全 文 ：半仿生酶法提取三七皂苷工艺研究
宋宏新 ,刘 　静 ,张彦娟 3
(陕西科技大学生命科学与工程学院 ,陕西 西安 　710021)
摘　要 :目的 　研究酶法及半仿生法从三七中提取皂苷的最佳工艺。方法 　以提取液中总皂苷得率和干膏收率为
指标 ,对乙醇回流法、纤维素酶酶解、果胶酶酶解、α2淀粉酶酶解、复合酶酶解和半仿生2α2淀粉酶酶解提取法进行比
较 ,并对半仿生酶法进行了正交试验优化。结果 　该法的最佳提取条件为温度 70 ℃,时间 215 h ,料液比为 1 ∶10。
结论 　半仿生2α2淀粉酶酶解提取三七皂苷的方法最经济有效。
关键词 :三七 ;皂苷 ;半仿生法 ;酶法
中图分类号 :R28614 ;R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0620905203
　　三七为五加科植物三七 Pana x notogi nseng
(Burk1 ) F1 H1 Chen 的干燥块根 ,具有散瘀止血 ,消
肿定痛的作用[1 ] 。因三七药材含有大量的淀粉多
糖 ,传统的提取方法水提醇沉法 ,在水煎煮过程中容
易糊化 ,难于滤过[2 ] ,醇沉后由于沉淀的吸附作用 ,
皂苷损失较大 ,提取率低 ;渗漉法虽然提取率较高 ,
但溶剂消耗过大 ,提取周期较长[3 ] 。而酶法提取具
有活性高 ,专一性强 ,条件温和 ,不污染环境 ,对药效
成分的保存率、提取率高等优点。半仿生法则是模
拟口服给药及药物经胃肠道转运的原理 ,将药料先
经酸再经碱提取处理 ,是为经消化道给药的中药制
剂设计的一种提取工艺[4 ] 。因此 ,本实验对酶法和
半仿生法提取三七皂苷的工艺进行研究。
1 　实验材料
　　752 分光光度计 (上海精密) 。
　　三七药材产自云南文山 ,购于西安市药材市场 ,
经西北大学生命科学学院中药教研室鉴定为三七
P1 notogi nseng (Burk1 ) F1 H1 Chen 的干燥块根 ,
含总皂苷约为 13 % ;人参皂苷 Rg1 对照品购自陕西
省药品检验所 ,质量分数大于 95 % ;纤维素酶 (酶活
为 1950 U/ g) 、果胶酶 (酶活为 526 U/ g) 、α2淀粉酶
(酶活为 3913 U/ g) ;D2101 大孔树脂 (西安电力树
脂厂) ;半乳糖醛酸、香草醛、高氯酸、乙醇等均为
分析纯。
2 　方法与结果
211 　三七皂苷的测定
21111 　标准曲线的制备 :精密称取干燥至恒重的人
参皂苷 Rg1 对照品 5 mg 于 5 mL 量瓶中 ,加甲醇至
刻度。精密量取 10、20、40、60、80、100μL 置 10 mL
具塞试管中 ,水浴挥干溶剂 ,各加入新配制的 5 %的
香草醛冰醋酸溶液 012 mL ,高氯酸 018 mL 于 60
℃水浴恒温 15 min ,立即置于冰水中冷却 5 min ,加
入冰醋酸 5 mL 摇匀 ,放置 10 min ,以试剂空白作参
比 ,测定在 545 nm 下的吸光度 (《中国药典》2005 年
版一部附录 V 分光光度法) 。以吸光度为横坐标 ,
三七皂苷质量浓度为纵坐标绘制标准曲线 ,回归得
方程 C = 01199 7 A + 01002 5 , R2 = 01999 2。
21112 　测定方法 :取一定量的三七提取液 ,采用 D2
101 树脂进行分离 ,提取液上柱后先水洗 ,再收集
70 %乙醇洗脱液 ,合并提取液后浓缩 ,用比色法定量
测定 ,计算总皂苷得率 (总皂苷得率 = 皂苷质量/ 加
入三七干粉总量 ×100 %) 。
212 　干膏收率的计算 :精密量取各提取液 50 mL
于水浴上挥干 ,然后置恒温干燥箱中 105 ℃烘 3 h
至恒重 ,于干燥器中冷却 30 min ,称定质量 ,即为提
取物总量 ,计算干膏收率 (干膏收率 = 提取物总量/
加入三七干粉总量 ×100 %) 。
213 　不同提取方法比较
