的 CAAN 模型大鼠[ 3]进行治疗, 观察疗
效并初步探讨其作用机制。
1 材料与方法
11 1 实验动物: 18 只雄性 SD 大鼠, 8 周龄, 体质量
200 g 左右,为 SPF 级动物,北京维通利华实验动物
技术有限公司提供。
11 2 药品:关木通浸膏水溶液制备方法同文献方
法[ 3 ] ,经高效液相色谱法检测关木通浸膏中含马兜
铃酸 61 17 mg/ g。肾康注射液由丹参、红花、大黄、
黄芪组成, 由西安嘉惠药业有限公司提供, 批号
200611013, 规格 20 mL/支,含生药 01 3 g/ mL。
11 3 主要试剂:总 RNA 提取试剂盒 (上海生工公
司) ;莫洛尼鼠白血病病毒 ( M2MLV) 反转录酶、
Taq DNA 聚合酶、RNA 酶抑制剂 (华美生物工程
公司) ;实时定量聚合酶链反应母液 (东洋纺生物科
技公司) ; PCR 引物 (上海生工公司,见表 1)。免疫
组织化学染色试剂: EnVisionTM 加强型试剂盒
#588# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
(DAKO,丹麦) , SP9003 试剂盒 (北京中杉金桥公
司,供 SLAB染色用)。
表 1 PCR 引物序列
Table 1 Sequense of PCR Pr imer
引物名称 引物序列 产物长度/ bp
Col I 正向 5c2CTCAGGGGCGAAGGCAACAGT23c 125
反向 5c2ATGGGCAGGCGGGAGGTCT23c
TGF2B1 正向 5c2CGGCAGCTGTACATTGACTTT23c 154
反向 5c2TGTGTTGGTTGTAGAGGGCAA23c
CTGF 正向 5c2ATCCCTGCGACCCACACAAG23c 145
反向 5c2CAACTGCTTTGGAAGGACTGCG23c
TIMP21 正向 5c2GACCTGGTT ATAAGGGCTAAA23c 216
反向 5c2GCCCGT GATGAGAAACT CTTCACT23c
PAI21 正向 5c2ATGAGATCAGTACTGCGGACGCCATCTTTG23c 343
反向 5c2GCACGGAGATGGTGCTACCATCAGACTTGT23c
GAPDH 正向 5c2TGGGTGTGAACCACGAGAA23c 145
反向 5c2GGCAT GGACTGTGGTCATGA23c
11 4 实验分组和给药:大鼠随机分为 3 组, 每组大
鼠 6只。对照组用实验动物饮用水每日清晨 ig, 生
理盐水 11 67 mL/ kg 每日下午 ip;模型组造模方法
同文献方法[ 3] ;干预组在模型组基础上,再予肾康注
射液 11 67 mL/ kg (相当于生药 5 g/ kg) 每日下午
ip给药, 共 12周。
11 5 标本留取及生化指标测定:全部大鼠于实验第
0、1、4、8、12周末测量体质量、血肌酐 ( Scr) 和尿肌
酐 ( Ucr ) (苦味酸法, 日立 7170A 自动生化仪测
定) , 肌酐清除率 (Ccr) 采用 Ccr= Ucr (Lmol/ L) @
每分钟尿量 (mL/ min) / Scr ( Lmol/ L) 计算。24 h
尿蛋白定量 ( Bradford 法) 及尿糖定性 (试纸法)。
第 12周时处死大鼠留取肾组织标本[ 3]。
11 6 肾组织病理检查:肾脏标本常规脱水、包埋、切
片及 Masson 染色后,光学显微镜 ( 100 @) 采集皮
质部分的肾间质图像 (每只大鼠随机采集 10 个视
野,避开肾小球及较大小动脉) , 用 Motic Med 6. 0
数码医学图像分析系统 (北京麦克奥迪图像技术有
限公司) 进行自动测量分析。
肾间质纤维化相对面积= 肾间质绿染面积/视野总面
积@100%
11 7 逆转录及实时定量 PCR 测定:总 RNA 提取
及逆转录反应同文献方法[ 3]。以逆转录所获 cDNA
为模板, SYBR Gr een I 为荧光标记物, 行相对定量
实时 PCR 测定 (美国 ABI 7500 实时 PCR 仪) ,操
作方法同文献方法[ 3]。以 32磷酸甘油醛脱氢酶
(GAPDH) 为内参照,检测转化生长因子2B1 ( TGF2
B1)、结缔组织生长因子 ( CTGF)、纤溶酶原激活物
抑制物21 ( PAI21 )、金属蛋白酶组织抑制物21
(T IMP21) 和Ñ型胶原 (Col I) 的表达。扩增后目
的基因相对表达量= 2- ( Cytokine Ct- GAPDH Ct) @103 ,公式
内 Cytokine 系指 TGF2B1、CTGF、PAI21、T IMP21、
Col I 等目的基因, 循环阈值 Ct ( cycle threshold)
为目的基因 cDNA 达到指数扩增时的循环数。
11 8 免疫组织化学染色:肾组织切片常规处理后,
微波处理 98 e 、10 min ( TGF2B1、CTGF、PAI21、
