全 文 ：Cratox y lum f ormosanum [J ]1 Phytochemist ry , 1996 , 42
(4) : 11951
[ 14 ] 　Chen T , Li J , Cao J , et al1 A new flavanone isolated f rom
rhizoma smilacis glabrae and t he st ructural requirement s of it s
derivatives for preventing immunological hepatocyte damage
[J ]1 Planta Med , 1999 , 65 (1) : 561
[ 15 ] 　植　飞 , 孔令义 , 彭司勋1 中药大蓟的化学及药理研究进展
[J ]1 中草药 , 2001 , 32 (7) : 66426671
[ 16 ] 　贾天柱 , 谢 　明 , 许韵梅 1 日本对止血药及炭药研究简介
[J ]1 中国中药杂志 , 1994 , 19 (9) : 54125421
[ 17 ] 　张振杰1 药用罗布麻 (红麻)叶的化学成分研究 [J ]1 中草药 ,
1974 , 5 (1) : 212241
[ 18 ] 　云南省药物研究所1 红八角莲治疗慢性气管炎有效成分的分
离 [J ]1 中草药 , 1977 , 8 (7) : 2961
[ 19 ] 　王兆金 , 王献龙1 红旱莲有效成分的研究 [J ]1 药学学报 ,
1980 , 15 (6) : 36523671
[ 20 ] 　西北植物研究所1 罗布麻叶治疗高血压临床观察 [J ]1 中草
药 , 1972 , 3 (4) : 121
[ 21 ] 　Saxena G , Farmer S W , Hancock R E , et al1 Chlorchimaphi2
lin : A new antibiotic f rom Moneses uni f olora [J ]1 J N at
Prod , 1996 , 59 (1) : 622651
[ 22 ] 　Kagawa K , Tokura K , Uchida K , et al1 Platelet aggregation
inhibitors and inot ropic constituent s in Py rolae herba [J ]1
Chem Pharm B ull , 1992 , 40 (8) : 2083220871
[ 23 ] 　王西发 , 张建民 ,曹爱兰 1 鹿衔草的化学成分 [J ]1 中草药 ,
1988 , 19 (1) : 82111
[ 24 ] 　张振凌 , 周　艳 , 黄显峰 , 茜草炭止血成分的研究 [J ]1 中成
药 , 2007 , 29 (12) : 1803218051
[ 25 ] 　Li J , Wang P F , Zheng R , et al1 Protection of Phenylpro2
panoid glycosides f rom Pedicularis against oxidative hemoly2
sis in vit ro [J ]1 Planta Med , 1993 , 59 (4) : 31523171
[ 26 ] 　Liu Z M , Jia Z J1 Phenylpropanoid and iridoid glycosides
f rom Pedicularis st riata [J ]1 Phytochemist ry , 1991 , 30 (4) :
13411
[ 27 ] 　Kasai R , Ogawa K , Ohtani K , et al1 Phenolic glycosides
f rom Nuo2Mi2Xang2Cao , a Chinese acant haceous herb [J ]1
Chem Pharm B ull , 1991 , 39 (4) : 92729291
[ 28 ] 　Miyase T , Yamamoto R , Ueno A1 Phenylet hanoid glycosides
f rom S tachys of f icinalis [J ]1 Phytochemist ry , 1996 , 43
(2) : 47524791
[ 29 ] 　佟如新 , 王普民 , 王梳春 , 等1 青花椒中活性成分香柑内酯
的止血作用实验研究 [J ]1 中国中医药信息杂志 , 1998 , 5
(11) : 142161
[ 30 ] 　林启寿1 中草药成分化学 [ M ]1 北京 : 科学出版社 , 19771
[ 31 ] 　Kosuge T , Ishida H , Satoh T1 Studies on antihemorrhagic
substances in herbs classified as hemostatics in Chinese medi2
cine1 Ⅳ1 On antihemorrhagic principles in H y pericum erec2
t um Thunb1 [J ]1 Chem Pharm B ull , 1985 , 33 (1) : 20222051
[ 32 ] 　Govindachari T R , Premila M S1 The benzofuran norwedelic
acid f rom Wedelia calendulaceae [J ]1 Phytochemist ry ,
1985 , 24 (12) : 3068230691
[ 33 ] 　Ronlan A , Wickberg B1 The st ructure of mezerein , a major
toxic principle of Daphne mezereum [J ]1 Tet rahedron L ett ,
