全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1355·
负荷大鼠脑组织的MAO—B活性，对抗铝过负荷引
起的大鼠脑组织MAO—BmRNA和蛋白表达的增
加。结果提示，小檗碱对慢性铝过负荷致神经元退变
有明显的保护作用，其作用机制可能与增强胆碱能
神经元功能、抗氧化应激损伤及抑制MAO—B活性
与表达，从而增加多巴胺递质的量有关。
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淫羊藿提取物对小鼠T淋巴细胞体外活化和增殖的影响
滕菲，曾耀英。，黄秀艳，杨 志，姚满林，宋兵，李林
(暨南大学组织移植与免疫中心，广东广州 510632)
摘 要：目的研究淫羊藿水溶性提取物对刀豆蛋白A(ConA)刺激的小鼠T淋巴细胞体外早期活化和增殖的影
响。方法无菌分离小鼠各部位淋巴结，制备单细胞悬液。加入不同终质量浓度(5、25、50mg／L)的淫羊藿提取物，
以MTT法检测药物对T细胞活性的影响；利用流式细胞术(FCM)结合双色荧光抗体染色技术检测早期活化标
志CD69分子的表达；运用流式细胞术结合活体染料CFDA—SE染色技术和荧光抗体染色技术检测T细胞增殖。
结果MTT法检测淫羊藿提取物在50mg／L时细胞存活率达52．360A。ConA作用6h后，对照组CD69+表达
率为(4．61士0．85)％，ConA组 D69+T细胞的比率上升至(38．30士2．54)％，淫羊藿提取物在终质量浓度5、
25、50mg／L时均抑制ConA诱导的CD3+T淋巴细胞CD69的表达(P
0．01，ConA组P1分别达到1．42±0．01、2．32士0．01，淫羊藿提取物在终质量浓度5、25、50mg／L均抑制T淋巴
细胞增殖(P<0．01)，48h时P1分别为1．28士0．01、1．26士0．01、1．21士0．01I72h时P1分别为2．30士0．03、
2．13士0．02、2．10士0．01。结论淫羊藿提取物能明显抑制ConA刺激的小鼠T淋巴细胞的早期活化和增殖，并
呈剂量依赖性。
关键词：淫羊藿提取物；T淋巴细胞；活化；增殖
中图分类号：R286．95 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)09—1355—05
收稿日期：2007—11一02
基金项目：。973”国家重点基础研究项目(2006CB504201和2004CB720100)，广东省基金资助项目(2006836030016)I广州市科技局
科技攻关重点资助项目(2006Z—E0091)
作者简介；膝菲(1984一)，女，山东淄博人，硕士生．主要研究免疫分子识别和免疫调节药物研发．
Tel：(020)85220732E—mail：tengfei19840210@163．com
·通讯作者 曾耀英 E—mail：tzengyy@jnu．edu．一cn
万方数据
·1356· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
EffectofextractfromHerbaEmidemiionactivationandproliferation
ofmouseTlymphocytesinvitro
TENGFei，ZENGYao—ying，HUANGXiu—yan，YANGZhi，YAOMan—lin，SONGBing，LILin
(InstituteofTissueTransplantationandImmu ology，JinanUniversity，Guangzhou510632，China)
Abstract：ObjectiveTos udytheeffectofwaterextractfromHerbaEmidemiionthe arly
activationandproliferationofmouseTlymphocytesstimulatedbyconcanvalinA(ConA)invitro．
MethodsSinglecellsuspensionwaspreparedfrommouselymphoidnodesingermfreecondition．The
drugtoxicityofwaterxtractfromHerbaEmidemii(5，25，and50mg／L)onTlymphocyteswas
measuredbyMTT．TheexpressionofCD69，themarkerofearlyactivationofTlymphocyteswas
