全 文 ：累 ,导致多糖和蛋白质的量相应增加 ,试管苗生长代
谢活动旺盛 ,生活力强。而生长 8 个月以后的试管
苗 ,由于生物量积累速率减小 ,加之分蘖小苗需要消
耗营养 ,所以生长后期试管苗多糖和蛋白质的量有
所减少。从生物量积累、多糖的量、可溶性蛋白质的
量、试管苗活力和生产成本等几个方面综合考虑 ,环
草石斛成熟的种子播种后 ,生长 8～10 个月时的试
管苗出瓶移栽较为合适。
314 　试管苗的质量关系到移栽成活率、苗生长的好
坏及最终药材的产量和质量 ,直接影响经济效益 ,所
以进行种苗分级标准的研究非常有必要。环草石斛
种子播种后 ,生长 8～10 个月时即可出瓶移栽 ,此时
试管苗大小不等 ,分级后再利用能够切实保证种苗
的质量。以苗高、茎粗和根数作为分级指标 ,将试管
苗分为 3 个等级 : 1 级苗苗高 ≥5 cm ,茎粗 ≥0125
cm ,根数 ≥3 条 ; 2 级苗苗高 ≥3 cm 且 < 5 cm ,茎
粗 ≥012 cm ,根数 ≥2 条 ; 3 级试管苗苗高 ≥2 cm
且 < 3 cm ,茎粗 < 012 cm ,根数 < 2 条。分级时 ,如
果 2 项指标符合要求 ,而其中 1 项不符合者 ,作为下
一等级苗处理。未达到 3 级标准的试管苗 ,生活力
强的继续转接培养 ,而小老苗、畸形苗、黄化苗、霉污
苗等丢弃、销毁 ,不使用。
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柴胡药材干根 D NA提取及 RAPD 分析
南晓洁1 ,郝媛媛2 ,赵艮贵2 3 ,韩 　榕1 ,秦雪梅2
(1. 山西师范大学生命科学学院 ,山西 临汾 　041004 ; 2. 山西大学 化学生物学与分子工程
教育部重点实验室 ,山西 太原 　030006)
摘 　要 :目的 　探索一种适用于柴胡药材干根 DNA 提取的方法 ,为实现以分子标记方法辨别柴胡药材奠定基础。
方法 　比较研究了分别用 CTAB 法、SDS 法和高盐低 p H 法等 3 种方法提取柴胡样品基因组 DNA。柴胡药材干根
经过 PVP 以及 TN E 缓冲液进行不同的预处理 ,以 CTAB 法抽提 DNA。以 EcoR Ⅰ/ Mse Ⅰ双酶切琼脂糖凝胶电
泳及 RA PD 扩增检测提取 DNA 的质量。采用 N TSYS2pc 软件计算 Jaccard 遗传相似系数 ,以非加权配对算术平均
数法 (U P GMA)建立聚类图。结果 　常规 DNA 提取方法提取药材干根 DNA 溶液经 4 ℃放置后 ,黏稠并褐变 ,严
重影响酶切和 RA PD 扩增。样品预处理优化条件是研磨时加入 3 % PVP , TN E 缓冲液于 0 ℃浸提 2 次 ,每次 30
min。以该优化的预处理方法处理 6 个柴胡药材干根样品 ,提取 DNA 条带清晰 ,酶切完全 ,RA PD 扩增图谱清晰稳
定 ,共获得有效扩增条带 28 条 ,其中多态性条带为 20 条 ,占 71143 %。聚类分析表明 ,6 个栽培品中 ,原产地为山西
灵丘外地引种 (LQW Y)和甘肃陇西 (L X) 、山西灵丘 (LQ)和山西方山 ( FSH)的亲缘关系较近 ,陕西商洛 (SHL) 和其
他 5 个栽培品的亲缘关系较远。结论 　柴胡药材干根经过预处理后 ,可采用常规的 DNA 提取方法抽提 DNA ,所
提 DNA 适合于酶切、RA PD 等分子标记分析。
关键词 :柴胡 ;干根 ;DNA ;RAPD
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0320447205
Genomic D NA extraction and RAPD analysis from dried roots of Bupleurum chinense
NAN Xiao2 jie1 , HAO Yuan2yuan2 , ZHAO Gen2gui2 , HAN Rong1 , Q IN Xue2mei2
(1. College of Life Science , Shanxi Normal University , Linfen 041004 , China ; 2. Key Laboratory of Chemical
Biology and Molecular Engineering , Minist ry of Education , Shanxi University , Taiyuan 030006 , China)