21311 　乙醇回流法 :取三七粉 10 g ,加入 8 倍量
70 %的乙醇浸泡 30 min ,加热回流 115 h ,滤过 ,滤
渣再加入 5 倍量 70 %乙醇回流 115 h ,滤过 ,合并两
次滤液 ,定容至 200 mL ,即得。
21312 　酶解法提取 :取三七粉 10 g ,加入 50 mL 蒸
馏水冷浸 24 h ,按每克生药加入一定量的酶 ( U/ g) ,
不同酶的加入量及调节的 p H 值见表 1 ,50 ℃水浴
酶解 2 h ,酶解期间时时搅拌 ,酶解后滤过 ,药渣加
入 70 %乙醇回流 2 次 ,合并滤液定容至 200 mL ,即
得。各种酶提取基本程序相同 ,仅是酶的加入量及
作用 p H 值不同 ,复合酶是按每克生药加入 14 U 纤
维素酶和 21 U 果胶酶的量。
·509·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 收稿日期 :2008208217　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
表 1 　不同酶解法提取工艺
Table 1 　Comparison of extracting process
by four zymolysis method
酶解法 加酶量/ (U ·g - 1) 酶解 p H 值
纤维素酶 15 415
果胶酶 140 415
α2淀粉酶 200 610
复合酶 15 + 21 415
21313 　半仿生2α2淀粉酶酶解法 :根据仿生学原理 ,
人体胃 ,小肠 ,大肠的体液最佳 p H 值为 210、715、
813[4 ] 。取三七粉 10 g ,加柠檬酸缓2磷酸氢二钠缓
冲液 70 mL ,p H 值调到 210 ,50 ℃恒温振荡 2 h ,85
℃水浴糊化后 p H 值调到 610 ,再加入 300 U 的α2
淀粉酶于 60 ℃酶解 40 min 后滤过 ,滤渣依次加入
p H 值分别为 715、813 的磷酸氢二钠2柠檬酸缓冲溶
液作为提取液 ,80 ℃水浴 115 h ,合并 3 次提取液 ,
定容至 200 mL ,即得。
21314 　结果 :将上述各种方法所得的提取液 ,测定
总皂苷得率和干膏收率 ,结果见表 2。结果显示 ,与
乙醇回流法相比 ,各种酶的加入均提高了总皂苷得
率和干膏收率。各酶解提取方法对总皂苷得率的影
响是 :半仿生2α2淀粉酶 > 复合酶 > 纤维素酶 >α2淀
粉酶 > 果胶酶 ;且半仿生2α2淀粉酶法的转移率高达 表 2 　提取方法的比较结果Table 2 　Comparison of extracting methods提取方法 总皂苷得率/ % RSD/ % 干膏收率/ % RSD/ %乙醇回流法 8138 01 56 381 58 61 81α2淀粉酶 8180 01 26 421 95 01 26纤维素酶 9139 11 25 421 58 01 68果胶酶 8178 01 78 441 64 01 94复合酶 10171 01 42 491 85 01 91半仿生2α淀粉酶 11196 01 23 511 92 01 5692 %。对干膏收率的影响是 :半仿生2α2淀粉酶解法 > 复合酶 > 果胶酶 >α2淀粉酶 > 纤维素酶。　　故以总皂苷得率和干膏收率为指标 ,进一步优化半仿生2α2淀粉酶酶解法提取工艺。214 　半仿生2α2淀粉酶酶解法正交试验优化工艺 :在对溶剂和提取方法初步选择后 ,选定提取温度、时间和料液比作为考察的 3 个因素 ,每个因素各取 3个水平 :水浴温度 (60、70、80 ℃) ,提取时间 (115、210、215 h) ,料液比 (1 ∶10、1 ∶14、1 ∶18 g/ mL ) 。采用 L 9 (34 )正交表进行试验 ,以总皂苷得率和干膏收率的综合评分 (综合评分 = 总皂苷得率 ×4 + 干膏收率 ×1)为考察指标 ,考察因素间的最佳配比 ,结果见表 3。