measuredbyflowcytometry(FCM)combinedwithtWO—colourmmunofluorescentstainingof ellsurface
antigen．TheproliferationofTlymphocyteswasm asuredbyFCMcombinedwithcarboxylfluorescin
diacetatesuccinmidylester(CFDA—SE)stainingandimmunofluorescentstaining．ResuitsThesurvival
ratioofTlymphocytesin50mg／Lwas52．36％．After6hculture，theexpressionratefCD69+Tcellin
controlgroupwas(4．61士0．85)％，thatinConAgroupwas(38．30士2．54)％，waterextratfromHerba
Emidmii(5，25，and50mg／L)inhibitedthexpressionofCD69inCD3+TlymphocytesstimulatedbyCon
A(P<0．01)，theexpressionrateswere(36．16±2．14)％，(30．5士1．72)％，and(15．99士O．87)％，
respectively．After48and72hculture，theproliferationindex(PI)ofcontrolgroupwere1．01±O．01and
1．05士O．01，ofC nAgroupwere1．42士O．01and2．32±0．01，respectively．WaterextractfromHPrba
Emidmii(5、25，and50mg／L)inhibitedtheproliferationofTlymphocytes(P<0．01)，thePIof48h
were1．28土O．01，1．26土O．01，1-21±O．01；thePIof72hwere2．30士O．03，2．13士0．02，2．10土O．01，
respectively．ConclusionWaterxtractfromHerbaEmidmiicouldsignificantlyinhibitConA—induced
earlyactivationandproliferationofmouseTlymphocytesinvitroinadosedependentma ner．
Keywords：extractfromHPrbaEmidemii；Tlymphocytes；activation；proliferation
淫羊藿(HerbaEpimedii)具有补肾阳、强筋
骨、祛风湿的功效。现代药理研究表明淫羊藿对于改
善心血管系统功能、调节内分泌、增强免疫能力、促
进代谢功能、抗骨质疏松、抗衰老等均表现出生理活
性。它还具有明显的抗肿瘤功效，是一种很有潜力的
抗癌药物[1’2]。淫羊藿提取物中含有多种成分，其主
要有效成分为淫羊藿黄酮和淫羊藿苷，其中活性特
征成分为淫羊藿苷，具有调节性激素、调节免疫功
能、抗肿瘤、舒张血管等药理作用[1’2]。T细胞在适应
性免疫应答中起关键作用，T细胞接触抗原后，经双
信号刺激活化后，克隆扩增并分化成效应T细胞，发
挥细胞免疫功能。同时，活化T细胞还通过分泌细胞
因子及细胞间相互作用，辅助B细胞活化、增殖，促
进体液免疫应答。因此，T细胞活化是免疫应答发生
的关键环节[3]。本研究通过对小鼠T淋巴细胞活化
和增殖测定等实验，进一步研究淫羊藿水溶性提取
物对小鼠免疫功能的调节作用及机制。
1材料
1．1 实验动物：清洁级BALB／cJ(H一2K。，I—A8，以
下简写为BALB／e)近交系小鼠，雄性，8～10周龄，
体质量(20士2)g，购自广东省实验动物中心。
1．2主要药物、试剂与仪器：淫羊藿提取物(主要成
分为淫羊藿黄酮和淫羊藿苷)由广州健心药业有限
公司馈赠；刀豆蛋白A(ConA)、L一谷氨酰胺、p二
巯基乙醇均购自美国Sigma公司；羧基荧光素双醋
酸盐琥珀酰亚胺酯(CFDA—SE)购自美国
Invitrogen—MolecularProbes公司；RPMI一1640培
养基、胎牛血清(FBS)为美国GibcoBRL公司产
品；抗小鼠CD3一PE、CD69一FITC，单克隆抗体购自
美国BD—PharMingen公司。FACSCalibur流式细
胞仪为美国BectonDickinson公司产品。