Abstract : Objective 　To st udy the genomic DNA ext raction f rom t he dried root s of B u pleurum
·744·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
3 收稿日期 :2008205225　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30570174)
作者简介 :南晓洁 (1983 —) ,女 ,山西省大同市人 ,在读硕士研究生 ,从事植物学研究工作。E2mail : nanxiaojie @163. com3 通讯作者　赵艮贵　Tel : (0351) 7011499 　E2mail : chungui @sxu. edu. cn
chinense. Methods 　Genomic DNA was ext racted f rom the dried root s of B . chi nense by means of three
met hods of routine CTAB , SDS , and low p H ext raction medium wit h high salt . Based on CTAB met hod ,
t he p ret reatment of samples was modified by adding PV P to grind and TN E buffer to p re2ext ract . The
DNA samples were analyzed by rest riction EcoR Ⅰ/ Mse Ⅰdouble enzyme digestion , agarose gel elect ro2
p horesis , and RA PD amplification. The J accard coefficient was worked out by N TSYS2pc sof tware , and a
cluster dendrogram of six samples was established based on U P GMA. Results 　The DNA could be ext rac2
ted , but not be completely rest ricted and effectively amplified , t he solution of the DNA became ropy and
brown by stored up at 4 ℃, which was ext racted f rom t he dried root s by routine DNA ext raction methods.
After t he samples of t he dried root s were p ret reated by PV P and TN E buffer , t he DNA ext racted by
CTAB met hod could be completely rest ricted and effectively amplified. The pret reat ment p rocess was t hat
samples of t he dried root s were ground wit h 3 % PV P and t hen ext racted wit h TN E buffer twice at 0 ℃,
each 30 min. The DNA ext racted wit h t he modified met hod f rom t he six dried root s samples could be di2
gested completely by rest riction endonuclease. Moreover , t he fingerp rint s were clear and stable by RA PD
with three selected primers. A total of 28 bands were amplified , among which 20 bands were polymorp hic ,