1970 , 49 : 4261242641
[ 34 ] 　李清华1 小蓟止血成分的研究 [J ]1 中草药 , 1982 , 13 (9) : 92
121
[ 35 ] 　Ohnishi M , Morishitaa H , Iwahashi H , et al1 Inhibitory
effect s of chlorgenic acids on linoleic acid peroxidation and
haemolysis [J ]1 Phytochemist ry , 1994 , 36 (3) : 57925831
[ 36 ] 　秦文娟 , 吴秀娥 , 福山爱保 , 等 1 苦丁茶化学成分的研究
( Ⅱ) [J ]1 中草药 , 1988 , 19 (11) : 48624881
[ 37 ] 　Khan I A , Rali T , Sticher O1 Flavonoids and caffeic acid es2
ters f rom Dichrocephala bicolor [J ]1 Planta Med , 1993 , 59
(3) : 2881
紫杉醇前体生物合成途径及生物技术研究进展
刘万宏1 ,2 ,姚 　波1 ,祝顺琴2 ,廖志华2 3
(11 重庆科技学院 生物系 ,重庆 　401331 ; 21 西南大学生命科学学院 , 重庆 　400715)
摘 　要 :紫杉醇因其特殊的抗肿瘤作用成为当今天然产物研究的热门方向。综述了紫杉醇前体的生物合成途径及
途径上的酶和基因 ;利用红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇的方法 ;前体饲喂提高细胞紫杉醇产量、通过内生
真菌发酵生产紫杉醇及红豆杉遗传转化获取优质药源等相关研究。最后提出代谢工程策略是可能解决紫杉醇药
源缺乏的理想途径。
关键词 :紫杉醇 ;生物合成 ;遗传转化 ;内生真菌
中图分类号 :R28211 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821327205
Advances in studies on biosynthetic pathway of taxol precursor and its correlative biotechnology
L IU Wan2hong1 ,2 , YAO Bo1 , ZHU Shun2qin2 , L IAO Zhi2hua2
(11Department of Biology , Chongqing University of Science and Technology , Chongqing 401331 , China ;
21 School of Life Science , Southwest University , Chongqing 400715 , China)
Key words : taxol ; biosynt hesis ; genetic t ransformation ; endop hytic f ungi
　　紫杉醇 ( Taxol TM ) 是 20 世纪 70 年代由 Wani 等从短叶
红豆杉 Tax us brevi f olia Nutt1 树皮中提取出来的具有独特
抗癌作用的天然产物 [1 ] ,是目前最好的天然抗癌药物之一 ,
为治疗卵巢癌、乳腺癌的首选药物 ,对白血病、肺癌、脑癌、直
肠癌和其他一些实体瘤等均有很好的疗效 ,并且其不良反应
很小 [2 ] 。在今后较长的一段时间内 ,紫杉醇将仍然是治疗癌
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3 收稿日期 :2009202225　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (紫杉醇前体依赖于 MEP 途径合成的分子调控机理 ,30771238)
作者简介 :刘万宏 (1979 —) ,男 ,江西峡江人 ,讲师 ,硕士。主要从事药用植物次生代谢工程研究。
E2mail :liuwanh @163. com 　Tel : (023) 65022209
症的首选药物之一。由于紫杉醇的药源植物红豆杉是国家
重点保护野生植物 ,生长缓慢且紫杉醇产量非常低 ,所以从
天然红豆杉中提取的紫杉醇远远不能满足人们对紫杉醇日
益增长的需要 ,同时紫杉醇的神奇疗效和药源的严重短缺使
其价格极为昂贵。近年来 ,寻找及扩大紫杉醇药源是一个十
分活跃的研究领域 ,并取得了较大的进展 ,主要包括以下 4
个方面 : (1)利用传统育种技术培育红豆杉栽培品种 ; (2) 化
学合成紫杉醇 [3 ] ; (3) 分离培养与红豆杉共生的产紫杉醇微
生物 [4 ,5 ] ; (4)利用植物细胞培养技术生产紫杉醇 [6 ,7 ] 。紫杉
醇前体生物合成途径的分子生物学研究是开展紫杉醇基因
工程的必要前提。因而克隆紫杉醇前体合成途径上的基因 ,
进行功能验证和表达研究 ,考察目的基因在紫杉醇生物合成
途径中的作用 ,确定其中的限速反应和鉴定编码关键酶的基
因 ,进而为紫杉醇代谢工程提供候选基因和作用靶点。本文
就紫杉醇前体生物合成途径的分子生物学和生物化学 ,及生
物技术在扩大紫杉醇药源中的应用进行系统综述。
1 　紫杉醇前体生物合成途径
萜类物质的生物合成均以 C5 活性单位异戊烯焦磷酸
(isopentenyl diphosphate , IPP)与其异构体二甲基烯丙基焦
磷酸 (dimethylallyl diphosphate , DMA PP) 头尾相连合成香
叶基焦磷酸 (geranyl diphosphate , GPP , C10) ,继而 GPP 与
IPP 在酶促反应下形成更大的异戊烯焦磷酸如法尼基焦磷
