全 文 ：推断 CA 使神经元细胞 M T T 染色吸光度显著增加
的原因是药物增强了活细胞对染料的摄取。
综上所述 ,本实验证明了从白首乌 C21 甾体总
苷中分离得到的单体化合物 CA 具有确定的体内外
抗肿瘤活性 ,并初步证实诱导凋亡是 CA 体外肿瘤
细胞毒机制之一 ,但不是最主要机制。本实验研究
了 CA 的体内外抗肿瘤作用及作用机制 ,同时也为
CA 作用机制的进一步研究提供了线索 ,为白首乌
C21甾体苷类抗肿瘤药物的研究奠定了基础。
参考文献 :
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羟基红花黄色素 A缓解大鼠心肌细胞凋亡作用的研究
金 　鸣 ,董宁宁 ,吴 　伟 ,李金荣 ,臧宝霞 ,童 　静 3
(首都医科大学附属北京安贞医院 - 北京市心肺血管疾病研究所 药理研究室 ,北京 　100029)
摘　要 :目的 　以整体和离体实验观察羟基红花黄色素 A ( HSYA) 缓解心肌细胞凋亡的作用。方法 　以异丙肾
上腺素 ( ISO) 造成大鼠急性心肌缺血 ,以 TUN EL 法检测心肌组织细胞凋亡 ,免疫组化法和 RT2PCR 法观察心肌
组织中 bax、bcl22 基因表达的变化 ;用缺糖缺氧/ 再复氧模型诱导原代培养心肌细胞凋亡 ,以 PI 流式细胞法观察凋
亡情况 ,以 Rhodamine 123 荧光法考察线粒体膜电位的变化。结果 　60、120、240 mg/ kg HSYA ip 给药可以减轻
心肌缺血大鼠的线粒体肿胀、核凝集及固缩 ,降低心肌细胞凋亡率 ( P < 0101) ,下调心肌组织 Bax 蛋白 ( P < 0105)
及 bax mRNA 的表达 ( P < 0101) 。0164、113、215 mmol/ L HSYA 可减少缺氧/ 再复氧造成的细胞凋亡 ( P <
0105) ,且可缓解该损伤造成的心肌线粒体膜电位下降 ( P < 0105) 。结论 　抑制心肌细胞凋亡是 HSYA 缓解心肌
缺血的重要机制。
关键词 :羟基红花黄色素 A ( HSYA) ; 凋亡 ; 心肌缺血 ; 线粒体
中图分类号 :R28612 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0620924207
Inhibition of hydroxysafflor yellow A against rat cardiomyocyte apoptosis
J IN Ming , DON G Ning2ning , WU Wei , L I J in2rong , ZAN G Bao2xia , TON G Jing
(Department of Pharmacology , Beijing Anzhen Hospital of Capital University of Medical Sciences2Beijing Institute
of Heart , L ung , and Blood Vessel Diseases , Beijing 100029 , China)
Abstract : Objective 　To investigate t he inhibitory effect of hydroxysafflor yellow A ( HSYA) against
cardiomyocyte apoptosis. Methods 　Rat myocardial apoptosis was induced by ip isoproterenol ( ISO) and
t hen HSYA was ip given to alleviate t he apoptosis. Rat neonatal cardiomyocyte apoptosis was t riggered by
oxygen/ glucose2deprivation/ reperf usion (O GDR) injury. Cardiac tissue was observed by t ransmission elec2
t ron microscopy ( TEM) and cardiac cell apoptosis was assayed by terminal deoxynucleotidyl t ransferase
dU TP nick2end labeling ( TUN EL) staining. Bcl22 and bax gene exp ression was observed by immunohisto2
chemical staining and R T2PCR. The effect of HSYA to inhibit cardio myocyte apoptosis was assayed wit h
t he Flow Cyto Meter . Rhodamine 123 staining was used to measure the change of mitochondrial membrane
potential . Results 　TEM showed t hat mitochondrion swelling and nucleus pyknosis were alleviated by
·429· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 收稿日期 :2008210231　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30171146) ; 北京市中医局科技资助项目 (JJ22006226)
作者简介 :金　鸣 (1957 —) ,男 ,北京人 ,首都医科大学附属北京安贞医院2北京市心肺血管疾病研究所药理研究室主任 ,研究员 ,医学博
士 ,研究方向为中药红花活血化瘀作用机制。Tel : (010) 64456308 　E2mail : jinzang @public3. bta. net . cn
HSYA treat ment . It was shown by TUN EL staining that 60 , 120 , or 240 mg/ kg HSYA decreased t he
apotosis rate of cardiomyocyte in rat s wit h myocardial ischemia. In 120 mg/ kg HSYA2t reated rat s , Bax
expression was down2regulated compared wit h NS t reated rat s. In cultured O GDR cardiomyocytes , HSYA
inhibited t he decrease in mitochondrial membrane potential . Conclusion 　The mechanisms involved in t he
cardiop rotective effect of HSYA are inhibition of cardiomyocyte apoptosis.
