全 文 ：·药材与资源·
转双价抗虫基因 Bt2Cp TI 提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性
丁如贤1 ,肖 　莹2 ,王 　凯1 ,陈万生2 ,张汉明1 3 ,张 　磊1 3
(11 第二军医大学药学院 ,上海 　200433 ; 21 第二军医大学长征医院 ,上海 　200003)
摘　要 :目的 　将外源苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因 Cry IA ( c) 和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 Cp T I 共同转入四倍
体菘蓝以获得鳞翅目昆虫小菜蛾抗性。方法 　构建了以 CaMV 35S 为启动子 ,新霉素磷酸转移酶 ( N pt2Ⅱ) 为选
择标记 ,带有 Cry IA ( c) 基因和 Cp T I 基因的植物表达载体 p GBI121S4ABC 并转入根癌农杆菌 LBA4404。采用叶
盘法遗传转化四倍体菘蓝。转基因再生植株经 PCR 和 Southern 杂交检测 ,并进行抗小菜蛾实验。结果 　T0代转
化四倍体菘蓝的双基因阳性转化率达到 16167 %。Southern 杂交检测结果表明外源 Cry IA ( c) 基因和 Cp T I 基因
均已经随机整合到转基因菘蓝的基因组中。与野生对照相比 ,转基因四倍体菘蓝对小菜蛾显示出明显抗性。结论
转双价抗虫基因 B t2Cp T I 是提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性的有效手段。
关键词 :四倍体菘蓝 ; 根癌农杆菌 ; 抗虫 ; 苏云金芽孢杆菌 ( B t) 杀虫蛋白基因 Cry IA ( c) ; 豇豆胰蛋白酶抑制剂
( Cp T I) ; Southern 杂交
中图分类号 :R282112 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0420621204
Enhanced resistance of transgenic tetraploid Isatis indigotica by Bt and Cp TI to moths
DIN G Ru2xian1 , XIAO Ying2 , WAN G Kai1 , CH EN Wan2sheng2 , ZHAN G Han2ming1 , ZHAN G Lei1
(11 School of Pharmacy , Second Military Medical University , Shanghai 200433 , China ; 2. Changzheng Hospital ,
Second Military Medical University , Shanghai 200003 , China)
Abstract : Objective 　Two insect resistance genes B aci l l us t huri ngiensis ( B t) crystal p rotein gene
Cry I A ( c) and cowpea t ryp sin inhibitor gene Cp T I were int roduced into tet raploid Isatis i ndi gotica to en2
hance t he resistance to mot hs. Methods 　I. i n di gotica was t ransformed with a plasmid , p GBI121S4ABC ,
containing Cry I A ( c) B t and Cp T I and t he selectable gene ( N pt2Ⅱ) driven by t he CaMV35S promoter via
A g robacteri um t umef aciens LBA4404 mediated t ransformation. Then PCR and Sout hern blot ting assay
were conducted followed by mot h bioassay test . Results 　Co2t ransgenic rate of the two genes in tet raploid
I. i ndi gotica was 16. 67 %. The integration and expression of int roduced genes in T0 regenerated t ransgen2
ic plant s were confirmed by Sout hern blot ting assays. Insect bioassay test demonst rated t ransgenic lines
had significant inhibition to mot hs , compared wit h wild type cont rol . Conclusion 　Co2t ransformation of B t
and Cp T I genes is an effective st rategy to enhance t he resistance to moths for tet raploid I. i ndi gotica.