酸 (farnesly diphosphate , FPP , C15)和香叶基香叶基焦磷酸
(geranylgeranyl diphosphate , GGPP , C20) ,其中可能通过
环化、耦联、分子重排产生倍半萜和二萜的碳骨架 [8 ] 。在红
豆杉中 ,紫杉醇的生物合成途径分为 3 个部分 :一是合成萜
类化合物的通用前体 IPP 和 DMAPP ;二是以 GGPPS 为起
点经过约 20 步酶促反应合成紫杉醇母核 102去乙酰基巴卡
亭 Ⅲ(102deacetylbaccatin Ⅲ,102DAB) 或巴卡亭 Ⅲ( baccatin
Ⅲ) ;三是合成与紫杉醇母核 C213 位相连的苯基异丝氨
酸链。
植物萜类 (包括紫杉醇) 前体物质 IPP 和 DMA PP 通常
可由两条不同 ,但存在 IPP 相互转运的生物途径完成合成 :
一是经典的甲羟戊酸 (又名甲瓦龙酸 , mevalonic acid ,
MVA)途径 ;另一是 22C2甲基2D2赤藓醇242磷酸 (22C2methyl2
D2erythritol242phosphate , MEP)途径 [9 ] (图 1) 。长期以来 ,
紫杉醇前体物 IPP 一直被认为是经甲羟戊酸途径合成的 ,但
近年来 ,经13 C 标记对植物和微生物萜类物质生物合成途径
进行研究却发现许多与甲羟戊酸途径不一致的结果 ,并证明
紫杉醇前体物的合成来自于新近发现的 MEP 途径 [10 ] 。故
在紫杉醇前体合成途径论述中主要以 M EP 途径上的基因
与酶为主。
图 1 　紫杉醇前体生物合成途径
Fig. 1 　Biosynthetic pathway of Taxol precursor
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2 　紫杉醇前体合成 MEP途径中已克隆的基因
近年来 ,基因组学和生物信息学的快速发展 ,给植物代
谢组学的研究带来了革命性的变化 ;自从 MEP 途径于 1994
年首次在植物中发现以来 ,由于分子遗传学和生物化学研究
取得了很大进展 ,该途径中的所有基因在植物中都被克隆得
到。本文将紫杉醇前体生物合成中 MEP 途径上已经克隆的
4 个基因综述如下。
2. 1 　12脱氧2D2木酮糖252磷酸合成酶 ( D X S) : D X S 是 MEP
途径上的第一个酶 ,也是第一个关键酶 ,该反应依赖于硫胺
素焦磷酸 (thiamine pyrophosphate) ,其作用是催化丙酮酸和
32磷酸甘油醛 ( G3P) 生成 12脱氧2D2木酮糖252磷酸。在拟南
芥 A rabi dopsis thaliana (L1 ) Heynh1 中 ,突变体 clal21 由于
缺失 D X S 基因而呈现“白化”特征 ,当添加 12脱氧2D2木酮糖
(12deoxy2D2xylulose , DX) 后发现有新的色素生成 ,并证实
D X S 对植物叶绿体及白色体的发育具有重要的作用 [11 ] 。
MEP 途径上其他基因通常都只有一个拷贝 (单基因) ,而众
多数据表明 D X S 在植物基因组中有一个小基因家族 [9 ] 。在
挪威云杉 Picea abies (L1 ) Karst1 中 , D X S 家族包含 3 个功
能不尽相同的基因 PaD X S1、PaD X S2A 及 PaD X S 2B 。其
中 PaD X S1 在树皮中表达量不受到伤害及真菌诱导的影
响 ,为一组成型表达基因 ;在诱导子诱导下 , PaD X S2A 响应
壳聚糖、甲基水杨酸以及真菌 Ceratocystis polonica 刺激 ,
PaD X S2B 能对甲基茉莉酸和壳聚糖的诱导做出应答 ,但对
甲基水杨酸和真菌 C1 polonica 的诱导没有任何响应 ,揭示
D X S 基因家族在防御食草动物或真菌侵袭起到不同的作
用 [12 ] 。在萜类物质的合成中 , D X S 扮演了一个重要的角色。
在宽叶薰衣草 L avandula lati f ol ia Vill1 中转入拟南芥的
D X S 基因 ,随着该基因的表达上调 ,转基因植株中精油的产
量在叶和花中均有提高 ,叶中最高可增加 359. 0 % ,花中最高
可增加 74. 1 %[13 ] 。由此可见 , D X S 是植物萜类前体生物合
成中的关键酶和实现萜类代谢工程的重要靶点。Liao 等从
曼地亚红豆杉 Tax us media Rehd1 中首次克隆到 D X S 基因
( GenBank Accession number : A Y644708) , TmD X S 基因全
长 1 776 bp ,编码 476 个氨基酸。然而目前还未见红豆杉
D X S 基因功能分析及其在紫杉醇合成中的作用等相关研究
报道。可以推断 ,利用红豆杉基因工程生产紫杉醇 ,提高代
谢靶标产物的积累 , D X S 将是一个重要的代谢工程靶点。
2. 2 　12脱氧2D2木酮糖252磷酸还原异构酶 ( D X R) :在位于质
体的 MEP 途径中 , D X P 经过 D X R 催化 ,以 NADPH 作为还
原剂 ,并依赖二价阳离子 ,经原子重排和还原生成 MEP[14 ] 。
在拟南芥中 ,D X R 是一个单基因编码的蛋白 ,在所比对的所
有植物蛋白序列中 , N 端均含有定位于质体的转运肽 ,且切割
位点保守 ;通过缺失 D X R 基因的致死突变 E1 coil 菌株
EcAB122 验证了 D X R 蛋白的功能 ;克隆 D X R 基因的启动子
序列 ,构建表达 GUS 蛋白的载体 ,证明 D X R 是植物 MEP 途
径中限速酶[15 ] 。长春花 Catharanthus roseus (L1) G1 Don 中 ,
D X R 的表达量与单萜吲哚生物碱 (monoterpenoid indole alka2