accounting for 71143 %. The cluster analysis indicated that t here was closer genetic relationship between
L QW Y and L X , L Q and FSH cultivars of B . chi nense , respectively. The relationship of cultivar SHL was
far f rom these of ot her five cultivars. Conclusion 　The DNA ext racted by routine DNA ext raction met hods
could be completely rest ricted and effectively amplified af ter t he samples of the dried root s are p ret reated
by PV P and TN E buffer .
Key words : B u pleurum chi nense DC. ; dried root s ; genomic DNA ; RA PD
　　《中国药典》(2005 年版)收载柴胡药材仅有柴胡
B u pleurum chi nense DC.和狭叶柴胡B . scorz oneri2
f ol i um Willd. 2 种植物 ,而混用品种则有十余个 ,
仅通过性状、显微及理化鉴别方法较难鉴别各品种
药材。分子标记技术广泛应用于中药资源遗传分
析 ,使药材鉴别成为可能。已有关于柴胡 ITS 序
列[1 ,2 ]及 RA PD 分析[3 ,4 ]等遗传多样性的报道 ,但供
试材料均是柴胡幼嫩组织 ,而对于含有大量次生代
谢产物的药材干根 ,经过加工、炮制、贮藏 ,采用常规
DNA 提取方法提取药材干根 DNA 溶液黏稠并褐
变 ,严重影响酶切和 RA PD 扩增。虽然在上述方法
基础上也有许多关于药材干根 DNA 改进方法的报
道[5～7 ] ,但解决该问题尚未形成完整的思路。所以 ,
针对不同药材进行 DNA 提取方法的摸索是很有必
要的。因此本实验探索适合于柴胡干根 DNA 提取
方法并进行 RA PD 分析 ,为柴胡药材辨别真伪奠定
基础。
1 　材料与方法
111 　材料和试剂 : 6 个栽培品种柴胡 B . chi nense
DC. 为两年以上生干燥根 ,晾干或晒干 ,采自山西陵
川中药材规范化种植基地 ,见表 1。λDNA/ H i nd
Ⅲ酶切 Marker , Promega ;聚乙烯吡咯烷酮 ( Polyvi2
nylpyrrolidone K30 , PV P K30) 、十二烷基硫酸钠
　 表 1 　供试样品材料
Table 1 　Plant materials tested
序号 原产地 简称 种源
01 山西灵丘 LQW Y 外地引种
02 山西灵丘 LQ 灵丘　　
03 山西陵川 LCH 陵川　　
04 山西方山 FSH 陵川　　
05 甘肃陇西 L X 不明　　
06 陕西商洛 SHL 不明　　
(sodium dedecyl sulfate , SDS) ,上海生工生物工程
有限公司 ;β2巯基乙醇 (β2mercaptoet hanol ) ,美国
BBI ;十六烷基三乙基溴化铵 (cetylt rimet hylammo2
nium bromide , CTAB) 、Tris、乙二胺四乙酸 (et hyl2
enediaminetet raacetic acid , ED TA) 、无水乙醇、异
丙醇和石英砂等均为国产分析纯试剂。
112 　柴胡干根 DNA 的提取及酶切检测 :分别采用
CTAB 法[8 ] 、SDS 法[9 ] 和高盐低 p H 法[10 ] (图中分
别简称为 CTAB、SDS、HSLp H) 提取样品 DNA。
选用序号为 01 的柴胡干根 ,用无菌手术刀片刮弃表
皮 ,剪碎混合称质量 ,每份 0108 g ,置于灭菌研钵中 ,
加入 2 倍质量的石英砂 ,于冰浴快速研磨。用琼脂
糖凝胶电泳检测提取 DNA 的质量并用限制性内切
酶 EcoR Ⅰ和 Mse Ⅰ(购自 MBI 公司) 进行双酶切
检测 ,酶切反应在 20μL 体系中进行 ,其中含 4μL
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50 ng/μL DNA 模板 ; 10 ×Buffer Tango TM (含