Key words : tet raploid Isatis i ndi gotica Fort . ; A g robacteri um t umef aciens ; insect resistance ; B aci l2
l us t huri ngiensis ( B t) crystal p rotein Cry IA ( c) gene ; cowpea t rysin inhibitor ( Cp T I) ; Sout hern blot ting
　　菘蓝 Isatis i ndi gotica Fort . 为十字花科菘蓝
属植物 ,是我国传统中药 ,历代常用 ,根入药称板蓝
根 ,叶入药称大青叶 ,有清热解毒、凉血利咽的功效 ,
可防治病毒性感染等疾病。课题组经过 10 余年的
努力 ,完成了菘蓝的四倍体育种工作 ,该品系根、叶
明显较原二倍体高产 ,药理实验等质量指标也都明
显超过原二倍体亲本[1 ] 。然而 ,虫害仍然是影响四
倍体菘蓝产量的重要因素之一 ,鳞翅目昆虫白粉蝶
和小菜蛾引起的虫害相当严重 ,其地上部分可被害
虫全部吃光。若喷施农药又会带来农残严重影响药
材质量的新问题。现代分子生物学特别是植物抗虫
基因工程的迅速发展 ,为防治害虫提供了一条新途
径[2 ] 。本研究利用根癌农杆菌介导将抗虫基因
Cry I A ( c) 和 Cp T I 同时转入四倍体菘蓝 ,获得的
双价转基因植株对小菜蛾显现出强抗虫能力。
1 　材料与方法
·126·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
3 收稿日期 :2008206214　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (39870919 , 300709210)
作者简介 :丁如贤 (1963 —) ,男 ,江苏南通人 ,博士 ,副教授 ,主要从事药用植物生物工程工作。
Tel : (021) 25074572 　E2mail : rxding @smmu. edu. cn3 通讯作者　张汉明　Tel : (021) 25074575 　E2mail : hmzhang @smmu. edu. cn ;
　　　　　　张　磊　Tel : (021) 25074574 　E2mail : starzhanglei @gmail . com
111 　无菌外植体的获得 :挑选色泽黑亮饱满的四倍
体菘蓝种子经 011 % HgCl2浸泡 10 min ,无菌水冲
洗 4～5 次后接种到 1/ 2 MS 培养基上 ,25 ℃、12 h
光照/ d ,光强度 4 000 lx。
112 　植物表达载体的构建和工程菌株培养 :含有
p GBI121S4ABC 的菌株 LBA4404 是由中国农业科
学院生物技术研究中心郭三堆先生提供的。
p GBI121S4ABC 质粒 T2DNA 区结构见图 1。
图 1 　PGBI121S4ABC 质粒图谱
Fig. 1 　Structure of plasmid pGBI121S4ABC
　　从抗性培养基上挑取 LBA4404 单菌落接种在
含有 100 mg/ L 链霉素 (st rep tomycin , St r) 和 100
mg/ L 卡那霉素 (kanamycin , Kan) 的液体 YEP 培
养基中 ,28 ℃、200 r/ min 条件下振荡过夜培养至对
数生长期 A 600 = 015 ;4 ℃、5 000 r/ min 离心 8 min ,
收集菌体沉淀 ,用等体积 1/ 2 MS 重悬培养 ,28 ℃、
200 r/ min 振荡培养活化 30 min 用于转化。
113 　菘蓝外植体遗传转化 :取生长 8～10 d 的菘蓝
子叶 ,剪一定数量的伤口 ,浸入活化好的工程菌中 ,
加入 100μmol/ L 的乙酰丁香酮 ,28 ℃、180 r/ min
振荡 15 min ;取出外植体用无菌滤纸吸去表面多余
菌液 ,置于固体共培养基上 ( MS + BA 2 mg/ L +
NAA 0. 5 mg/ L) ,25 ℃暗培养 2～3 d ;取出外植
体 ,用无菌水冲洗 3 次后接种于选择分化培养基
(MS + BA 210 mg/ L + NAA 0. 5 mg/ L + Kan 20
mg/ L + Cef 500 mg/ L ) 上 ,25 ℃、12 h 光照/ d ,光
强度 4 000 lx 进行培养 ,2 周继代 1 次。待不定芽
长至 2 cm 左右 ,切下转移至生根培养基 ( MS +
NAA 012 mg/ L + Kan 20 mg/ L + Cef 500 mg/ L) 。
根系发达后 ,开瓶炼苗 2～4 d ,洗去根部的培养基 ,
移栽至泥炭土与珍珠岩 (3 ∶1) 混合的穴盘 ,浇灌
足够的水分 ,喷洒 5 % 的井冈霉素 ( validamycin