loids , MIAs)的积累呈现显著的正相关 ,是萜类吲哚生物碱生
物合成重要的调节基因[16 ] 。Mahmoud 等[17 ] 以 D X R 的催化
步骤作为靶点之一 ,在薄荷 Mentha haplocaly x Briq1 中过量表
达来源于薄荷的 D X R 和薄荷呋喃合酶 ( menthofuran syn2
thase)两个基因 ,使得薄荷精油的量提高了 50 % ,表明突破
MEP途径中上游限速瓶颈 ,可以实现对目标产物的代谢工程
生产。在青蒿素的代谢工程研究中 ,利用大肠杆菌重建青蒿
素前体生物合成途径 , D X R 催化步骤也为首选靶点之一[18 ] 。
可以推断 ,要提高红豆杉中紫杉醇的量 , D X R 是一个很有效
的代谢工程靶点。迄今为止 ,仅见郑清平等[19 ]克隆了中国红
豆杉 Tax us chinensis (Pilger) Rehd1 D X R 基因的 535 bp 核心
片段 ( GenBank Accession number : A Y445651) ,Liao 等克隆了
曼地亚红豆杉 D X R 的 cDNA 全长 ( GenBank Accession num2
ber : A Y5882482) ,还未见关于红豆杉 D X R 基因功能鉴定及其
在紫杉醇生物合成中作用的研究报道。因而克隆和鉴定红豆
杉 D X R 基因有助于在分子水平阐明紫杉醇前体生物合成的
一个限速反应 ,为紫杉醇的代谢工程提供一个理想的候选基
因和作用靶点。
2. 3 　22C2甲基2D2赤藓醇242磷酸胱氨酰转移酶 ( M EC T) :
M EC T 属于胞嘧啶转移酶家族的一个成员 ,其参与催化
MEP 途径的第 3 步酶促反应 ,将 CDP 和 MEP 连接生成
CDP2ME ,该酶促反应依赖于胞苷三磷酸 (CTP) 。Shi 等 [20 ]
克隆并表达了来源结核分枝杆菌 H37RV ( M ycobacteri um
tuberculosis H37Rv) 的 M EC T 基因 ,发现 MtM EC T 具有很
高的嘧啶碱基特异性且依赖于二价阳离子 ,Mg2 + 存在时酶
活性最高。在植物中 ,编码 M EC T 的基因和 M EC T 酶已从
拟南芥、银杏 Gink go bi loba L1 中获得 ,但对酶功能的研究未
见报道 [21 ] 。为验证 M EC T 蛋白功能 , Rohdich 等 [22 ] 提取大
肠杆菌的 M EC T ,将其参与催化 14 C 标记的 MEP 途径上的
酶促反应 ,结果生成带有14 C 的 CDP2M E ,将已标记的 CDP2
ME 转入辣椒 ,在辣椒质体中检测到 CDP2ME 参与了类胡萝
卜素生物合成 ,揭示 M EC T 在萜类生物合成中起到重要的
作用。刘万宏等 [23 ]首次从曼地亚红豆杉中克隆到编码该蛋
白的基因 TmM EC T ( GenBank Accession number : EF5342
010) ,cDNA 序列全长 1 301 bp ,推测编码 312 个氨基酸残基
的多肽 ;组织差异表达谱显示该基因在叶和树皮表达量较
高 ,并采用颜色互补的方法验证了基因功能 ,为开展紫杉醇
代谢工程提供了候选基因。
2. 4 　22C2甲基赤藓醇22 , 42环焦磷酸合成酶 ( M EC PS ) :
M EC PS 是 M EP 途径上的第 5 个酶 ,催化 CDP2MEP 生成
ME2cPP。由于 M EP 途径不存在于古细菌、真菌和动物中 ,
且 MEP 途径中的酶与哺乳动物中的蛋白同源性很低 ,使得
通过特异性地抑制途径来杀死病原菌成为可能。在结核分
枝杆菌中证实 M EC PS 可以作为治疗靶点 ,是具有潜在的药
物功能测定作用的重要基因 [24 ] 。长春花中 M EC PS 全长
cDNA 为 994 碱基 ,其 ORF 编码一个相对分子质量为 2. 5 ×
104 的 236 个氨基酸残基的多肽 ,该多肽的氨基酸序列与大
肠杆菌 M EC PS 有 48 %一致性 ,其 N 端有引导该酶定位于
质体的转运肽 ,长春花 M EC PS 基因的表达量与长春花中单
·9231·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
萜吲哚生物碱 ( M IA s ) 的积累正相关 ,表明 M EC PS 表达增
强有利于代谢向更下游的方向流动 [16 ] 。通过 Nothern 杂交
与原位杂交发现 , M EC PS 与其他 M EP 途径基因 ( D X S 和
D X R)及 MIAs 下游途径的基因 ( geraniol 102hydroxylase ,
G10 H)一样 ,均显示相同的细胞特异性表达模式 [25 ] ,揭示
M EC PS 在次生代谢产物合成途径中具有重要的地位。刘万
宏等 [23 ]从曼地亚红豆杉中克隆到编码该蛋白的基因 Tm2
M EC PS ( GenBank Accession number : EF534009) , cDNA
序列全长 899 bp ,推测编码 241 个氨基酸残基的多肽 ;组织
差异表达谱显示基因在叶和树皮表达量较高 ,并采用颜色互
补的方法验证该基因有效推动载有 pAC2BETA 质粒的大肠
杆菌β2类胡萝卜素积累 ,为绘制完整的 MEP 途径代谢图和
紫杉醇代谢工程提供候选基因和作用靶点。
3 　细胞培养合成紫杉醇的研究
3. 1 　培养基的选择 :传统生产紫杉醇的方法产量低下 ,不足
以满足需求 ,所以通过培养红豆杉细胞来生产紫杉醇是目前
解决紫杉醇要求的重要手段之一 [26 ] 。自 Christen 首次获得
的利用红豆杉细胞生产紫杉醇的专利以来 ,现已经建立了多
种红豆杉细胞培养系统 ,培养条件得到不断优化。在红豆杉
细胞培养中 ,通常选用 B5 培养基 ,而碳源以果糖为最佳 ,而