表 3 　半仿生2α2淀粉酶酶解法正交试验及其结果
Table 3 　Orthogonal design and results of semi2bionic 2α2amylase zymolysis
试验号 A 温度/ ℃ B 时间/ h C 料液比/ (g ·mL - 1) D(空白列) 总皂苷得率/ % 干膏收率/ % 综合评分
1 60 11 5 1 ∶10 101 87 48124 911 72
2 60 21 0 1 ∶14 111 26 49124 941 28
3 60 21 5 1 ∶18 111 77 50124 971 32
4 70 11 5 1 ∶14 111 34 49128 941 64
5 70 21 0 1 ∶18 121 37 51128 1001 76
6 70 21 5 1 ∶10 131 01 52176 1041 80
7 80 11 5 1 ∶18 111 98 55148 1031 40
8 80 21 0 1 ∶10 111 02 48192 931 00
9 80 21 5 1 ∶14 111 18 49112 931 84
K1 283132 2891 76 289152 286132
K2 300120 2881 04 282176 302148
K3 290124 2951 96 301148 284196
k1 94144 961 59 96151 95144
k2 100107 961 01 94125 100183
k3 96175 981 65 100149 94199
R 5163 21 64 6124 5184
　　直观分析得出最佳的提取条件是 A2B3 C3 ,由于
料液比的极差 R 最大 ,对试验影响最大。综合考
虑 ,最佳实验方案是 A2B3 C1 ,即水浴温度 70 ℃,提
取时间 215 h ,料液比为 1 ∶10。
215 　验证试验 :按半仿生2α2淀粉酶酶解法工艺进
行 3 批药材的验证试验 ,结果见表 4。可以看出半
仿生2α2淀粉酶酶解法工艺稳定 ,具有可行性。 表 4 　验证试验结果Table 4 　Varif ication of three batchesof medicinal materials批　次 皂苷得率/ % 干膏收率/ %1 111 86 491 482 121 14 151 333 121 02 501 723 　讨论
·609· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
　　由于三七药材中淀粉的含量高 ,α2淀粉酶可以
迅速水解淀粉 ,再结合半仿生提取 ,模拟了肠胃环
境 ,为药效成分创造了更好的溶出环境。提取过程
中由于淀粉酶可以很快降低糊化淀粉的黏度 ,不仅
有利于传质溶出 ,还可提高原料药的起始投放浓度 ,
所以半仿生2α2淀粉酶法可以显著节约时间 ,提高生
产效率 ;又由于其直接用弱酸和弱碱溶液提取 ,可以
减少乙醇用量 ;另外 ,α2淀粉酶在食品工业普遍使
用 ,食用安全性良好并且价格低廉 ,所以 ,综合考虑
提取效果及经济效益 ,半仿生2α2淀粉酶提取法是最
佳提取工艺。
　　实验结果分别以提取液中总皂苷得率和干膏收
率为考察指标 ,总皂苷得率可以直接评价该工艺提
取粗三七皂苷的能力。而干膏收率一方面可直观地
表明酶解后产物量增多 ,如酶解产生的小分子 (其他
水溶性物质 ,糖、糊精等) ,但高提取物得率也表明总
提取物中必定存在较多的杂质 ,甚至是非药效成分。
这些通过酶作用后与三七皂苷共同被提取的小分子
化合物 ,是否会与三七皂苷的药效产生协同作用 ,使
传统中药复方多组分更有效 ,这些都有待于进一步
的成分解析及药效学研究。
参考文献 :
[ 1 ] 　中国药典 [ S]1 一部120051
[ 2 ] 　唐红芳 ,毛丽珍 ,徐世芳1 正交试验法研究三七提取工艺[J ]1
中草药 ,2001 ,32 (1) :262281