Key words : hydroxysafflor yellow A ( HSYA) ; apoptosis ; myocardial ischemia ; mitochondrion
　　红花是菊科植物红花 Cart ham us ti nctori us L .
的干燥花 ,为常用活血化瘀中药 ,性温味辛 ,入心、肝
经 ,具活血通经、化瘀止痛的功效 ,临床上以水煎液
入药。红花含脂肪酸、黄酮、生物碱等多种成分 ,红
花黄色素是红花的主要水溶性组分 ,为多种查耳酮
类物质的混合物。羟基红花黄色素 A ( hydroxy
safflor yellow A , HSYA) 为一种查耳酮苷 ,是红花
黄色素中的主要有效成分 ,其质量分数达生药干质
量的 2 %[ 1 ] ,具有抗心肌缺血[2 ] 、抗凝[3 ] 、促内皮细
胞增殖[4 ,5 ]等心血管系统活性。心肌缺血可造成心
肌细胞坏死和凋亡 ,细胞凋亡早期可表现为线粒体
跨膜电位的下降 ,然后引发一系列凋亡的变化。细
胞凋亡与相关基因关系密切 ,如 C2myc、bax、bcl22、
P53 和 Fas 等基因对调控细胞凋亡均有重要作用。
据报道红花注射液可明显增加大鼠缺血再灌注心肌
组织 Bcl22 蛋白表达 ,降低 Bax 蛋白表达[6 ] ;但红花
的主要活血化瘀有效成分 HSYA 对缺血心肌细胞
凋亡的影响以及对线粒体膜电位的作用均未见报
道。本研究以整体和细胞实验从不同水平观察
HSYA 对心肌细胞凋亡的影响 ,以探讨 HSYA 缓
解心肌缺血的作用机制。
1 　材料与方法
111 　仪器 :瑞典 Schiller 公司产 A T —6 型心电图
机 ;美国 Biomet ra 产 PCR 扩增仪 ;UV755B 型紫外
分光光度计 ;日本 Nikon 公司 , ECL IPSE 80i 型显
微镜。Image Pro Plus 5. 0 图像分析系统。Sanyo
公司产 MCO175 型 CO2 培养箱 ;重庆光学仪器厂
XDS —1B 型倒置显微镜 ; 美国 Coulter 公司 ,
EDICS XL 型流式细胞仪 ;DMIRB + Q500IM L EI2
CA 图像分析系统 ,德国 Leica 公司产品。
112 　药品与试剂 : HSYA 按大孔树脂2凝胶色谱法
自行制备[7 ] , HPL C 面积归一化法测定其整体实验
用 HSYA 质量分数均大于 92 % ,细胞实验所用
HSYA 质量分数大于 96 % ,调至 p H 7. 4 后除菌滤
过备用。盐酸异丙基肾上腺素 ( ISO) 为上海大众
药业 有 限 公 司 产 原 料 药 ; 盐 酸 普 萘 洛 尔
( Propranolol hydrochloride , PPL ) 为天津力生制
药股份有限公司产品 ; 1 ∶250 胰蛋白酶 , 为
Amresco 公司分装 ;胎牛血清和 MOPS 为华美生物
工程公司提供 ;低糖 DM EM 培养基为 Gibco 产品 ;
高纯 CO2及高纯 N2为北京北氧联合气体有限公司
生产 ;细胞培养瓶为 Corning 公司产品 ; Trizol 试剂
为 Invit rogen 公司产品 ;D EPC 为 Genview 公司产
品 ; dN TP 和 r T aq polymerase 为 Takara 公司产
品 ;随机引物、DNA marker 和 M2ML V 为鼎国生物
产品 ;即用型 SABC 试剂盒 ,兔抗 Ig G (Bax , Bcl2