BSA) 4μL ; EcoR Ⅰ(10 U/μL ) 014 μL ; Mse Ⅰ
(10 U/μL) 014μL ; dd H2 O 补足。酶切反应条件为
37 ℃温育 3 h ,65 ℃温育 3 h ,80 ℃处理 20 min ,
114 %琼脂糖凝胶电泳进行分析。
113 　柴胡干根提取方法的优化 :样品预处理方法的
优化 , (1)将除去表皮的柴胡干根样品剪碎 ,每份称
取 0108 g ,分别置于含有一定量石英砂、灭菌、冰浴
冷却的研钵中 ,分别加入 CTAB 法抽提液体积 0、
1 %、2 %、3 % ( W/ V) PV P 粉末 ,冰浴快速研磨 ,分
别转入 2 mL 离心管中 ,然后加入 1 mL CTAB 抽提
液 ,按 CTAB 法[8 ] 提取 DNA。(2) 在选定 PV P 加
入量的条件下研磨样品 ,转入 2 mL 离心管中 ,加入
115 mL TN E 缓冲液 (即 100 mmol/ L Tris、0115
mol/ L NaCl 和 20 mmol/ L ED TA ) 分别以不同温
度和不同的浸提次数进行样品预处理 ,每次 30
min ,温度分别设置为 0、25、37、65 ℃,提取次数分
别为 1～3 次 , TN E 缓冲液事先预温至相应温度 ,然
后按 CTAB 法[ 8 ] 提取 DNA。并设计对照试验 ,即
用 PV P 研磨样品后直接用 CTAB [8 ] 法提取 DNA。
将选择的条件应用于 6 个柴胡干根样品 DNA 的
提取。
114 　柴胡样品 DNA 的检测 :将提取的 DNA 以
018 %琼脂糖凝胶电泳检测和限制性内切酶 EcoR
Ⅰ/ Mse Ⅰ酶切 ,酶切产物以 114 %琼脂糖凝胶电泳
检测 ,在 SYN GEN E ( GDS28000 ,英国) 凝胶成像系
统观察、拍照。
115 　柴胡干根样品 RA PD 分析 :用优化的 CTAB
法提取 6 种柴胡干根基因组 DNA ,以提取的 DNA
为模板 ,引物、扩增体系和反应程序按照文献方法进
行 RA PD 分析[3 ,11 ] ,所选引物编号分别为 OPC22、
OPC27、O PD28 和 OPD211 (由北京奥科生物技术公
司合成) ,扩增产物用 210 %琼脂糖凝胶电泳检测。
116 　数据处理 :每个样品的扩增带按有 (1)或无 (0)
记录 ,从而得到原始数据矩阵 ,计算多态性条带比
率 ,用 N TSYS2pc 软件计算各栽培品种间的 J accard
遗传相似系数 ,按非加权配对算术平均法 ( U P G2
MA)建立各栽培品种间的聚类图。
2 　结果与分析
211 　柴胡干根 DNA 提取及检测 : 分别以常规
CTAB 法、SDS 法和高盐低 p H 法提取柴胡干根
DNA ,该 3 种方法所提 DNA 溶液颜色深浅不一 ,
CTAB 法和 SDS 法所提 DNA 为浅黄色 ,高盐低
p H 法为深黄色。对提取 DNA 进行琼脂糖凝胶电
泳检测 ,结果表明 ,3 种方法均能提出样品 DNA ,并
呈一条明亮条带 (图 12A1) ,但提取的 DNA 经 EcoR
Ⅰ/ Mse Ⅰ双酶切均不能被酶切 (图 12A2) 。经 4 ℃
放置后 ,DNA 溶液均产生不同程度的黏稠 ,颜色变
深 ,甚至呈褐色 ,均不能被酶切和 PCR 扩增。由于
3 种方法均能提出样品 DNA ,因此 ,选择 CTAB 法
并进行柴胡干根 DNA 提取方法的优化。
12CTAB 　22SDS 　32HSLp H 　420 PVP
521 % PVP 　622 % PVP 　723 % PVP
3 种提取方法 (Al)及其 EcoR Ⅰ/ Mse Ⅰ双酶切 (A2)
研磨时加入 PVP 的浓度 (BI)及其 DNA 双酶切 (B2)
Met hods of DNA ext raction (Al) and f ragment s of enzyme
digestion of DNA (A2) ; Concent ration of PVP (B1)
and f ragment s of enzyme digestion of DNA (B2)
图 1 　柴胡干根 DNA的提取及 EcoR Ⅰ/ Mse Ⅰ酶切
Fig. 1 　Extraction of DNA from B. chinense dried roots
and enzyme digestion by EcoR Ⅰ/ Mse Ⅰ