2方法
2．1小鼠淋巴细胞悬液的制备：将BALB／cJ小鼠
断颈处死，无菌分离小鼠颈部、双侧颌下、锁骨下、腋
窝、腹股沟浅淋巴结及肠系膜淋巴结，在盛有预冷的
PBS的无菌平皿中，去掉被膜，200目尼龙网滤过，
收集细胞，用冷的PBS洗涤细胞两次(250×g，5
min)后，用PBS重悬，得到淋巴细胞悬液。
2．2 MTT法测定药物对T细胞活性的影响：将淋
巴细胞悬液用RPMI一1640完全培养基(含10％
FBS、2mmol／LL一谷氨酰胺、5gmol／Lp二巯基乙
醇、1×105U／L青霉素、100mg／L链霉素)洗涤2
次(250×g，5rain)，重悬于RPMI一1640完全培养
基中，吹匀并计数，调整细胞悬液浓度为2×109／L，
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1357·
接种于96孔板，每孔180pL。实验共分5组：空白
组，只加200弘L培养基；对照组；终质量浓度为5、
25、50mg／L淫羊藿提取物组。每孔定容至200弘L
体系。在37℃、5％CO：培养箱培养48h。然后每孔
加5mg／L的MTT各20pL，在培养箱中避光染色
4h后，300×g离心5min，将上清液倒净，每孔加
100pLDMSO，振荡器上振荡10min，酶标仪490
nm检测吸光度(A)值。计算细胞存活率。
细胞存活率一(A琦-组一A空白蛆)／(Aurora—A空自曩)×
100％
2．3 T细胞CD69表达测定：采用直接免疫荧光标
记法染色，接种方法同2．2项。实验共分5组：对照
组，ConA组(终质量浓度5mg／L)，ConA+淫羊
藿提取物(5、25、50mg／L)组。每孔定容至200pL
体系。在37℃、5％CO：培养箱预孵4h使药物充分
作用，然后加入刺激剂ConA(终质量浓度5mg／
L)，在37℃、5％CO。培养箱培养6h后取上清，并
收集细胞，离心，弃上清，重悬于50弘LPBS，按每
1×106个细胞加入1pg抗小鼠CD3一PE、CD69一
FITC单克隆抗体，混匀后室温下避光放置30min，
PBS洗涤2次，重悬于300弘LPBS中，立即上流式
细胞仪检测。
2．4 CFDA—SE染色测定T细胞增殖：按文献方
法[43，CFDA—SE用DMSO溶解成10mmol／L的储
存液，一20℃保存。临用前，取适量用PBS稀释成
1mmol／L的工作液，备用。PBS调整淋巴细胞密度
为1×1010／L，加入CFDA—SE工作液(终浓度为
1vmol／L)，充分混匀后在37℃条件下避光轻轻振
荡10min。然后用RPMI一1640完全培养基洗涤2
次，250×g离心5min，重悬并计数，调整细胞悬液
浓度为2×109／L，接种于96孔板，每孔180弘L。实
验分组同2．3项，每孔定容至200pL体系。在
37℃、5％C0。培养箱预孵4～6h，然后加入ConA
(终质量浓度5mg／L)，在37℃、5％CO：培养箱培
养48、72h后收集细胞，用PBS洗涤细胞2次，离
心，弃上清，重悬于50pLPBS，按每1×106细胞加
入1弘g抗小鼠CD3一PE单克隆抗体，混匀后室温下
避光放置30min，PBS洗涤细胞2次，300弘LPBS
重悬细胞，立即上流式细胞仪检测。
2．5 流式细胞术检测及分析：所有样品经FACS
Calibur流式细胞仪获取和CellQu st软件分析，其
中CFDA—SE和FITC为荧光1(FLl)通道，PE为
荧光2(FL2)通道。每管样品检测10000个细胞，
获得的数据用CellQuest及ModFitLT3．2软件
进行分析。
2．6 统计学处理：全部数据使用Excel和SPSS
10．1做统计学处理，数据以z士s表示，两组间的比
较采用配对t检验。
3 结果
3．1 对T淋巴细胞活性的影响：与药物共培养
48h后，加药组A值均低于对照组(P
存活仍有52．36％。因此，药物对T细胞的作用不是
由于药物对细胞活性的影响引起的。
表1 淫羊藿提取物对T淋巴细胞活性的影响(；士s，n----6)
Table1 EffectofextractfromHerbaEpimediiORactivity
ofTlymphoeytes(；士s，万一6)
组别剂量／(rag·L。)A值 细胞存活率／％
与对照组比较t。P
3．2 对T淋巴细胞CD69表达的影响：细胞培养
6h后，对照组CD69表达率为(4．61±0．85)％，
ConA组CD69表达率达到(38．30土2．54)％，淫羊
藿提取物在终质量浓度5、25、50mg／L时均抑制Con