T IMP21) 或 01 4% 胃蛋白酶消化 37 e 、2 h ( Col
I) 修复抗原, EnVisionTM二步法染色按说明书操
作, SLAB染色操作方法同文献方法[ 3]。对染色片
进行图像采集 ( 200 @) 及测量分析 (方法同 Mas2
son 染色)。
肾小管间质相对阳性面积= 肾小管间质阳性面积/视野
总面积@100%
11 9 统计学处理:全部计量资料均以 x ? s 表示,
组间差异比较均采用单因素方差分析 ( One way
ANOVA) , 各组间两两比较采用最小显著差 ( LSD)
检验,统计分析由 SPSS 151 0 软件完成。
2 结果
21 1 体质量变化:给药后各时间点模型组及干预组
大鼠体质量均显著降低, 与对照组相比有统计学意
义 ( P< 01 01) ,而干预组大鼠体质量高于模型组,第
12周时差异有统计学意义 ( P< 01 05) ,见表 2。
21 2 尿蛋白定量:给药后各时间点模型组及干预组
大鼠尿蛋白定量均显著升高, 与对照组相比有统计
学意义 (P < 01 01) ,而干预组大鼠尿蛋白定量低于
模型组,第 12周时差异有统计学意义 ( P < 01 05) ,
见表 3。
表 2 各组大鼠体质量变化 ( x ? s, n= 6 )
Table 2 Changes of body weight of r ats in groups ( x? s, n= 6 )
组 别 体质量/ g
0 周 1 周 4周 8 周 12 周
对照 2211 6 ? 41 4 2811 9 ? 41 4 4081 8 ? 201 5 51819 ? 401 4 6021 9 ? 431 7
模型 2211 0 ? 71 3 2191 3 ? 151 2* * 2741 9 ? 171 4* * 28813 ? 251 8* * 2471 1 ? 331 2* *
干预 2211 7 ? 21 8 2211 6 ? 71 3* * 2841 1 ? 31 7* * 31313 ? 121 6* * 3091 6 ? 331 9* * #
与对照组比较: * * P < 01 01; 与模型组比较: # P< 01 05
* * P< 01 01 vs cont rol gr ou p; # P < 01 05 vs model gr ou p
#589#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
21 3 尿糖定性:各组大鼠尿糖定性均始为阴性。
21 4 各组 Ccr 变化:给药后各时间点模型组和干
预组大鼠 Ccr 值均显著降低,与对照组相比有统计
学意义 ( P < 01 01) ;干预组大鼠 Ccr 值高于模型
组,差异有统计学意义 (P < 01 01) ,见表 4。
21 5 肾组织病理检查: 12周时模型组大鼠肾间质
表 3 各组大鼠 24 h 尿蛋白定量比较 (x ? s, n= 6)
Table 3 Compar ison of 24 h ur inary protein excr etion of r ats in groups (x ? s, n= 6 )
组 别 24 h 尿蛋白/ mg
0 周 1 周 4周 8 周 12 周
对照 51 39 ? 01 53 101 89 ? 01 75 12110 ? 01 79 111 24 ? 01 89 111 59 ? 11 10
模型 51 33 ? 01 50 281 87 ? 51 23* * 29137 ? 71 24* * 341 58 ? 111 68* * 461 54 ? 121 24* *
干预 51 35 ? 01 20 281 69 ? 81 70* * 27197 ? 81 15* * 341 36 ? 81 09* * 331 30 ? 11 44* * #
与对照组比较: * * P < 01 01; 与模型组比较: # P< 01 05
* * P< 01 01 vs cont rol gr ou p; # P < 01 05 vs model gr ou p
表 4 各组大鼠 Ccr 值变化 (x ? s, n= 6 )
Table 4 Ccr Changes value of r ats in groups ( x? s, n= 6 )
组 别 Ccr 值/ ( mL # min
- 1)
0 周 1 周 4周 8 周 12 周
对照 11 08 ? 01 15 11 17 ? 01 12 1117 ? 01 11 11 18 ? 01 13 11 07 ? 01 14
模型 11 08 ? 01 12 01 64 ? 01 19* * 0175 ? 01 11* * 01 55 ? 01 16* * 01 37 ? 01 16* *
干预 11 08 ? 01 10 01 90 ? 01 10* * # # 0189 ? 01 09* * # # 01 83 ? 01 19* * # # 01 62 ? 01 09* # #