2) ,DAB 显色试剂盒 ,细胞凋亡检测试剂盒为武汉
博士德生物工程有限公司产品 ; Rhodamine 123 为
Sigma 公司产品 ,以二甲基甲酰胺溶解为 1 mmol/ L
使用 ;β2actin、Bcl22、Bax 引物为上海生工生物工程
技术服务有限公司合成 ,其他试剂均为国产分析纯。
113 　动物 :雄性 Wistar 大鼠 200～250 g ,北京维通
利华公司清洁级动物 ,合格证号 SCXX (京) 2002 —
0003。乳鼠为北京安贞医院屏障级动物实验室以北
京维通利华公司清洁级动物繁育 ,雌雄不限。
114 　HSYA 对大鼠急性心肌缺血的影响
11411 　HSYA 缓解大鼠急性心肌缺血所致心肌细
胞凋亡 :实验动物随机分为 6 组 ,即对照组、心肌缺
血模型组、PPL (4 mg/ kg) 组、HSYA 高、中、低剂
量 (240、120、60 mg/ kg) 组。给药组实验过程 :每
日 1 次 ip HSYA 或 PPL 30 min 后 , sc 10 mg/ kg
ISO ,连续 3 d。第 3 天注射 HSYA 前 ip 20 % 乌拉
坦 1 g/ kg 麻醉大鼠 ,注射 ISO 前 5 min 和注射后 5
min 分别记录各组动物 Ⅱ导心电图以观察是否形成
心肌缺血。给予 ISO 后 4 h 腹主动脉取血约 2
mL ,开胸迅速摘取心脏 ,用冷生理盐水冲净其表面
血液后除去心尖大部分白色梗死区 ,留取梗死区边
缘和非梗死区的心尖组织并分为 3 部分 ,第 1 部分
以 4 % 多聚甲醛固定 24 h 免疫组化染色备用 ;第 2
部分冷戊二醛固定用于制备电镜样品 ;第 3 部分剪
碎后加入 Trizol Regent 匀浆后 - 20 ℃保存以备
提取 RNA。对照组以生理盐水 (NS) 代替 ISO 和
药物溶液 ,其他处理均同模型组 ;模型组以 NS 代替
HSYA ,其他处理均同给药组。
·529·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
11412 　心肌组织电镜标本制备及观察 :取心肌组织
3 % 戊二醛固定 ,送中日友好医院电镜室超薄切片 ,
透射电子显微镜下观察照相。
11413 　TUN EL 细胞凋亡检测 :进行依赖核酸内切
酶的末端脱氧核苷酸转移酶 ( Td T) 介导的 dU TP
缺口末端标记 ( TUN EL) ,取心肌组织 4 % 多聚甲
醛固定 24 h 后脱水包埋制成石蜡切片 ,然后脱蜡再
水合 ,再以微波加热至枸橼酸修复液沸腾 ,20 mg/ L
蛋白酶 K 37 ℃消化 5 min ,滴加 3 % H2 O2反应 10
min ,再用末端脱氧核糖核酸转移酶和地高辛标记
的抗地高辛抗体反应混合液进行标记 37 ℃,2 h ,加
转化物过氧化物酶 (peroxidase , POD) 于样本上
37 ℃保温 60 min ,PBS 浸泡 2 次 ,每次 3 min ,样本
加 POD 底物二氨基联苯胶 DAB 进行显色。最后
用苏木素复染 ,中性树脂封片 ,倒置显微镜下镜检 ,
阳性细胞可见棕黄色深染细胞核。在高倍镜下选取
10 个视野 ,用图像分析软件计算呈阳性细胞数占细
胞总数的平均百分率 ,进行组间比较。
11414 　免疫组织化学染色法检测凋亡相关基因
Bax、Bcl22 蛋白的表达 :取心肌组织 4 % 多聚甲醛
