全 文 ：实验过程中选择了 3种流动相系统甲醇水、乙
腈水、乙腈水( 0 05% TFA)进行梯度洗脱,对流动
相的考察结果表明甲醇水系统与乙腈水系统差别
不大,从实验成本角度考虑, 选择了较为经济的甲
醇水系统。
实验选择了索氏提取法、回流提取法和超声提
取法 3种提取方法进行提取方式的考察。结果表明
超声提取法优于其他两种提取方法。同时对超声时
间的考察结果表明, 超声 30、45、60 min的提取能力
无显著性差异,故超声时间确定为 30 min。
参考文献:
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黄柏生物碱大孔树脂纯化工艺研究
刘丽梅1 , 陈 琳1 , 王瑞海1 ,陈韩英2 ,杨立新3 ,牛燕梅1 ,刘凤华4 ,许剑琴5
收稿日期: 20100227
基金项目:北京市科技计划课题( Y0705003041631)
作者简介:刘丽梅( 1965 ) ,女,黑龙江人,副研究员,从事中药研究及中医方证基础研究。
T el : ( 010) 640144112592 Email: liulimeihrb@ sina com
( 1 中国中医科学院中医基础理论研究所,北京 100700; 2 石河子大学药学院, 新疆 石河子 832000; 3 中国中医科学院
中药研究所,北京 100700; 4 北京农学院 动物科技系,北京 102206; 5 中国农业大学动物医学院,北京 102206)
摘 要:目的 筛选黄柏总生物碱大孔树脂纯化工艺。方法 对黄柏总生物碱提取液纯化所用大孔树脂型号、洗
脱剂体积分数、大孔树脂吸附容量、上柱药液 pH 值、上柱速度、洗脱剂用量、洗脱剂流速、洗脱液浓缩质量浓度、洗
脱液浓缩后 pH 值进行考察。结果 黄柏总生物碱大孔树脂纯化最佳工艺:大孔树脂载样量为 AB8 大孔树脂
黄柏药材= 1 1 2( g/ g ) , 上样速度为 2 BV/ h, 50%乙醇洗脱, 速度 1 5 BV / h,收集 6BV 洗脱液,回收乙醇,浓缩至
1 5 g 生药/ mL ,其相对密度为 1 015~ 1 017( 70 ! ) , 放置室温, 浓盐酸调节 pH 0 2~ 0 4, 冷藏放置 12 h, 离心,
沉淀低温减压干燥,得黄柏总生物碱。提取物中盐酸小檗碱质量分数达到 57 38% , 黄柏总生物碱质量分数达到
59 04%。结论 该工艺稳定,质量可控,可用于柏总生物碱纯化的产业化生产。
关键词:黄柏; 总生物碱;大孔树脂; 纯化
中图分类号: R284. 2; R286 02 文献标识码: B 文章编号: 0253 2670( 2010) 12 1990 04
黄柏为芸香科植物黄皮树 Phel lod endr on
chinense Schneid 的干燥树皮,习称川黄柏,具有清
热燥湿、泻火除烦、解毒疗疮等功效 [ 1]。黄柏中含有
多种生物碱,主要为小檗碱,还有巴马汀、药根碱、黄
柏碱、蝙蝠葛碱、白瓜蒌碱、木兰花碱等生物碱 [ 2]。
资料表明黄柏生物碱具有抗溃疡及抗腹泻作用, 对
免疫功能具有调节作用 [ 2] , 是本课题组提取的有效
部位。前期研究确定了黄柏总生物碱提取工艺 [ 3] ,
本实验采用大孔树脂纯化, 使黄柏总生物碱大于提
取物的 50%。
1 仪器和材料
SPS202 Ohaus 电子天平 (梅特勒托利多 (常
州)称重设备系统有限公司) , Startor ius CP 2250天
平(德国) , T6紫外可见分光光度计(北京普析通用
仪器设备有限公司) , WAT ERS 717 2487 高效
液相色谱仪。紫外灯(上海精科实业有限公司)。
AB8、D4020、S8大孔树脂(天津南开大学化
工厂) , 860021、DM130、CD180、D001SD 大孔树
脂(山东鲁抗医药股份有限公司) ,医用酒精(挚友酒
精厂) , 氯仿、甲醇、氨水均为分析纯。薄层色谱板
(烟台市化学工业研究所)。
黄柏药材购自河北安国, 经中国中医科学院中