与对照组比较: * * P < 01 01; 与模型组比较: # # P< 01 01
* * P< 01 01 vs cont rol gr ou p; # # P< 01 01 vs model group
纤维化相对面积[ ( 141 97 ? 01 85)%] 及干预组肾间
质纤维化相对面积[ ( 61 99 ? 01 89) %] 均高于对照
组[ ( 01 48 ? 01 09)% ] , 差异有统计学意义 ( P <
01 01) ;而干预组大鼠肾间质纤维化相对面积低于模
型组,差异有统计学意义 (P < 01 01) ,见图 1。
图 1 大鼠肾组织间质纤维化表现 ( Masson 染色)
Fig. 1 I nterstitia l fibrosis of kidney in r ats
( Masson stainning)
21 6 肾组织各因子的 mRNA 表达: 12 周时模型组
及干预组 TGF2B1、CTGF、PAI21、TIMP21 及 Col I
的 mRNA 表达均显著升高, 模型组各指标分别上
调了31 81、11 46、31 79、81 15、61 52倍,与对照组相
比有差异显著 (P < 01 01)。干预后上调的指标均显
著下降, 抑制率分别为 46%、12%、37%、22%、
28%,与模型组相比差异显著 (P< 01 05) ,见表 5。
21 7 肾组织各因子的蛋白质表达:对照组大鼠肾组
织中 TGF2B1及 CTGF 主要表达于部分肾小管及肾
小球,血管壁仅微弱表达, 肾间质未见着色; PAI21
主要表达在血管壁和部分肾小管, 肾小球及肾间质
未见着色; T IMP21 主要表达在部分肾小管, 肾小球
仅微弱表达, 肾血管及肾间质未见着色; Col I 仅表
达于肾间质及血管壁外膜,肾小球及肾小管未见着
色。12 周时模型组与干预组肾小管上 TGF2B1、
CTGF、PAI21、T IMP21 表达及肾间质中 Col I 表达
均显著上调, 模型组上述指标分别升高了 21 88、
31 25、21 63、21 70、71 84 倍, 与对照组相比有统计学
意义 (P < 01 01)。干预组上述上调的指标均显著下
降,抑制率分别为31%、23%、34%、36%、60% ,与
模型组相比有统计学意义 (P < 01 05) , 见表 6。
表 5 大鼠肾组织各因子的 mRNA相对表达量 (x ? s, n= 6 )
Table 5 mRNAExpression of all fa ctor s in kidney tissue of r ats ( x? s, n= 6 )
组 别 mRNA 相对表达量
TGF2B1 CTGF PAI21 TIMP21 Col I
对照 71 41 ? 11 28 311 84 ? 61 39 0187 ? 01 35 01 34 ? 01 04 111 20 ? 21 20
模型 281 22 ? 81 70* * 461 40 ? 31 65* * 3130 ? 11 52* * 21 77 ? 01 53* * 731 01 ? 171 95* *
干预 151 15 ? 11 79* * # 401 80 ? 21 00* * # 2107 ? 01 67* * # 21 17 ? 01 29* # 521 63 ? 121 60* * #
与对照组比较: * * P < 01 01; 与模型组比较: # P< 01 05
* * P< 01 01 vs cont rol gr ou p; # P < 01 05 vs model gr ou p
#590# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
表 6 大鼠肾组织各因子的蛋白相对表达量 ( x? s, n= 6 )
Table 6 Protein expression of all factor s in kidney tissue of r ats (x ? s, n= 6 )
组 别 蛋白相对表达量
TGF2B1 CTGF PAI21 TIMP21 Col I
对照 21 17 ? 01 75 31 35 ? 11 23 1133 ? 01 46 11 74 ? 01 58 11 93 ? 01 45
模型 61 26 ? 01 73* * 101 29 ? 11 15* * 3150 ? 01 35* * 41 69 ? 01 90* * 151 14 ? 21 88* *
干预 41 31 ? 01 21* * # 71 88 ? 11 06* * # 2132 ? 01 33* * # 31 00 ? 01 42* * # 91 11 ? 11 70* * #
与对照组比较: * * P < 01 01; 与模型组比较: # P< 01 05
* * P< 01 01 vs cont rol gr ou p; # P < 01 05 vs model gr ou p
