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块菌多糖的相对分子质量测定和单糖组成分析
刘 　娟 ,屈效源 3
(佳木斯大学化学与药学院 ,黑龙江 佳木斯 　154007)
摘 　要 :目的 　测定从块菌菌丝体中分离得到的均一多糖 KJB21 的平均相对分子质量 ,并分析其单糖组成。方法
块菌菌丝体通过水提醇沉 ,再以 Sevage 法去除蛋白质 ,得到粗多糖 KJB。经 Sepharose CL6B 柱色谱分离纯化得到
均一多糖 KJB21。利用高效液相色谱法测定 KJB21 的平均相对分子质量 ;三氟乙酸完全酸水解后进行糖醇衍生化 ,
之后运用气相色谱法 ,与标准品对照后分析其单糖组成。结果 　KJB21 在高效液相下呈单一对称峰 ,其平均相对
分子质量大于 2 ×106 ,单糖组成分析该多糖是由单一组分葡萄糖组成。结论 　KJB21 为分子质量大于 2 ×106 的葡
聚糖。
关键词 :块菌 ;多糖 ;气相色谱 ;单糖组成
中图分类号 :R28411 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0921380202
　　块菌属子囊菌亚门盘菌纲块菌目块菌科 ,是生
长在森林地下的最为珍贵的一类药食两用真菌 ,又
称“松露”。其中一些种类如黑块菌、白块菌在欧美
被誉为“厨房里的钻石”、“地下黄金”,具有极大的经
济价值 ,故有“真菌王子”之称。块菌是一种典型的
共生菌 ,其主要活性成分有 a2雄烷醇、神经酰胺、块
菌多糖等成分[1 ] ,块菌多糖具有抗肿瘤并参与免疫
调节等功能。为了寻找块菌多糖的活性部位 ,本实
验对块菌的水热提多糖进行了分离并纯化 ,得到
KJB21 ,测定其平均相对分子质量 ,并分析其单糖组
成 ,旨在为后续的结构和功能的进一步研究提供科
学依据。
1 　材料与仪器
111 　材料与试剂 :块菌菌丝体 (购于云南誉成隆经
贸有限公司) ,由北京大学医学部韩晓强博士鉴定。
标准单糖对照品 (鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、
半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸) 均为分
析纯 ,购于 Merck 公司。多糖相对分子质量测定用
标准品 Dext ran T 系列 ,均为 Pharamacia 公司产
品。肌醇为国产生化试剂 ,三氟乙酸 ( TFA) 、醋酸
酐、氯仿、四氢硼钠、甲醇均为分析纯。
112 　仪器 : Agilent HP6890N 型气相色谱仪 ,氢火
焰离子检测器 ( FID) , HP25 毛细管色谱柱 (30 m ×
0132 nm) ;Agilent 1100 series 高效液相色谱系统 ,
蒸发光散射检测器 ( EL SD) ,Shodex KS2805 凝胶色
谱柱。
2 　实验方法
211 　块菌多糖的分离纯化 :块菌经乙醇脱脂后沸水
浸提 ,减压浓缩后醇沉 ,再经 Sevage 法去蛋白[2 ] 得
到粗多糖。再经 CL6B 凝胶细分后得 KJB21 , HPL C
示单一对称峰。
212 　相对分子质量测定[3 ,4 ] :先采用标准葡聚糖
Dext ran T 系列制作标准曲线 ,然后根据多糖样品
在相同色谱条件下的洗脱体积或保留时间 ,用标准
·0831· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 9 期 2009 年 9 月
3 收稿日期 :2009202218　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :刘　娟　Tel : (0454) 8610828 　E2mail :liujuan1949 @1631com
曲线计算该样品的平均相对分子质量。流动相为蒸
馏水 ,体积流量为 1 mL/ min ,柱温为 60 ℃。
213 　多糖的完全酸水解 :取多糖 5 mg 置于安瓿瓶