药所冯学峰研究员鉴定为芸香科植物黄皮树 Phel
lod end ron chinense Schneid 的干燥树皮,其盐酸小
檗碱的质量分数为 3 65%。
2 方法与结果
2 1 盐酸小檗碱的 HPLC测定方法的建立 [ 1]
2 1 1 色谱条件:色谱柱Water s C18柱( 250 mm ∀
4 6 mm, 5 m) ; 流动相:乙腈0 1%磷酸溶液( 50
50) (每 100 mL 加十二烷基磺酸钠 0 1 g ) ; 检测波
#1990# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
长: 265 nm; 体积流量: 1 0 mL/ min; 柱温: 35 ! 。
2 1 2 对照品溶液的制备: 精密称取盐酸小檗碱
1 5 mg ,置 10 mL 量瓶中, 加乙醇溶解并稀释至刻
度,摇匀, 即得。
2 1 3 供试品溶液的制备: 取样品约 50 mg, 精密
称定,置 100 mL 量瓶中, 加乙醇 80 mL,超声处理
30 min, 加乙醇至刻度,摇匀,过 0 2 m 微孔滤膜,
即得。
2 1 4 标准曲线的制备:取干燥至恒重的盐酸小檗
碱对照品适量,精密称定, 加乙醇制成 0 14 mg / mL
的溶液。分别精密吸取 2、4、6、8、10 L 注入液相色
谱仪,连续进样 3次,测定峰面积。以进样量为横坐
标,峰面积均值为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明
盐酸小檗碱在 0 28~ 1 40 g 线性关系良好, 其回
归方程为 Y= 4 574 647 X- 156 623, r= 0 999 8。
2 1 5 测定:精密吸取对照品溶液和供试品溶液各
10 L,注入液相色谱仪, 测定峰面积,计算供试品中
盐酸小檗碱的质量浓度。
2 2 黄柏总生物碱紫外分光光度法的建立[ 2] :取一
定量黄柏提取物, 精密称定, 置 50 mL 量瓶中, 加
95%乙醇 30 mL,超声处理 30 min, 放冷, 用 95%乙
醇稀释至刻度,摇匀,滤纸滤过。取续滤液 2 mL,注
入 50 mL 量瓶中, 加入 0 05 mo l/ L 硫酸定容, 摇
匀。取 95%乙醇 2 mL 置 50 mL 量瓶中,加入 0 05
mol/ L 硫酸定容, 作空白对照溶液,于 345 nm 波长
进行紫外分光光度计测定。
2 3 大孔树脂型号的筛选:采用动态吸附法对不同
型号的大孔树脂进行筛选。取不同极性 7个型号大
孔树脂各100 g,按说明书要求进行处理备用。取黄
柏细丝,加药材 10倍量 75%乙醇回流提取 3次,每
次 1 5 h,药液回收乙醇,浓缩至相对密度为 0 998~
1 005( 60 ! ) , 加水至药液总体积相当于药材 24
倍[ 2 ]。冷藏过夜,离心, 上清液采用不同型号的大孔
树脂进行动态纯化, 分别用水, 10%、30%、50%、
95%乙醇或酸醇进行洗脱,收集不同质量浓度洗脱
样品,采用 HPLC 法测定盐酸小檗碱, 采用紫外可
见分光光度法测定总生碱,结果见表 1。结果表明,
采用 AB8大孔树脂纯化黄柏提取液纯化效果优于
其他型号大孔树脂, 故采用 AB8 大孔树脂进行黄
柏提取液的纯化, 并对纯化参数进行优化。
表 1 各种型号树脂纯化黄柏的筛选结果
Table 1 Screening of Phellodendri Cortex purification with different types of resin
树脂型号 洗脱剂 出膏量/ g 盐酸小檗碱/ % 总生碱/ ( g # g- 1 ) 总生碱解吸量/ ( g # g- 1) 总生物碱得率/ %
DM130 水10%乙醇 2 58 0 40
30%乙醇 3 41 30 58 29 70 10 12 2 26
50%乙醇 0 14 3 66
860021 10%乙醇 1 00 4 82 13 99
30%乙醇 3 38 37 02 36 58 12 36 2 06