且在适当糖浓度下 ,紫杉醇的质量浓度可达到 1. 43 mg/
L [27 ] 。添加较低质量浓度的细胞分裂素 (小于 1 mg/ L) 和较
高质量浓度的 2 ,42D (1～8 mg/ L) 有利于愈伤组织的生长 ;
附加 0. 5 mg/ L 的 GA3 能显著促进愈伤组织的生长 ,但不影
响紫杉醇的量 [28 ] 。对紫杉醇生产而言 , IAA 与 BA 组合处理
是最好的方案 ,紫杉醇的产量可达 (14. 78 ±0. 86) mg/ L [29 ] 。
3. 2 　诱导子对紫杉醇合成的影响 :紫杉醇的积累通常认为
是红豆杉类植物对外界特殊刺激生物响应的结果 [30 ] 。诱导
子是可以调节代谢途径上基因活性以改变代谢强度的一类
物质 ,包括植物激素、无机盐、NO、乙烯、真菌培养物等。在
红豆杉细胞培养研究中 ,添加 100μmol/ L 的甲基茉莉酸能
促进紫杉醇的合成 ,产量可达 14. 4 mg/ L [29 ] 。将 NO 作用于
云南红豆杉 Tax us y unnanensis Cheng et L1 K1 Fu 细胞发现
能提高苯基丙氨酸氨基裂解酶活性 ,并且增加了紫杉醇的积
累 ;20 mg/ L 水杨酸与 MVA 途径专一抑制剂 Mevastatin 同
时添加到南方红豆杉 Tax us chinensis ( Pilger) Rehd1 var1
mai rei (Lemee et Lévl1 ) Cheng et L1 K1 Fu 细胞中发现细
胞死亡 ,但每克干质量细胞紫杉醇的量可达 1. 626 mg。证实
水杨酸促进紫杉醇的合成主要是通过增加 IPP 的产量 ,此结
果与紫杉醇前体物质依赖于 MEP 途径的事实相吻合 [7 ] 。
Expósito 等用不同浓度的紫杉醇刺激欧洲红豆杉 Tax us
baccata 细胞发现 ,在添加 200 mg/ L 外源紫杉醇时 ,紫杉醇
产量为对照组的 32. 7 倍 ,但细胞活力有所下降 ;而且通过
RT2PCR 方法检测编码紫杉二烯合酶 ( taxadiene synthase ,
TS) 与 D X S 的基因发现 ,外源紫杉醇明显诱导 2 个基因的
表达 ,推测紫杉醇本身是主要的诱导因子 [31 ] 。
4 　产紫杉醇内生真菌的研究
Stierle 首次从太平洋红豆杉树皮韧皮部中分离到一个
新菌种 Taxom yces and reanae ,培养 3 周后发现具有稳定生
产紫杉醇的能力 ,产量为 24～50 ng/ L ,此举开创了利用内生
真菌发酵生产紫杉醇的先河 ,成为当今紫杉醇生物合成研究
的热点之一 [4 ] 。近年来 ,发现几乎所有的红豆杉植物都含有
产紫杉醇真菌 ,且真菌的宿主多样。Li 等 [32 ] 将产紫杉醇内
生真菌 Fusari um mai rei 培养液 ( endophytic fungi culture
broth , EFCB)添加至东北红豆杉悬浮细胞中 ,紫杉醇最高产
量可达 6. 11 mg/ L ,比对照细胞高 2～6. 8 倍 ;采用细胞与真
菌共培养较 EFCB 处理细胞 ,紫杉醇产量提高 2 倍以上 ,可
见内生真菌对红豆杉细胞生产紫杉醇具有重要意义。Zhang
等 [33 ]以紫杉醇生物合成途径中去乙酰基巴卡亭 Ⅲ210β2O2乙
酰基转运酶基因和 C213 类苯基丙烷侧链乙酰 CoA 转运酶基
因为分子标记 ,采用 PCR 技术从来源于曼地亚红豆杉和云
南红豆杉的 90 株内生真菌中筛选出 3 株产紫杉醇真菌 ,测
定结果为每克干质量菌丝含 100～160μg 紫杉醇。从生态
保护和经济角度来看 ,利用微生物发酵比传统提取或半合成
的方法具有生产周期短、操作简单、产量稳定的优势 ,但都存
在紫杉醇产量低 ,难以进行工业化生产的难题。
5 　红豆杉的遗传转化的研究
随着植物中 M EP 途径上的基因与酶的全面报道 ,这些
基因与酶如何有效利用及紫杉醇代谢工程的实现 ,关键技术
就是建立稳定高效的红豆杉遗传转化体系。对于红豆杉的
遗传转化也进行了有益探索 ,通过构建 pCAMBIA1302 +
GFP 双元载体 ,转化东北红豆杉 Tax us cus pi data Sieb1 et
Zucc1 悬浮细胞 ,Western Blot 杂交检测到 GFP 蛋白 (green
fluorescent protein) 在细胞中表达 ,揭示红豆杉转入外源
GF P基因能够瞬时表达 [34 ] 。利用发根农杆菌 LBA9402 侵
染曼地亚红豆杉获得毛状根 ,并且在 100μmol/ L 的甲基茉
莉酸诱导下 ,每克干质量毛状根中的紫杉醇的量从 69μg 提
高到 210μg[35 ] 。然而 ,这些遗传转化的方法并不能维持转
基因毛状根或细胞遗传稳定性 ,对大规模生产无可操作性。
Ketchum 等 [36 ]分别用野生型发根农杆菌 A TCC15834 携带
双元载体 pCAMBIA1301 根癌农杆菌 EHA105 携带双元载
体 pCAMBIA1305. 2 转化东北红豆杉 ;用野生型发根农杆菌
A TCC25818 携带双元载体 pCAMBIA1301 转化中国红豆
杉。两个转基因东北红豆杉细胞株可以维持培养 20 个月以
上 ,而转基因中国红豆杉细胞株可以维持培养 9 个月以上。
揭示红豆杉遗传转化技术可稳定继代遗传 ,为紫杉醇代谢工
程打下坚实基础。
6 　展望
在这些不同研究领域中 ,培育高产紫杉醇的红豆杉栽培
品种所需周期长、效率低 ,紫杉醇产量提高有限 ;紫杉醇化学
全合成虽然已经成功 ,但是合成的步骤复杂 ,其他有毒或无
用的副产品多 ,紫杉醇产率太低 ,使得紫杉醇的全化学合成
成本高且不具有商业前景 ;生产紫杉醇的微生物绝大多数是
与红豆杉共生的真菌 ,所含紫杉醇极微 ,并且这些真菌的培
养和大规模发酵很困难 ,菌株的衰退也是一个难题 ,到目前