3 讨论
含马兜铃酸 ( AA) 的药物可导致肾损害, 其中
CAAN 的主要病理表现为寡细胞性肾间质纤维
化[ 1]。肾间质纤维化的发生、发展与肾间质细胞外
基质 ( ECM) 合成与降解失衡相关[ 4]。TFG2B1及
CTGF 在调控 ECM 合成方面发挥重要作用。
TGF2B1是公认的最重要的致纤维化因子,它具有促
进成纤维细胞的活化和肾小管上皮细胞的转分化,
促进 ECM 合成的作用[ 5]。CTGF 是 TGF2B1的下
游因子,在 TGF2B1诱导下由成纤维细胞等细胞生
成,从而介导 TGF2B1的促 ECM 合成效应[ 4, 6]。在
调控 ECM 降解方面, 纤溶酶、基质金属蛋白酶
(MMP)、PAI21 和 T IMP21 发挥着重要作用, 纤溶
酶能直接降解 ECM 并激活 MMP 从而促进 ECM
降解;而 PAI21 则阻止纤溶酶原激活生成纤溶酶,
同时 TIMP21 能抑制 MMP 活性, 从而发挥抑制
ECM 降解效应[ 4, 6]。另外, TGF2B1 也具有增加
TIMP21 活性及抑制MMP 合成作用, 抑制 ECM 降
解[ 4, 6]。前期体外细胞共培养研究已证实, AA 刺激
HKC活化后分泌的 TGF2B1 ,能直接作用于肾间质
成纤维细胞促其合成 Col I[ 7]。所以, AA 刺激肾小
管上皮细胞分泌的上述促 ECM 合成因子 ( TGF2
B1、CTGF) 及抗 ECM 降解因子 ( PAI21、TIMP21) ,
在体内很可能通过旁分泌途径作用于肾间质成纤维
细胞,增加其 ECM 合成, 并抑制 ECM 降解, 从而
导致肾间质纤维化。本实验中, 12周时模型组大鼠
肾脏 TGF2B1、CTGF、PAI21、T IMP21 和 Col I 的
mRNA 和蛋白相对表达量较对照组均显著上调, 这
很可能是导致 CAAN 肾间质纤维化的重要机制。
CAAN 进展较快, 危害甚大, 常导致不可逆性
终末肾衰竭,目前该病尚无有效治疗方法。中国医
药在抗纤维化治疗上具有广阔前途。肾康注射液是
以化瘀泄浊、扶正固本为组方原则,由大黄、丹参、黄
芪、红花组成的复方中药注射液。研究发现肾康注
射液能明显抑制猪近端肾小管上皮细胞 LLC2PK1
合成细胞外基质成分纤连蛋白 ( FN )、层连蛋白
( LN) 及 Col Ô[ 8~ 10]。在 5/ 6 肾切除大鼠模型, 肾
康注射液可以显著降低大鼠的血压、24 h 尿蛋白定
量、血尿素氮、血肌酐、胆固醇、甘油三酯、低密度脂
蛋白,减轻大鼠的肾脏病理损害,抑制肾组织 TGF2
B1的表达[ 11]。另外,肾康注射液还可以显著抑制肾
小球系膜细胞分泌 FN、LN 及 Col Ô, 并呈量效关
系[ 1 2]。在糖尿病肾病大鼠模型 (单肾切除加链脲
佐菌素注射制作模型) 中,腹腔注射肾康注射液,能
明显抑制大鼠肾小球 FN、LN 及 Col Ô的合成和
分泌[ 13]。
前期细胞生物学实验显示, 肾康注射液能显著
抑制 AA 引起的人近端肾小管上皮细胞对
TGF2B1、CTGF、TIMP21、PAI21 mRNA 及蛋白的
高表达,从而提示肾康注射液可能通过这一机制拮
抗 AA 的促肾间质纤维化效应[ 2]。在细胞实验基
础上,进行了整体水平研究, 以进一步验证上述假
说。本实验结果显示肾康注射液确能显著下调
CAAN 模型大鼠肾组织 TGF2B1、CTGF、PAI21、
T IMP21、Col I mRNA 和蛋白的高表达, 拮抗肾间
质纤维化,改善肾功能,所以这一整体水平研究进一
步验证了细胞水平研究结果。
综合已完成的体内、外实验研究,可以提示肾康
注射液很可能通过下调 TGF2B1、CTGF 高表达而
抑制 ECM 合成,并下调 PAI21 和 TIMP21 高表达
而促进 ECM 降解,从而减轻肾间质 Col I 蓄积,起
到拮抗肾间质纤维化及改善肾功能的作用。
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连翘苷 D和凝血因子 Xa相互作用的分子动力学模拟
金丽媛1, 2 , 张士俊2 ,刘冰妮2 ,徐为人2* ,刘 巍2 ,刘 鹏2 ,汤立达3
( 11 天津医科大学基础医学院, 天津 300070; 21 天津药物研究院 天津市新药设计与发现重点实验室,天津 300193;
31 天津药物研究院 天津药代动力学与药效动力学省部共建国家重点实验室, 天津 300193)
摘 要:目的 阐明连翘苷 D ( FTD) 与凝血因子 Xa ( FXa) 活性位点的动态相互作用过程, 为设计新药提供参考
依据。方法 利用 FXa 蛋白与其原始配体 ( RPR) 的合理复合物结构作参照物,通过对接获得了 FTD 与 FXa 的
复合结构。采用分子动力学方法模拟了两个复合物在水溶液中 500 ps 运动轨迹,考察配体与受体在动态相互作用