D4020 10%乙醇 1 13 4 31 15 38
30%乙醇 3 28 34 74 34 25 11 23 1 87
S8 水10%乙醇 1 73 30 06 28 33 4 90 1 90
30%乙醇 0 83
CD180 95%乙醇 0 54 41 96 38 11
0 1%酸醇 4 95 23 95 20 86 10 33 1 72
D001SD 10% ~ 95%乙醇 0 24 2 96
0 5%10%酸醇 10 05 8 69 13 6 13 67 2 72
AB8 30%乙醇 3 91 41 17 45 59 17 82 2 97
50% + 95%乙醇 0 44
:未计算
: n ot counted
2 4 洗脱剂体积分数的筛选及洗脱药液浓缩后
pH 值的确定:预试验表明, 10%乙醇冲洗可除去一
部分杂质, 生物碱集中在 30% ~ 50%乙醇洗脱液。
取黄柏 5份,提取纯化, 按表 2工艺洗脱大孔树脂,
按色带收集药液,并用薄层色谱检查至小檗碱痕量,
测定提取物中总生物碱, 结果见表 2。结果表明,
10%乙醇除杂再用 30%乙醇冲洗大孔树脂总生物
碱量高, 但洗脱体积大, 周期长, 与之相比, 直接用
50%乙醇洗脱大孔树脂总生物碱略低, 但洗脱体积
小,周期短。由于 30%、50%乙醇洗脱黄柏总生物
碱量均小于 50%,需进一步纯化。将洗脱液浓缩后
调节 pH 值, 生物碱析出,为此对 30%、50%乙醇洗
脱液浓缩后的 pH 值进行筛选。
取 4份等量 AB8大孔吸附树脂, 按要求进行
预处理,检验合格后备用。取 4份黄柏,按优选工艺
提取并行上柱前纯化, 上清液上柱, 进行洗脱,按色
#1991#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
带收集药液,回收乙醇, 浓缩,用浓盐酸调节 pH 值
至没有物质析出, 放置 12 h, 离心, 沉淀减压干燥,
测定提取物中盐酸小檗碱和总生物碱, 结果见表 3。
结果表明直接用 50%乙醇洗脱,药液回收乙醇后用
浓盐酸调节至 pH 0 2~ 0 4,生物碱基本析出,提取
物中盐酸小檗碱转移率和总生物碱提取纯化得率最
高,故确定洗脱剂为 50%乙醇, 洗脱液用盐酸调节
至 pH 0 2~ 0 4。
表 2 乙醇洗脱树脂体积分数的筛选条件及结果
Table 2 Screening conditions and results of ethanol
eluting concentration of resins
除杂体积分
数/体积
洗脱体积
分数/ %
洗脱体积
/ BV
出膏率
/ %
总生物碱
/ %
10/ 4 30 24 5 58 42 35
30 10 8 81 10 50
50 6 1 05 12 06
50 4 7 79 24 45
10/ 4 50 4 5 6 29 39 99
10/ 4 40 7 5 77 37 64
表 3 30%、50%乙醇洗脱大孔树脂样品及 pH值范围
Table 3 Samples and pH values of resin with 30%
and 50% ethanol eluting
除杂体积
分数/体积
洗脱体积
分数/体积
洗脱液/
( g# mL- 1) pH 值
出膏率
/%
盐酸小檗碱
转移率/ %
总生物碱
得率%
10/ 4 30/ 24 2 0 0 40 5 78 78 64 3 58
30/ 24 1 0 0 23 4 18 73 16 2 97
10/ 4 50/ 6. 5 1 5 0 31 6 00 81 93 3 61
50/ 6. 5 1 5 0 23 5 87 90 24 3 62
2 5 大孔树脂吸附容量的考察: AB8大孔吸附树
脂 100 g 按要求处理装柱( 40 cm ∀ 3 cm)备用。取
黄柏丝 270 g, 按优选工艺提取并进行上柱前纯化,
上清液上柱,上柱速度控制在 2 BV / h, 分段收集流