212 　DNA 提取方法的优化
21211 　PV P 添加量对 DNA 提取的影响 :在研磨时
分别加入 1 %、2 %和 3 % PV P ,经 CTAB 法提取
DNA ,与未加 PV P 相比 ,不同 PV P 添加量所提
DNA 基本无色 ,而前者呈浅黄色。DNA 电泳检测 ,
结果表明 :添加不同量的 PV P ,DNA 带型均呈单一
主条带 ,亮度基本一致 (图 12B1) ,但均不能被 EcoR
Ⅰ/ Mse Ⅰ酶切完全 (图 12B2) 。经 4 ℃放置后 ,
DNA 溶液均有不同程度的黏稠现象 ,而 3 % PV P
呈颜色最浅 ,因此 ,选择 3 % PV P ,但是还需要进一
步对样品中的代谢产物进行处理。
21212 　TN E 缓冲液浸提温度对提取 DNA 的影
响 :选择 3 % PV P 研磨材料后 ,以 TN E 缓冲液在不
同温度下浸提 30 min ,然后经 CTAB 法提取 DNA ,
检测结果表明 ,在 4 个浸提温度下 ,DNA 带型均有
一亮带 (图 22A1) ,但于 65 ℃浸提所提的 DNA 条带
较暗 ,DNA 损失严重 ,而在 25、37、65 ℃浸提所得
DNA 不能完全酶切 ,0 ℃酶切充分 (图 22A2) ,故选
择 0 ℃为最适浸提温度 ,在 4 ℃静置后 DNA 溶液
·944·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
颜色均较淡 ,但 0 ℃浸提所得 DNA 溶液黏度较高 ,
因此又增加了 0 ℃浸提次数。
21213 　TN E 缓冲液浸提次数对提取 DNA 的影
响 :在 0 ℃下用 TN E 缓冲液对研磨材料浸提不同
次数 ,每次 30 min ,再经 CTAB 法提取 DNA ,检测
结果如图 22B 所示 ,洗涤不同的次数 ,DNA 带型均
有一亮带 ,均能被 EcoR Ⅰ/ Mse Ⅰ酶切 ,但浸提 2
次后 ,4 ℃静置后 DNA 溶液颜色均无色 ,黏度明显
降低 ,因此 ,选择 0 ℃下用 TN E 缓冲液对研磨材料
浸提 2 次。
12无 TN E 缓冲液　220 ℃　3225 ℃　4237 ℃　5265 ℃
6、8、102不同浸提次数 ,分别为 1、2、3 次
7、9、112分别为 6、8、10 的双酶切片段
不同浸提温度 (Al)及其 DNA 双酶切 (A2)
不同浸提次数及其提取 DNA 双酶切 (B)
12wit hout TN E buffer 　220 ℃　3225 ℃　4237 ℃　5265 ℃
6 ,8 , and 102different times of pre2washing : once , twice ,
and t hrice , respectively ; 7 ,9 , and 112f ragment s
of enzyme digestion of 6 , 8 , and 10 , respectively
Pret reating temperature of TN E buffer (Al) and f ragment s
of enzyme digestion of DNA (A2) ; Different times of pre2
washing and fragment s of enzyme digestion of DNA (B)
图 2 　TNE缓冲液预处理对 DNA提取及 EcoR Ⅰ/ Mse Ⅰ
酶切的影响
Fig. 2 　Effects of TNE buffer on DNA extracted
and enzyme digestion by EcoR Ⅰ/ Mse Ⅰ
213 　柴胡干根样品 RA PD 分析 :用该优化的方法
提取编号为 01～06 号 (表 1) 的 6 个柴胡干根样品
DNA ,DNA 检测如图 3 所示 ,该法所提 DNA 均呈
单一明亮条带 ,所得 DNA 经 EcoR Ⅰ/ Mse Ⅰ双酶
切 ,酶切充分。以所提 DNA 为模板 ,按文献选择引
物进行 RA PD 检测[ 3 ,11 ] ,结果见图 4。4 条引物中 ,3
条引物能够有效扩增 (图 42A、B、C) ,共扩增出 28
个条带 ,多态性条带为 20 条 ,占总扩增条带数的
71143 %。扩增片断主要分布在 200～2 000 bp ,约
280 bp 均有一条明亮的主条带 ,DNA 指纹图谱可