A诱导的CD3+T淋巴细胞CD69的表达，并有明显
的剂量依赖性，其表达率分别下调为(36．16±
2．14)％、(30．5±1．72)％、(15．99士0．87)％，与
ConA组比较差异有统计学意义(P<0．01)。见图1。
另外，淫羊藿提取物在低质量浓度，即5、25mg／L时，
CD3+CD69+T淋巴细胞的平均荧光强度(mean
fluorescenceintensity，MFI)比ConA组有所上
升，但在高质量浓度50mg／L时，MFI明显下降。
3．3对T淋巴细胞增殖的影响：CFDA—SE属活性
染料，是一种非极性分子，可自由穿透细胞膜并在细
胞内被酯酶转化成带负电荷的CFSE。CFSE可自
发不可逆的通过赖氨酸侧链或其他可利用的胺，偶
联到细胞蛋白质上。利用CFSE在细胞分裂时可以
平均的分配到两个子代细胞，从而荧光强度随之减
半的特性[¨，通过流式细胞术在488nm激发光和
荧光1(FLl)检测通道分析T淋巴细胞群中，增殖
的子代所中的比率，即增殖率。经ModFitLT3．2分
析处理后，得到各代细胞(亲代细胞，G。代表子一代
细胞，G。代表子二代细胞，G．代表子三代细胞，G。代
表子四代细胞)所占的百分率和增殖指数(PI)。药
物培养48h后(表2)，对照组只有一个亲代峰，
万方数据
·1358· 中草蔼 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
圈1淫羊藿提取物对ConA刺激的CD3+T淋巴
细胞CD69表达的影响
Fig．1EffectofextractfromHerbaEpimedii
onCD69expressioninCD3+Tlympho-
cytesstimulatedbyConA
P1只有1．01士0．01，ConA组出现两个子代峰，PI
达到1．42土0．01，淫羊藿提取物在终质量浓度5、
25、50mg／L均抑制T淋巴细胞增殖，P1分别为
1．28±0．01、1．26±0．01、1．21士0．01，差异有统计
学意义(P
有明显的剂量依赖效应，其中50mg／L时抑制效果
最明显。药物培养72h后(表2)，对照组PI为
1．05士0．01，ConA组出现3个子代峰，PI达到
2．32土0．01，淫羊藿提取物在5、25、50mg／L时P1
分别下降为2．30士0．03、2．13土0．02(P<0．01)、
2．10±0．01(P<0．01)，淫羊藿提取物质量浓度越
高，子代细胞百分比逐渐减少，亲代比例增大，有明显
的剂量依赖效应，其中50mg／L时抑制效果最明显。
4讨论
淋巴结是成熟T细胞和B细胞的主要定居部
位，T淋巴细胞约占淋巴结内淋巴细胞总数的
75％，B细胞约占25％[5]。抗原对T淋巴细胞的刺激
作用是需要抗原提呈细胞(APCs)的提呈，而B细
胞可作为APC提呈抗原给T细胞，因此，淋巴结是
研究淋巴细胞行为较好的细胞来源。
CD69是由二硫键联接的同二聚体跨膜糖蛋
白，属C型凝集素家族成员，主要表达于淋巴细胞活
化早期，在多克隆刺激剂下会迅速表达，而在静止期
T细胞几乎不表达，是T细胞活化的重要标志[3]。一
些研究认为CD69表达的增加与细胞介导的自身免
疫和炎症性疾病以及同种异体移植物排斥有
关[6~8]。丝裂原ConA作为一种抗原蛋白，可启动
经典的信号传导级联反应，从而使T淋巴细胞
活化‘5J。
表2淫羊藿提取物对ConA刺激T淋巴细胞增殖的影响(；士s，厅=6)
Table2 EffectofextractfromHeraEraimediionproliferationofTlymphocytesstimulated
byConAfor48and72h(；士j，露=6)
组别
剂量／48h 72h
(rag·L一1)亲代／％ G2／％ G3／％ 亲代／％ Gz／％ G3／％ G‘／％ G5／％
与ConA组比较：。P
A诱导的小鼠T淋巴细胞早期活化和增殖，降低活 离子，结果显示淫羊藿提取物降低了ConA刺激下
化率和增殖率，并有明显的剂量依赖效应。在本实验 胞内钙离子浓度，提示淫羊藿提取物可能是影响了
万方数据
中草黄ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1359·
胞内钙离子的浓度进而影响T细胞活化和增殖。
Meng等[。3报道淫羊藿提取物在体外具有雌激素效
应，可以防止老年鼠和绝经期妇女的骨质疏松症。
Ye等Do]报道淫羊藿提取物或制剂在体内可以引起
类似雌激素效应，提示淫羊藿可能与Genistein作
用路径相似，即通过抑制PTK活性，阻断活化信号