出液, HPLC法检测流出液中盐酸小檗碱的质量浓
度,绘制吸附容量图,见图 1。结果表明, 100 g 大孔
吸附树脂吸附 130 g 黄柏药材提取的药液时开始渗
漏,考虑生产实际情况,该复方工艺中大孔吸附树脂
吸附黄柏量定为 1 1 2( g/ g ) , 即 100 g 大孔树脂
载 120 g 黄柏药材提取液。
2 6 药液上柱时 pH 值的考察:取 3份 AB8大孔
吸附树脂各100 g,按要求处理装柱( 40 cm ∀ 3 cm ) ,
备用。取 3份黄柏各 80 g ,按优选工艺提取并行上
柱前纯化,得上清液, 测得 pH 4 5。3份药液 1 份
为原洗脱药液( pH 4 5) , 另外 2份洗脱药液用 5%
氢氧化钠调节 pH 7 5、10 5,使 3份药液分别在酸
性、中性、碱性时上样,按色带收集 50%乙醇洗脱液
6 5 BV, 回收乙醇, 浓缩, 浓盐酸调节 pH 0 2 ~
0 4, 放置 12 h,离心, 沉淀减压干燥,测定提取物中
盐酸小檗碱和总生物碱, 结果见表 4。结果表明, 3
种不同 pH 值 药液上柱洗脱样品中盐酸小檗碱转
移率和总生物碱提取率以 pH 4 5 时药液上样最
佳,故按优选工艺提取并进行上柱前纯化的上清液
可直接上样。
图 1 大孔树脂吸附黄柏药液容量
Fig 1 Adsorption of liquid capacity of Phellodendri
Cortex by resin
表 4 上柱药液 pH的考察结果
Table 4 pH Values of sample
药液 pH 值 出膏率
/%
盐酸小檗
碱/ %
盐酸小檗碱
转移率/ %
总生物
碱/ %
总生物碱
得率%
4 5 4 26 57 03 65 62 62 04 2 64
7 5 3 54 57 28 55 55 65 70 2 32
10 5 3 60 59 65 58 83 62 94 2 27
2 7 药液上柱速度的考察: 取 3份 AB8大孔树脂
各 100 g ,按要求处理装柱( 40 cm ∀ 3 cm) ,备用。取
3份黄柏药材各 120 g,按优选工艺提取并行上柱前
纯化, 上清液上柱, 将上柱速度分别控制在 2、4、6
BV/ h,洗脱速度相同( 2 BV/ h) , 按色带收集 50%乙
醇洗脱液 6 5 BV,按照以上试验操作, 测定盐酸小
檗碱和总生物碱,结果见表 5。结果表明上柱速度
为 2 BV/ h时,样品中盐酸小檗碱转移率和总生物
碱提取率为最高, 故上柱速度选择 2 BV/ h。
表 5 药液上柱速度的筛选结果
Table 5 Screening of column speed of sample
上柱速度/
( BV # h- 1 )
出膏率
/%
盐酸小檗
碱/ %
盐酸小檗碱
转移率/ %
总生物
碱/ %
总生物碱
得率/ %
2 5 23 55 40 79 38 60 53 3 17
4 4 99 56 11 76 70 60 88 3 04
6 4 80 58 19 76 52 64 65 3 10
2 8 乙醇洗脱大孔树脂用量的考察: AB8大孔树
脂 100 g ,按要求处理装柱( 40 cm ∀ 3 cm) ,备用。根
据吸附容量试验结果,取黄柏 120 g, 按优选工艺提
取并进行上柱前纯化, 上清液上大孔树脂,按柱体积
收集 50%乙醇洗脱液数份,测定流出液中盐酸小檗
碱,根据解吸体积和质量浓度绘制盐酸小檗碱解吸
曲线图,见图 2。结果表明,当 50%乙醇洗脱 6 BV
以后,盐酸小檗碱峰的量已很少, 因此用 50%乙醇
洗脱,收集 6 BV 流出液。
#1992# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
图 2 盐酸小檗碱解吸曲线
Fig 2 Desorption curve of berberine hydrochloride
2 9 洗脱剂体积流量的考察: 取 3 份 AB8大孔树
脂各 100 g 按要求处理装柱( 40 cm ∀ 3 cm ) , 备用。