A) 。放至自然光照温室中 ,控制温度 25 ℃,湿
度 80 %。
114 　PCR 检测 :取 Kan 抗性植株叶片 ,采用改良
的 CTAB [3 ] 法提取总 DNA。反应体系为 25 μL 。
215 U Ex T aq ( Takara ) 0. 5 μL ; 10 ×Ex T aq
Buffer (Mg2 + Plus) 2μL ; dN TP (0. 25 mmol/ L )
1. 6 μL ,上下游引物 F Cry I A ( c) : 5′2GGT TA2
CACT2CCCA TCGACA TCTCC23′; R Cry I A ( c) :
5′2CCA TA GGCGAACTCT GT TCCGTC23′。 F
Cp T I : 5′2GGA T T T GAA GCACCTCGGAA GT2
3′; R Cp T I : 5′2ACTCA TCA TCT TCA TCCCT G2
GA23′(10μmol/ L ) 各 015μL ,模板 10～20 ng。
梯度 PCR 反应程序为 :94 ℃预变性 7 min ,94 ℃
变性 45 s ,72 ℃延伸 1 min。退火温度从 65 ℃每
2 个循环下降 2～3 ℃,然后在 50 ℃反应 18 个循
环 ,72 ℃延伸 7 min。
115 　Sout hern 杂交 :提取 PCR 阳性转基因菘蓝总
DNA (10 ng , H i n d Ⅲ酶切过夜 ,50 V 电压 ,018 %
琼脂糖凝胶电泳 9 h 后转到尼龙膜上 ,转移方法和
探针的制备见《分子克隆实验指南》。预杂交 2 h
后 ,68 ℃杂交过夜。55 ℃先用 2 ×SSC/ 0. 1 %
SDS 溶液洗膜 30 min (两次) ,然后室温下轻摇孵
育 40 min。将尼龙膜用塑料薄膜包裹 ,暗室曝光大
约 40 min 后 ,进行 8 min 显影 ,1 min 水浴 ,16 min
X 光片定影 ,流水冲洗 5 min 后观察。
116 　抗小菜蛾功能试验 :从田间取回小菜蛾幼虫 ,
培养在 24 ℃、70 % 湿度的培养箱中 ,每天饲喂新鲜
菘蓝叶片 ,使幼虫长大化蛹 ,羽化 ,交配。雌虫产卵
后 ,收集虫卵 ,然后分期使卵粒孵化 ,孵化后约 48 h
的幼虫用于试验 ,试验前称幼虫体质量。取 South2
ern 杂交阳性且移栽存活的 T0 代转基因四倍体菘
蓝上半部鲜嫩生长旺盛的叶片 ,放入直径为 12 cm
的培养皿内。每皿底部垫放浸湿的纱布 ,放置 3 张
叶片。用软毛笔接种已称质量的幼虫 10 条 ,24 ℃
培养箱 ,12 h 光照/ d ,光强度 4 000 lx 培养。饲喂
第 9 天统计死亡幼虫数 ,取出存活的幼虫精确称质
量 ,观察其生长和叶片被摄食情况。抗虫试验重复
3 次。
2 　结果
211 　转基因植株的 PCR 检测 :提取 Kan 抗性植株
叶片 DNA 作为模板 ,基因特异引物进行 PCR 扩增
检测 Cry I A ( c ) 和 Cp T I 基 因。质 粒 p G2
BI121S4ABC 为阳性对照 ,未转化的菘蓝基因组
DNA 为阴性对照 ,水为模板作为空白对照。结果
·226· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
显示 :抗性再生植株 DNA 中均扩增出了 683 bp 的
Cry I A ( c) 基因特异性片段和 715 bp 的 Cp T I 基因
特异性片段 (图 2) ,而阴性对照未扩增出目的片段 ,
初步证明再生菘蓝植株基因组中可能有外源 Cry2
IA ( c) 和 Cp T I 基因序列的插入。在检测的 258 株
转基因小苗中 ,双基因 PCR 阳性棵数为 43 ,共转化
率为 16167 %。
212 　Southern 鉴定 : PCR 只能考察转基因植株内
存在外源目的基因片段 ,而不能完全确定外源目的
基因片段是否已整合进宿主基因组 ,可能存在假阳
性结果 ,因此进一步采用 Sout hern 杂交分析验证独
立转化植株。以 Cry IA ( c) 为标记探针的杂交结果
表明转基因菘蓝 3～18 样品均出现 1 或 2 条杂交
带 ,以 Cp T I 为标记探针的杂交结果表明转基因菘
蓝 3～ 18 样品均出现一条杂交带 ,而野生对照
(Line 1) 则未出现任何杂交条带 ,证明 Cry I A ( c)
和 Cp T I 基因已经成功整合进菘蓝基因组 ,且为低
拷贝形式 ,有利于转基因的正常表达 (图 3) 。
213 　抗小菜蛾活性测定 :昆虫饲喂第 9 天 ,以小菜
蛾幼虫死亡率、存活幼虫平均体质量和叶片受损伤
程度为指标 ,检测转基因四倍体菘蓝的抗虫活力 (表
1) 。与未转基因对照相比 ,大多数转基因植株能明
显抑制幼虫生长 ,表现为昆虫死亡率升高 ,存活幼虫
平均体质量减轻 ,叶片受损伤程度减弱。经最小显