固定后 ,石蜡包埋、切片常规脱蜡 ,滴加 3 % H2 O2 ,
微波加热修复抗原。滴加 Bax、Bcl22 一抗 ( 1 ∶
200 ,兔 Ig G) ,37 ℃保温 1 h ,再滴加生物素化山羊
抗兔 Ig G ,37 ℃保温 20 min ,滴加链霉亲和素 ,加
底物二氨基联苯胶 DAB 显色。最后用苏木素复
染 ,中性树脂封片 ,倒置显微镜下镜检 ,阳性细胞细
胞质被染成棕黄色。在高倍镜下选取 10 个视野 ,
用图像分析软件计算呈阳性反应的细胞的积分吸光
度值 ,进行组间比较。
11415 　Trizol 试剂一步法提取总 RNA :心肌组织
每 5～10 mg 加入 1 mL Trizol 试剂匀浆 ,置于 115
mL 离心管内 , 加入 200 μL 氯仿振荡 , 4 ℃、
12 000 ×g 离心 15 min ,取上清液加入 015 mL 异
丙醇沉淀 ,4 ℃、12 000 ×g 离心沉淀 15 min ,75 %
乙醇洗 1 次 ,011 % DEPC2H2 O 溶解 RNA ,然后测
样品 A 260 / A 280 ,计算 RNA 浓度 ;甲醛变性电泳观察
RNA 的完整性。
11416 　凋亡相关基因 bcl22 及 bax mRNA 表达量
的检测 :反转录反应 :7～8μL RNA 70 ℃、10 min ,
冰浴 ,加入随机引物 2μL ,10 mmol/ L dN TP 2μL ,
5 ×反转录缓冲液 8μL ,M2ML V 50 U , H2 O 补足至
总体积 40μL ,37 ℃、5 min ,95 ℃、5 min ,得到反转
录产物。PCR 反应 :选取以 bcl22、bax 为目的基因
的适宜引物 (见表 1) ,以β2actin 为内对照 ,进行半
定量 PCR 反应。体系 :反转录产物 5～7μL ,10 ×
PCR 缓冲液 215μL ,dN TP 10 mmol/ L 2μL ,引物
25 p mol ,r T aq 1 U , H2 O 补足至总体积 25μL 。首
次循环先在 94 ℃变性 5 min ,变性、退火、延伸分别
为 94 ℃、45 s ,56 ℃、45 s ,72 ℃45 s ,共 25 个循环。
聚合酶链反应产物经 115 % 琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,
并以β2actin 为对照 ,电泳条带经灰度扫描后计算并
比较各组 bcl22 及 bax 的相对表达量。
表 1 　bcl22 及 bax 引物序列
Table 1 　Sequence of primers of bcl22 and bax
基因 引物序列 片段长度/ bp
β2actin 正向 :5′2CTACAA T GA GCTGCGT GT GG23′ 540
反向 :5′2CAACGTCACACT TCA T GA TGG23′
bcl22 正向 :5′2TCCA TTA TAA GCT GTCACA G23′ 350
反向 :5′2GAA GA GT TCCTCCACCAC23′
bax 正向 :5′2GCA GA GGA T GA TGTGTGA TG23′ 354
反向 :5′2CTCA GCCCA TCT TCT TCCA G23′
115 　HSYA 对乳鼠心肌细胞的影响 :
11511 　乳鼠心肌细胞的原代培养 :1～3 日龄 Wist2
ar 大鼠乳鼠 ,无菌条件下剪取心室肌 ,含糖 PBS