中 ,加 4 mL TFA 封管 ,110 ℃反应 2 h。将水解液
减压蒸干 ,再加 2～3 mL 甲醇溶解后减压蒸干 ,反
复 3 次以上直至除尽残余的 TFA。
214 　多糖水解物的还原 :将样品加水 1 mL ,加入
20 mg NaB H4 于室温中还原 3 h ,后用 25 %冰醋酸
调节 p H 值至 4～5。减压蒸干 ,反复 3 次 , 80～
90 ℃真空干燥 12 h 以除尽水分。
215 　阿尔迪醇酯的制备 :样品干燥后加 2 mL 醋
酐 ,封管 ,100 ℃反应 2 h ,减压蒸干 ,加 2 mL 甲醇再
蒸干 ,反复 3 次 ,制成阿尔迪醇酯。将乙酰化后的产
物用氯仿 3～5 mL 转移到分液漏斗中 ,再加等体积
的水 ,洗涤 3 次 ,去除水层 ,蒸干待检。
216 　气相色谱条件 :色谱柱为 HP25 毛细管色谱柱
(30 m ×0132 nm) ,FID 检测器 ,进样口温度为280 ℃,
升温程序为 170～215 ℃(每分钟升高 2 ℃) 。氢气为
燃气 ,20 mL/ min ;氮气体积流量为 30 mL/ min ;AIR
体积流量为 20010 mL/ min ;进样量为 110μL。
217 　标准单糖相对校正因子测定 :精确称取上述标
准单糖 ,分别加入相同量的内标物。按上述方法制
备样品的糖醇乙酸酯衍生物并进行气相色谱分析 ,
计算相对校正因子[5 ] 。
218 　多糖中各单糖物质的量之比的计算 :根据各单
糖的相对校正因子计算出多糖中单糖的含量。
3 　结果与分析
311 　KJB21 的性状 : KJB21 为棕褐色粉末 , HPL C
分析结果为单一对称峰 (图 1) ,表明其为均一多糖。
通过紫外和 Lowry 法[6 ]测定 ,表明其不含蛋白质。
t/ min
图 1 　KJB21 的 HPLC图
Fig11 　HPLC Chromatogram of KJB21
312 　回归方程的制备 :用标准葡聚糖 Dext ran T 系
列进行高效液相检测 ,得系列数据 (表 1) ,并制作矫
正曲线 ,得回归方程为 Y = - 11180 1 X + 161382
( R = 01969 6) 。测得 KJB21 平均相对分子质量大
于 × 6 。
表 1 　Dextran T系列 HPLC检测结果
Table 1 　HPLC Results of Dextran T series
Dext ran T 系列 Mw lgMw tR/ min
Glu 182 21255 111 722
T210 1 ×104 41000 101 795
T240 4 ×104 41602 101 184
T270 7 ×104 41845 91 73
T2110 111 ×105 　 51041 91 481
T2500 5 ×105 51699 81 96
T22000 2 ×106 61301 81 56
313 　KJB21 的组成 :将 KJB21 完全酸水解产物 ,并
制备阿尔迪醇酯衍生物 ,同法制备各标准单糖的阿
尔迪醇酯衍生物 ,进行 GC 分析 ,结果各标准单糖的
混标与样品多糖的 GC(图 2)相对照 ,表明该多糖主
要是由葡萄糖组成。
t/ min
图 2 　各标准单糖( A)和 KJB21( B)的 GC图谱
Fig12 　GC Chromatograms of monosaccharide ( A)
and KJB21 ( B)
4 　讨论
近年来 ,随着波谱解析技术的不断发展 ,真菌多
糖 ,尤其是药食两用真菌多糖的研究也取得了长足的
进步。多糖类的活性与其相对分子质量大小、聚合
度、分支度以及溶液中高级构象等都有关 ,多糖相对
分子质量太大或太小均会引起活性的下降。多糖结
构研究的主要内容有相对分子质量测定、多糖的单糖
组成、糖苷键构型、聚合度、分支度等基本结构以及多
糖的溶液构象等[7 ] 。而相对分子质量测定和单糖组
成的分析可为后期的研究工作提供一定的指导。要
分析 KJB21 的化学结构 ,还需进一步的研究。
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