著极差法检验 ,1、2、3、6、7、8、9、10、12 号独立转化
株系与对照相比有极显著差异 ( P < 0101) ,4、5 号
昆虫的死亡率达到 100 %。小菜蛾幼虫的中毒症状
一般出现于饲喂叶片后的第 3 天 ,幼虫摄食量减少 ,
活动减慢 ,虫体开始萎缩 ,幼虫体内隐约呈红色。
5～6 d 后幼虫逐渐死亡 ,虫体呈红色并变软腐败。
有部分幼虫尽管不能被杀死 ,但虫体生长明显受到抑
制 ,后期化蛹比对照晚 4～5 d ,并且是异常蛹 (蛹体
小 ,呈红色) 。这些蛹最后都腐坏而不能化羽成虫。
3 　讨论
　　害虫是造成农林业减产的重要因素之一 ,喷施
表 1 　转基因菘蓝植株抗虫活性
Table 1 　Insecticidal activity of transgenic plants
of tetraploid I. indigotic to moths
株系 昆虫死亡率/ % 存活幼虫平均体质量/ mg 叶片损伤程度
1 　331 3 441571 ± 71079 3 +
2 431 3 301380 ± 61443 3 +
3 20 421957 ± 51645 3 + +
4 100 　　　- +
5 100 　　　- +
6 361 6 391917 ±10125 3 +
7 0 331140 ± 31296 3 + +
8 0 441130 ± 61569 3 + +
9 0 441278 ± 61309 3 + +
10 0 551890 ± 51408 3 + +
11 0 1171270 ± 61476 3 + + +
12 0 211150 ± 21696 3 + +
对照 0 1631540 ± 91620 3 + + + + +
　　最小极差法检验有极显著差异 : 3 P < 0101 ,“+ ”表明叶片受虫
害损害面积为 20 %
　　Duncan′s test (L SR) : ext reme significance at 3 P < 01 01 level ,
“+ ”indicates percentage of damage leaf area is 20 %
化学农药、生物杀虫剂是目前主要的防治方法 ,但前
者会造成环境污染 ,后者成本较高。植物基因工程
·326·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
的兴起与发展 ,为利用基因工程防治虫害打开了新
的局面。
微生物来源的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因
( bacillus thuringiensis insecticidal crystal p rotein ,
B t2toxin) [4 ]是世界范围内使用最广泛的抗虫基因 ,
其产生的杀虫蛋白对鳞翅目昆虫具有很强和专一的
毒性 ,对人畜安全无害[5～7 ] 。目前苏云金杆菌杀虫
蛋白基因已引入烟草、棉花、水稻、玉米等 50 余种植
物 ,成功提高其抗虫性[8～12 ] 。豇豆胰蛋白酶抑制剂
(cowpea t ryp sin inhibitor , Cp T I) 作为一种植物来
源的昆虫蛋白酶抑制剂[13 ] ,能抑制昆虫或动物消化
系统的蛋白酶活性 ,从而影响昆虫的消化作用而致
昆虫死亡。由于其具有抗虫谱广且昆虫不易对其产
生耐受性的特点 , Cp T I 被作为植物抗虫基因工程
一个重要的候选基因。目前 Cp T I 基因已经被成
功转入烟草、棉花、油菜等多种农作物中[ 14 ] 。
随着转基因抗虫棉新品种成功在全球推广 ,人
们越来越意识到植物抗虫基因工程的巨大作用。然
而自然选择和进化的结果使昆虫在遗传基础上降低
了对毒蛋白基因的敏感性。昆虫的抗性是转基因植
物是否能持续高效抗虫不容忽视的问题[15 ] 。多抗
虫基因共转化为解决这一问题提供了一个有效的策
略。同时转化 2 个或 2 个以上抗虫基因 ,使转基因
植物表达出不同的杀虫蛋白 ,以缓解昆虫对毒蛋白
产生的抗性 ,延长其在生产上使用的年限。该方法
已成功应用于棉花、烟草等作物 ,并显示出显著的抗
虫效果[16 ] 。将使用最广泛的 B t 杀虫蛋白基因和
Cp T I 基因共同转化植物 ,两种抗虫机制完全不同
的基因共同作用 ,将会大大降低昆虫产生耐受性的
机率 ,克服野生型 Cp T I 抗性不够强的问题 ,有效
地扩展转基因植物的抗虫谱 ,对于生长周期中存在
众多种类害虫的植物具有更佳的实际应用效果。本
研究中 ,采用根癌农杆菌介导将 B t 和 Cp T I 共同
转化四倍体菘蓝 ,转基因植株对小菜蛾幼虫成活、生
长具有显著的抑制作用。今后将进一步研究转基因
菘蓝中两种外源基因蛋白表达、子代的遗传稳定性
和转基因菘蓝的品质评价等内容 ,以期获得安全、优
质、高产的转基因抗虫菘蓝新品系。
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