还未见产业化前景。相比之下 ,利用基因工程遗传改良红豆
·0331· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
杉 ,开展紫杉醇代谢工程研究 ,进而生产紫杉醇就具有很大
优势 ,主要表现在 : (1) 红豆杉离体培养和遗传转化的成功 ,
为利用基因工程技术遗传改良红豆杉奠定了良好的实践基
础 ; (2)把植物次生代谢途径中的关键酶基因导入植物或其
他物种中高效表达用于生产有用的次生代谢物质有诸多成
功报道。因而代谢工程是将来生产紫杉醇的理想途径 ,紫杉
醇前体生物合成分子生物学研究在这方面起到决定作用 ,为
最终实现紫杉醇商业化生产奠定理论基础。
参考文献 :
[ 1 ] 　Wani M C , Taylor H L , Wall M E , et al1 Plant antitumor a2
gent s : The isolation and st ructure of taxol , a novel antileuke2
mic and antitumor agent f rom Tax us brevi f ol ia [J ]1 J A mer2
ican Chem S oci , 1971 , 93 : 2325223271
[ 2 ] 　Goldspiel B R1 Clinical overview of t he taxanes [J ]1 Pharma2
cot herap y , 1997 , 17 : 11021251
[ 3 ] 　Nicolaou K C , Yang Z , Liu J J , et al1 Total synt hesis of tax2
ol [J ]1 N ature , 1994 , 367 : 63026341
[ 4 ] 　Stierle A , St robel G , Stierle D1 Taxol and taxane production
by Taxom yces andreanae , an endophytic fungus of Pacific
yew [J ]1 Science , 1993 , 260 (5105) : 21422161
[ 5 ] 　金　涛 , 王　伟 , 刘　军 , 等 1 东北红豆杉内生真菌的分离
及产紫杉醇菌的鉴定 [J ]1 中草药 , 2007 , 38 (5) : 77027721
[ 6 ] 　Zhong J J1 Plant cell culture for production of paclitaxel and
ot her taxane [J ]1 B iosci B ioeng , 2002 , 94 : 59125991
[ 7 ] 　Wang Y D , Yuan Y J , Wu J C1 Induction studies of met hyl
jasmonate and salicylic acid on taxane production in suspen2
sion cultures of Tax us chinesis var1 mai rei [J ]1 B iochem Eng
J , 2004 , 19 (13) : 25922651
[ 8 ] 　Dubey V S , Bhalla R , Lut hra R1 An overview of t he non2me2
valonate pat hway for terpenoid biosynt hesis in plant s [J ]1 J
B iosci , 2003 , 28 (5) : 63726461
[ 9 ] 　Liao Z H , Chen M , Gong Y F , et al1 Isoprenoid biosynt hesis
in plant s : pat hways , genes , regulation and metabolic engi2
neering [J ]1 J B iol Sci , 2006 , 6 (1) : 20922191
[ 10 ] 　Eisenreich W , Menhard B , Hylands P J , et al1 Studies on bi2
osynt hesis of taxol : t he carbon skeleton is not of mevalonodi
origin [J ]1 Proceed N ation A cad Sci , 1996 , 93 : 6431264361
[ 11 ] 　Estévez J M , Cantero A , Romero C , et al1 Analysis of t he
expression of CLA1 , a gene t hat encodes t he 12deoxyxylulose2
52phosphate synt hase of t he 22C2met hyl2D2eryt hritol242phos2
phate pat hway in arabidopsis [J ]1 Plant Physiol , 2000 , 124 :
9521031
[ 12 ] 　Phillip s M A , Walter M H , Ralph S G , et al1 Functional i2
dentification and differential expression of 12deoxy2D2xylulose
52phosphate synt hase in induced terpenoid resin formation of
Norway spruce ( Picea abies) [J ]1 Plant Mol B iol , 2007 , 65 :
24322571