过程中的变化过程。结果 RPR 依靠氢键作用与受体 S1 区域和中间部保持稳定的匹配状态, 以非极性的芳香基
与 S4 区域 (T yr99、Phe174、Trp215) 形成了很好的空间匹配。FTD 与受体相互作用方式不同, 与受体的 S1 区域
作用较弱,相对而言与 S4 区域及中间部的作用较强,导致在相互作用的过程中被受体排斥出来。结论 通过配体
与受体动态相互作用模拟研究表明,作为 FXa 的抑制剂与受体 S1 区结合的部分结构应该相对刚性,能与受体形
成较强的氢键,在 S4 区需要一定的疏水性和芳香性,在中间部分需要一定量的氢键来帮助固定配体。
关键词:连翘苷 D; 凝血因子 Xa; 分子动力学; 动态相互作用
中图分类号: R2851 5 文献标识码: A 文章编号: 025322670( 2009)0420592205
Molecular dynamic simulation of interaction between coagulation forsythoside D and factor Xa
JIN Li2yuan1, 2 , ZHANG Shi2jun2 , LIU Bing2ni2 , XU Wei2ren2 ,
LIU Wei2 , LIU Peng2 , TANG Li2da3
( 11College of Basic Medicine, Tianjin Medical U niversit y, T ianjin 300070, China; 2. T ianjin Key Laboratory of Molecular
Design and Drug Discovery, Tianjin Institut e of Pharmaceutical Resear ch, Tianjin 300193, China;
3. Tianjin State Key Laboratory of Pharmcokinetics and Pharmacodynamics,
Tianjin Instit ute of Pharmaceutical Resear ch, Tianjin 300193, China)
Abstr act : Objective To illuminate the dynamic interact ive mode between coagulat ion factor Xa (FXa)
act ive site and forsythoside D ( FTD) , in order to supply some advices for the design of new drugs.
Methods To make FXa protein receptor and its init ial ligand (RPR) as a reasonable compound and obtain
a compound st ructure of FTD and FXa by using molecular docking. In order to invest igate the interact ion
of the ligand and receptor during the dynamic state, 500 ps molecular dynamics simulat ion was chosen to
est imate their binding mode. Results RPR remained stable matching state with S1 domain and middle part
of the receptor depending on hydr ogen bond, formed fine spacial matching with S4 ( Tyr99, Phe174, and
Trp215) relying on nonpolarity aromat ic groups. The interact ion style of FTD and receptor is different
from RPR, it had weak role with S1 domain but had relat ively st rong action with S4 and middle part , as a
#592# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
* 收稿日期: 2008207222 基金项目:科技部支撑项目 ( 2007BAI41B00) ; 天津市支撑项目 ( 07ZCKFSH 00300)作者简介:金丽媛( 1982 ) ) ,女,天津人,硕士研究生,主要从事药理学研究。T el: 13612062511 E2mail: jinl iyuan 2006@163. com
* 通讯作者 徐为人 T el: ( 022) 23003529 E2mail: xwrt j@yahoo. com. cn