(Na2 HPO4 4. 3 mmol/ L 、NaCl 137 mmol/ L 、KCl
2. 7 mmol/ L 、KH2 PO4 1. 4 mmol/ L 、葡萄糖 5. 6
mmol/ L , p H 7. 4) 洗去血迹剪碎后加入 0125 % 胰
酶消化液 37 ℃水浴振摇 1 h ,吸出细胞悬液后再加
入半量消化液继续消化 015 h ,合并两次的细胞悬
液 200 目细胞筛滤过 ,78 ×g 离心 8 min 弃上清 ,加
入含 15 % 胎牛血清及 2 000 IU/ L 青霉素的低糖
DM EM 培养液 ,放入 37 ℃、5 % CO2的培养箱中差
速贴壁 115～2 h。调整细胞数量为 3 ×109 / L ,接种
至 25 cm2培养瓶 ,放入 37 ℃、5 % CO2 的培养箱中
培养 ,2～3 d 换培养液 1 次 ,在显微镜下观察细胞
贴壁生长情况及搏动情况。
11512 　HSYA 缓解乳鼠心肌细胞缺糖缺氧再复氧
损伤 : HSYA + 缺糖缺氧/ 再复氧组 :取乳鼠心肌原
代培养细胞 ,以预先用高纯 N2 (99. 9 %) 饱和无糖
台氏液 ( NaCl 137 mmol/ L 、KCl 2. 7 mmol/ L 、
CaCl2 1. 8 mmol/ L 、MgCl2 0. 49 mmol/ L 、Na H2 PO4
0. 42 mmol/ L 、Na HCO3 11. 9 mmol/ L) 置换正常培
养液后 ,加入 HSYA (总体积不到 10μL ) ,于培养
瓶中通入高纯 N2 30 s ,盖紧培养瓶盖 ,37 ℃缺氧放
置 3 h ,而后以含有与缺氧反应时相同剂量 HSYA
的含糖台氏液 (无糖台氏液 + 葡萄糖 1111 mmol/
L) 置换前述含 HSYA 的无糖台氏液 ,旋开培养瓶
盖 ,置 37 ℃空气浴复氧 20 h 即完成反应。缺糖缺
氧/ 再复氧组 :实验过程中不加 HSYA ,其余均同
·629· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
HSYA + 缺糖缺氧/ 再复氧组。对照组 : 以不含
HSYA 的含糖台氏液代替无糖台氏液 ,且不通 N2 ,
其余均同 HSYA + 缺糖缺氧/ 再复氧组。上述实验
结束后取心肌细胞进行各项检测。
11513 　PI 染色流式细胞术检测心肌细胞凋亡比
率 :取缺糖缺氧/ 再复氧处理的心肌细胞 ,用 0125 %
胰蛋白酶消化贴壁和长的心肌细胞 , PBS 洗涤 ,
80 ×g 离心 5 min 去上清 ,加入预冷的 70 % 乙醇混
匀固定后 PBS 重悬 ,再加入终质量浓度为 25 mg/ L
的 RNase 去除 RNA ,加终质量浓度 50 mg/ L 的 PI
染色 37 ℃、30 min ,过 300 目筛后以流式细胞仪
(λe 488 nm/λm 525 nm) 检测。G1 峰前的亚二倍体
峰即为凋亡峰 ,峰面积的变化反映心肌细胞凋亡百
分率的变化。
11514 　线粒体跨膜电位检测 :取缺糖缺氧/ 再复氧
处理的心肌细胞 ,用 01 25 % 胰蛋白酶消化贴壁生
长的心肌细胞 , PBS 洗涤 ,用 PBS 调整至 1 ×106 /
mL 加入荧光探针 Rhodamine 123 使终浓度为 5
μmol/ L ,37 ℃孵育 30 min ,80 ×g 离心 5 min 去上
清 ,PBS 洗涤沉淀 ,80 ×g 离心 5 min 去上清 ,加入