取 3份黄柏药材各 120 g, 按优选工艺提取纯化, 上
清液上柱,上柱速度均为 2 BV/ h,洗脱速度分别为
0 5、1 0、1 5 BV/ h,收集 50%乙醇洗脱液 6 BV, 其
他同上,测定样品中盐酸小檗碱和总生物碱, 结果见
表 6。结果表明, 大孔树脂乙醇洗脱速度为 1 5
BV/ h 时,样品中盐酸小檗碱转移率和总生物碱提
取率最高,故选择洗脱速度为 1 5 BV/ h 适宜。
表 6 大孔树脂下样洗脱速度的筛选结果
Table 6 Screening of eluting speed of sample with resin
洗脱速度/
( BV # h- 1)
出膏率
/ %
盐酸小檗
碱/ %
盐酸小檗碱
转移率/ %
总生物
碱/ %
总生物碱
得率/ %
0 5 4 75 59 87 77 91 64 77 3 08
1 0 5 20 56 15 79 99 62 75 3 26
1 5 5 29 56 07 81 26 63 29 3 35
2 10 洗脱液浓缩质量浓度的考察: 取 AB8 大孔
树脂 300 g ,按要求处理装柱( 80 cm ∀ 6 cm ) , 备用。
取黄柏 360 g, 按优选工艺提取并进行上柱前纯化,
收集 50%乙醇洗脱液 6 BV,均分为 3份,每份洗脱
液分别浓缩至不同质量浓度,加浓盐酸调 pH 0 2~
0 4, 冷藏放置 12 h,离心,取沉淀减压干燥, 测定样
品中盐酸小檗碱和总生物碱, 结果见表 7。结果表
明, 50%乙醇洗脱液浓缩至含生药 1 5 g/ mL 时, 样
品中盐酸小檗碱转移率、总生物碱提取率最高,故用
50%乙醇洗脱大孔树脂, 药液浓缩至含生药 1 5
g/ mL时调节 pH 值最佳, 此时测定其相对密度为
1 015~ 1 017 ( 70 ! )。
表 7 洗脱液浓缩浓度的筛选结果
Table 7 Screening of eluent concentration
质量浓度/
( g # mL- 1 )
出膏率
/%
盐酸小檗
碱/ %
盐酸小檗碱
转移率/ %
总生物
碱/ %
总生物碱
得率/ %
1 0 5 05 58 40 80 80 62 84 3 17
1 5 5 87 52 37 84 22 57 53 3 37
2 0 6 23 46 44 70 27 50 92 3 17
2 11 验证实验: 取 AB8大孔树脂 800 g,装柱( 80
cm ∀ 6 cm)处理备用。取黄柏 960 g, 按优选工艺提
取、上柱前纯化、上柱纯化,测定样品中盐酸小檗碱
及总生物碱,结果见表 8。结果表明, 该工艺稳定,
质量可控。提取物中盐酸小檗碱质量分数达到
57 38% ,盐酸小檗碱转移率达到 71 77% , 黄柏总
生物碱质量分数达到 59 04%。
表 8 验证试验
Table 8 Test of verification
编号 出膏率
/%
盐酸小檗
碱/ %
盐酸小檗碱
转移率/ %
总生物
碱/ %
总生物碱
得率/ %
1 4 62 54 42 68 95 55 36 2 56
2 4 65 58 16 72 66 61 71 2 81
3 4 52 59 55 73 71 60 07 2 71
平均 4 57 57 38 71 77 59 04 2 69
3 讨论
黄柏总生物碱呈酸性,考虑到生产中干燥设备的
适应性以及配方酸碱度适宜性,将浓盐酸调节 pH 值
后得到的黄柏总生物碱沉淀加适量的去离子水(药材
质量 1/ 4的水量) ,搅匀,用 20%NaOH 溶液调节沉淀
液的 pH 3 5~ 4,将其浓缩至稠膏, 低温减压干燥,得
到黄柏总生物碱,该半成品没有酸的气味。
二类中药要考察单一成分和总有效成分的量,
为此实验中给出了盐酸小檗碱和总生物碱量,并通
过考察盐酸小檗碱的转移率和总生物碱提取纯化得
率来考核提取纯化的工艺。
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