将柴胡 B . chi nense DC. 6 个不同的栽培品种干根
进行区分和鉴别 ,并与幼叶获得的 DNA 指纹图谱
一致 (文中没有显示) 。
214 　柴胡种质资源的聚类分析 :以 J accard 相似性
系数为依据 ,构建柴胡 6 个栽培品的聚类图 (图 5) 。
由聚类图看出 ,6 个柴胡栽培品划分为明显的 3 个
类群 :类群 Ⅰ包括原产于山西灵丘 (L QW Y)和甘肃
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陇西 (L X)的柴胡栽培品、原产于山西灵丘 (L Q) 和
山西方山 ( FSH) 的柴胡栽培品 ,前两者、后两者彼
此首先聚在一起 ,表明亲缘关系较近 ;类群 Ⅱ为原产
于山西陵川 (L CH)的柴胡栽培品 ;与其他 5 个栽培
品亲缘关系较远的陕西商洛 ( SHL ) 的柴胡栽培品
单独聚为类群 Ⅲ。
3 　讨论
高质量 DNA 的制备是开展分子生物学工作的
基础。对于新鲜幼嫩的材料而言 ,植物基因组 DNA
的提取已有较为行之有效的方法 ,而中药材样品来
源复杂 ,含有大量的多糖和多酚等次生代谢产物 ,严
重影响 DNA 的提取质量。据文献报道[5 ,6 ] :采用
CTAB 法、SDS 法、苯酚法、高盐低 p H 等方法提取
不同药材干根的 DNA ,所提 DNA 溶液黏稠、易褐
变 ,酶切不完全 ,影响 PCR 扩增 ,导致 DNA 指纹图
谱不一致 ,甚至不能扩增。在这些方法的基础上也
有许多改进方法的报道[5～7 ] ,已涉及黄连、石斛、西
洋参、半夏、人参、三七等药材干根的 DNA 的提取 ,
但解决该问题尚未形成完整的思路。因此 ,针对不
同药材进行 DNA 提取方法的摸索是很有必要的。
针对柴胡而言 ,幼嫩的叶片和根等材料含次生
代谢物较少 ,而药材干根中含有柴胡皂苷、多酚和多
糖等多种次生代谢物 ,用常规方法在提取 DNA 过
程中 ,次生代谢产物与 DNA 结合或残留在溶液中 ,
影响所提 DNA 的双酶切和 PCR 扩增 ,4 ℃静置黏
稠呈胶状 ,氧化变色。因此针对这一问题 ,本研究通
过以柴胡干根药材为材料 ,提出了含代谢产物量高
的材料首先针对性地进行分离其代谢产物的思路 ,
在该思路的指导下进行 DNA 的提取。本研究结合
柴胡药材干根代谢产物丰富的特点 ,针对提取过程
中多酚类物质与 DNA 结合并影响 DNA 质量的问
题 ,首先在材料研磨时加入 PV P ,它与多酚结合形
成复合物可有效避免多酚物质的氧化及由多酚类化
合物介导的 DNA 降解[12 ] 。而针对多糖会增加提取
DNA 黏稠度的现象 ,以 TN E 缓冲液浸提研磨后的
样品并适当增加浸提次数 ,可有效地除去部分多酚
和多糖等次生代谢物质 ,虽然提取 DNA 有损失 ,却
明显提高了 DNA 的质量。但浸提温度较高时所得
DNA 质量较低 ,可能由于温度较高促使浸提液中的
多酚等物质与核中的 DNA 结合。因此 ,本研究认
为在样品研磨过程中加入 PV P 后 ,用 TN E 缓冲液
浸提 ,减少了干扰 DNA 质量的物质。
本研究以琼脂糖凝胶电泳和双酶切为检测指
标 ,柴胡药材干根样品预处理后经 CTAB 法提取获
得了高质量的 DNA ,优化的预处理条件为研磨材料
时加入 3 % PV P , TN E 缓冲液于 0 ℃浸提 2 次 ,每
次 30 min。以该方法提取了 6 个柴胡药材干根样
品的 DNA ,且酶切完全 ,RA PD 分析 ,6 个北柴胡品
种扩增图谱明显不同 ,多态性条带占 71143 % ,条带
清晰 ,多态性好 ,扩增结果与幼叶一致。因此 ,该法
适合于柴胡干根材料基因组 DNA 的提取。DNA
提取前先进行预处理可最大程度地降低由大量次生
代谢产物造成的对药用植物干组织 DNA 提取时的
干扰 ,因而该法可广泛应用于含次生代谢产物量高
的药用植物 DNA 的提取。
而从聚类结果来看 ,原产于山西陵川 (L CH) 和
山西方山 ( FSH)的柴胡栽培品的种源都是陵川 ,但
二者并没有聚到一起。原产于山西灵丘 (L QW Y和
L Q) 、方山 ( FSH)的栽培品聚为类群 Ⅰ,亲缘关系较
近 ,但同样原产于山西陵川 (L CH) 的栽培品单独聚
为类群 Ⅱ,而原产于陕西商洛 ( SHL ) 的栽培品单独
聚为类群 Ⅲ,由此看来 ,柴胡系统演化规律与其地理
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