[ 13 ] 　Munoz2Bertomeu J , Arrillaga I , Ros R , et al1 Up2regulation
of 12deoxy2D2xylulose252phosphate synt hase enhances produc2
tion of essential oils in t ransgenic spike lavender [J ]1 Plant
Physiol , 2006 , 142 : 89029001
[ 14 ] 　Takahashi S , Kuzuyama T , Watanabe H , et al1 A 12deoxy2
D2xylulose 52phosphate reductoisomerase catalyzing t he for2
mation of 22C2met hyl2D2eryt hritol 42phosphate in an alterna2
tive nonmevalonate pat hway for terpenoid biosynt hesis [J ]1
Proceed N ation A cad Sci , 1998 , 95 : 9879298841
[ 15 ] 　Carretero2Paulet L , Ahumada I , Cunillera N , et al1 Expres2
sion and molecular analysis of t he arabidopsis DXR gene enco2
ding 12deoxy2D2xylulose 52phosphate reductioisomerase , t he
first committed enzyme of t he 22C2met hyl2D2eryt hritol 42
phosphate pat hway [J ]1 Plant Physiol , 2002 , 1581215911
[ 16 ] 　Veau B , Courtois M , Oudin A , et al1 Cloning and expression
of cDNAs encoding two enzymes of t he MEP pat hway in Ca2
t haranthus roseus [J ]1 B iochim B iophys A cta , 2000 , 1517 :
15921631
[ 17 ] 　Mahmoud S S , Croteau R1 Metabolic engineering of essential
oil yield and composition in mint by altering expression of de2
oxyxylulose phosphate reductoisomerase and ment hofuran
synt hase [J ]1 Proceed N ation A cad Sci , 2001 , 98 : 89152
89201
[ 18 ] 　Nartin V J , Pitera D J , Wit hers S T , et al1 Engineering a
mevalonate pat hway in Escherichia coli for production of ter2
penoids [J ]1 N ature , 2003 , 21 : 79628021
[ 19 ] 　郑清平 , 余龙江 , 刘　智 , 等1 红豆杉细胞非甲羟戊酸途径
关键酶基因 dxr 的克隆与分析 [J ]1 生物工程学报 , 2004 , 20
(4) : 54825531
[ 20 ] 　Shi W , Feng J , Zhang M , et al1 Biosynt hesis of isoprenoids :
characterization of a functionally active recombinant 22C2
met hyl2D2eryt hritol 42phosphate cytidylt ransferase ( IspD )
f rom M ycobacteri um tuberculosis H37Rv [J ]1 J B iochem Mol
B iol , 2007 , 40 (6) : 91129201
[ 21 ] 　刘万宏 , 陈　敏 , 廖志华 , 等1 银杏内酯得生物合成途径及
生物技术研究进展 [J ]1 中草药 , 2007 , 38 (6) : 94129451
[ 22 ] 　Rohdich F , Wungsintaweekul J , Fellermeier M , et al1 Cyti2
dine 5′2t riphosphate2dependent biosynt hesis of isoprenoids :
YgbP protein of Escherichia coli catalyzes t he formation of 42
diphosphocytidyl222C2met hyleryt hritol [J ]1 Proceed N ation
A cad Sci , 1999 , 96 : 117582117631
[ 23 ] 　刘万宏1 紫杉醇前体合成途径两个关键酶基因克隆和分析
[ D]1 重庆 :西南大学 , 20081
[ 24 ] 　Buetow L , Brown A C , Parish T , et al1 The st ructure of my2
cobacteria 22C2met hyl2D2eryt hritol22 ,42cyclodiphosphate syn2
t hase , an essential enzyme , provides a platform for drug dis2