的传递。
淫羊藿提取物对ConA刺激的小鼠T淋巴细
胞早期活化和增殖都是有抑制作用的，具有开发为
免疫调节剂的潜能，其抗肿瘤、抗氧化作用也十分显
著，但具体作用靶点和路径尚不清楚，有待于进一步
探索和研究。
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基因芯片技术分析青蒿琥酯抑癌作用机制
陈立军，姚 丽，靳秋月，谢 红，呼文亮。
(中国人民武装警察部队医学院生化教研室，天津 300162)
摘 要：目的利用基因芯片检测青蒿琥酯作用于K562细胞后的基因表达情况，从基因水平上探讨青蒿琥酯抑制
K562细胞增殖的作用机制。方法K562细胞经不同浓度青蒿琥酯处理24h，倒置光显微镜和荧光显微镜观察细
胞形态学变化，流式细胞仪检测细胞周期变化。提取总RNA。逆转录生成cDNA，cDNA与基因芯片杂交，扫描仪检
测杂交结果。结果倒置光显微镜观察到青蒿琥酯处理的K562：细胞出现不同程度的皱缩，核分裂相减少，细胞密
度下降，漂浮细胞增多。荧光显微镜观察到青蒿琥酯处理的K562：细胞染色质高度浓缩、边缘化，凝聚成明亮的团
块，即凋亡小体。流式细胞仪检测青蒿琥酯处理K562细胞Gz期细胞的比例明显增加。扫描信号，分析数据显示10
条基因表达有差异，p21、chkl表达上调，cyclinBl、cyclinEl、E2FI、DNA—PK、hTERT、bcl一2、jnk、VEGF表达下调。
结论 青蒿琥酯可以抑制K562细胞增殖，作用机制与改变细胞周期某些调控物质的基因表达、诱导K562细胞凋
亡有关。
关键词：基因芯片；青蒿琥酯}细胞周期I细胞凋亡
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)09—1359—06
Analysisonmechanismrelatedoanti-cancereffectofartesunateusinggenechiptechnology
CHENLi—jun，YAOLi，jINQiu—yue，XIEHong，HUWen—liang
(DepartmentofBiochemistry，MedicalCollegeofChinesePeople’sArmedPoliceForces，Tianjin300162，China)
Abstract：ObjectiveInordertounderstandhowartesunateinhibitedleukaemiacelllineK562，onthe
molecularlevel。thegenechipwasusedtodetectthegeneexpressionofleukaemiaelllineK562treatedby
artesunate．MethodsK562Cellweretreatedwithartesunatefor24h，andthenmodalitychangesw re
收稿日期：2007—12—20
基金项目：天津市科委课题资助项目(05YFJMJC08200)
作者简介：陈立军(1967一)，女，副教授，研究方向为肿瘤相关基因表达。Tel：(022)60578076E—mail；chenlijun67@eyou．com
*通讯作者呼文亮
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万方数据
淫羊藿提取物对小鼠T淋巴细胞体外活化和增殖的影响
作者： 滕菲， 曾耀英， 黄秀艳， 杨志， 姚满林， 宋兵， 李林， TENG Fei， ZENG Yao-ying
， HUANG Xiu-yan， YANG Zhi， YAO Man-lin， SONG Bing， LI Lin
作者单位： 暨南大学组织移植与免疫中心,广东,广州,510632
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(9)
被引用次数： 1次
参考文献(10条)
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本文读者也读过(10条)
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引证文献(1条)
1.张萍.孔维军.鄢丹.王晶彬.任永申.赵艳玲.肖小河.周旭 基于淫羊藿苷测定及HPLC指纹图谱分析的淫羊藿药材质
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