[3 ] 　周　琳 ,李元波 ,曾 英1 超声酶法提取三七总皂苷的研究[J ]1
中成药 ,2006 ,28 (5) :64226451
[ 4 ] 　陈晓娟 ,周春山1 酶法及半仿生法提取杜仲叶中绿原酸和黄酮
[J ]1 精细化工 ,2006 ,23 (3) : 25722601
HPLC法测定注射用双黄连中黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素、
咖啡酸和绿原酸
阎 　姝1 ,田书霞1 ,徐茂玲2 ,李惠芬2 3
(11 天津市南开医院 药剂科 ,天津 　300100 ; 21 天津医科大学药学院 ,天津 　300070)
摘 　要 :目的 　建立同时测定注射用双黄连中黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素、咖啡酸和绿原酸 5 种有效成分的方法。
方法 　高效液相色谱法。Phenomenex C18色谱柱 (250 mm ×416 mm ,5μm) ;流动相 :乙腈21 %冰醋酸水溶液 ,作梯
度洗脱 ;检测波长为 327 nm ;体积流量为 1 mL/ min ;柱温为 40 ℃,灵敏度为 01100 0 AU FS。结果 　在筛选色谱条
件下 ,测定了注射用双黄连中的黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素、咖啡酸和绿原酸 5 种有效成分。结论 　本方法简便、快
速、准确、可靠 ,可用于注射用双黄连中有效成分的测定。
关键词 :注射用双黄连 ;黄芩苷 ;野黄芩苷 ;黄芩素 ;咖啡酸 ;绿原酸 ;高效液相色谱
中图分类号 :R286102 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0620907203
　　注射用双黄连由金银花、黄芩和连翘提取精制
而成 ,用于治疗细菌和病毒感染引起的疾病 ,临床应
用广泛[1 ] 。《中国药典》2005 年版一部注射用双黄
连 (冻干)项下采用 3 个不同的色谱条件分别对绿原
酸、黄芩苷和连翘苷进行了测定。另有文献采用
H PL C 法同时测定该制剂中 3 个组分[ 2 ] 。本实验采
用梯度洗脱高效液相色谱法对注射用双黄连中黄芩
苷、野黄芩苷、黄芩素、咖啡酸和绿原酸 5 种有效成
分进行测定 ,方法简单易行 ,测定结果准确可靠 ,为
注射用双黄连的质量控制提供了一种有效的方法。
1 　仪器与试药
　　Agilent1100 全自动液相色谱仪系统 (四元梯度
泵 ,二极管检测器) (美国安捷伦公司) ;注射用双黄
连 (冻干粉针) (哈药集团中药二厂) ;黄芩苷 (批号
71528501) 、野黄芩苷 (批号 1108422200605) 、黄芩素
(批 号 1115952200604 ) 、咖 啡 酸 ( 批 号 1108852
200102) 、绿原酸 (批号 1107532200413) 对照品均由
中国药品生物制品检定所提供 ;水为纯化水 ,乙睛为
色谱纯 ,其他试剂均为分析纯。
2 　方法与结果
211 　色谱条件 : Phenomenex C18色谱柱 (250 mm ×
416 mm ,5μm) ;流动相 :乙腈 ( A)21 %冰醋酸水溶
·709·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 收稿日期 :2008212215　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :阎　姝 (1968 —) ,女 ,天津市人 ,副主任药师 ,博士 ,南开医院药剂科副主任 ,研究方向 :中药及中药制剂分析、临床药学。
E2mail : ysyx0234 @1261com3 通讯作者　李惠芬　E2mail : lihuifen @tijmu1edu1cn