coversy [J ]1 B M C S t ructural B iol , 2007 , 7 : 682791
[ 25 ] 　Burlat V , Oudin A , Courtois M , et al1 Co2expression of
t hree MEP pat hway genes and geraniol 102hydroxylase in in2
ternal phloem parenchyma of Ctharanthus roseus implicates
multicellular t ranslocation of intermediates during t he biosyn2
t hesis of monoterpene indole alkaloids and isoprenoid2deived
primary metabolites [J ]1 Plant J , 2004 , 38 : 13121411
[ 26 ] 　Miller K , Neilan B , Sze D M1 Development of taxol and ot her
endophyte produced anticancer agent s [J ]1 Recent Patents
A nti2cancer D rug Disc , 2008 , 3 : 142191
[ 27 ] 　Kim J H , Yun J H1 A novel met hod of isolation taxane in
Tax us brevi f olia cell cult rues : Effect s of sugar [J ]1 B iotech2
nol L ett , 1995 , 17 : 10121061
[ 28 ] 　Fet t2Nero A G , Zhang W Y1 Kinetics of taxol production :
growt h and nut rient uptake in cell suspension of Tax us [J ]1
B iotechnol B ioeng , 1994 , 44 : 20522101
[ 29 ] 　Ketchum R E B , Gibson D M , Greenspan G L1 Media optimi2
zation for maximum biomass production in cell2cultures of Pa2
cific Yew ( Tax us brevi f olia Nutt1 ) [J ]1 Plant Cell Tissue
Organ Culture , 1995 , 42 : 18521931
[ 30 ] 　Tabata H1 Paclitaxel production by plant2cell2culture technol2
ogy [J ]1 A dv B iochem Eng B iotechnol , 2004 , 87 : 12231
[ 31 ] 　Expósito O , Bonfill M , Onrubia M , et al1 Effect of taxol
feeding on taxol and related taxane production in Tax us bacca2
ta suspension cultures [J ]1 N ew B iotechnol , 2009 , 25 (4) :
25222591
[ 32 ] 　Li Y C , Tao W Y1 Interactions of taxol2producing endophytic
fungus wit h it s host ( Tax us spp1 ) during taxol accumulation
[J ]1 Cell B iol I nt , 2009 , 33 (1) : 10221121
[ 33 ] 　Zhang P , Zhou P P , Jiang C , et al1 Screening of taxol2produ2
cing fungi based on PCR amplification f rom Tax us [J ]1 B io2
technol L ett , 2008 , 30 (12) : 2119221231
[ 34 ] 　Kim C H , Kim K I , Chung I S1 Expression of modified green
fluorescent protein in suspension culture of Tax us cus pi date
[J ]1 J Microbiol B iothechnol , 2000 , 10 (1) : 912941
[ 35 ] 　Furmanowa M , Syklowska2Baranek K1 Hairy root cultures of
Taxus x media var1 Hicksii Rehd1 as a new source of paclitax2
el and 102deacetylbaccation Ⅲ [J ]1 B iotechnol L ett , 2000 ,
22 : 68326861
[ 36 ] 　Ketchum R E , Wherland L , Croteau R1 Stable t ransforma2
tion and long2term maintenance of t ransgenic Tax us cell sus2
pension cultures [J ]1 Plant Cell Reports , 2007 , 26 : 10252
10331
·1331·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月