PBS 重新悬浮细胞。设激发波长 450 nm ,发射波长
520 nm ,以流式细胞仪检测 Rhodamine 123 嵌入线粒
体膜后荧光强度变化以反映线粒体膜电位的变化。
以线粒体膜电位比值 (VR = 样品线粒体膜电位/ 对
照组线粒体膜电位) 较客观地反映线粒体膜电位的
变化。膜电位数据均为 3 次平行实验的均值。
116 　统计学方法 :应用 SPSS 1010 软件包 ,结果以
x ±s 表示 ,多组样本的比较采用单因素方差分析和
q检验。
2 　结果
211 　HSYA 对缺血损伤大鼠心肌组织超微结构的
影响 :本实验动物处死前记录 Ⅱ导联心电图的结果
表明 ,第 3 天注射 ISO 后 5 min 心肌缺血组动物
ST 抬高为 (0112 ±0114) mV ,明显高于对照组的
(0100 ±01 00) mV ( P < 01001) ,提示大鼠已形成心
肌缺血。图 1 结果表明 ,正常大鼠的心肌纤维排列
整齐 ,肌丝和肌小节结构清晰 ,线粒体形状大小均
匀 ;心肌缺血模型组大鼠则可见心肌细胞明显肿胀 ,
心肌纤维异常收缩 ,排列紊乱 ,肌丝、肌节溶解破坏 ,
胞核周边凝集 ,线粒体肿胀 ,出现空泡 ,嵴融合 ; PPL
组大鼠可见心肌肌丝偶断 ,线粒体和肌纤维排列较
整齐 ,核较完整 ;60 mg/ kg HSYA 组心肌部分肌丝
断裂 ,线粒体排列欠整齐 ,部分肿胀 ,稍好于心肌缺
血模型组 ;120 mg/ kg HSYA 组心肌肌丝排列欠整
齐 ,部分肌丝断裂 ,线粒体排列欠整齐 ,轻微肿胀 ,但
明显好于心肌缺血模型组 ;240 mg/ kg HSYA 组心
肌肌丝排列整齐 ,线粒体排列较整齐 ,轻微肿胀 ,核
完整。表明 HSYA 可抑制 ISO 诱导的大鼠心肌缺
血所致细胞超微结构改变 ,进而可能起到保护心肌
生理功能的作用。
212 　HSYA 对细胞凋亡 TUN EL 染色的影响 :图
2 所示 ,以 TUN EL 染色法观察 HSYA 对心肌缺血
大鼠心肌细胞凋亡的影响 ,对照组心肌组织排列整
齐 ,细胞核蓝染 ,核质均匀。而心肌缺血模型组细胞
核黄染较多 ,且有的细胞核出现空泡或核固缩。
HSYA 组和 PPL 组心肌组织排列并不似对照组那
样整齐 ,但细胞核黄染较心肌缺血模型组明显减少 ,
且核质较均匀。经 TUN EL 染色所显示的凋亡比
率结果可见 ,心肌缺血模型组凋亡比率较对照组明
显增高 ( P < 0101) ,而 HSYA 组和 PPL 组较心肌
缺血模型组凋亡比率明显降低 ,见表 2。
213 　HSYA 对心肌组织中凋亡相关基因 Bax 及
Bcl22 蛋白表达的影响 :由表 2 结果可见 ,心肌缺血
模型组 Bax 的表达量较对照组明显提高 ( P <
0101) ,而 HSYA 组和 PPL 组 Bax 表达量则较心
肌缺血模型组有降低趋势 , 特别是 120 mg/ kg
HSYA 组明显降低。与对照组比较 ,其余各组的
Bcl22 表达量均见升高趋势 , HSYA 组和 PPL 组
Bcl22 表达量较心肌缺血模型组有增高趋势 ,但无统
计学意义。
214 　HSYA 对心肌组织 bcl22 及 bax mRNA 表达
量的影响 :由表 3 结果可见 ,心肌缺血模型组 bax
mRNA 的表达量较对照组明显升高 ( P < 0101) ,而
HSYA 组和 PPL 组较心肌缺血模型组 bax mRNA
表达量降低 ,且 HSYA 120、240 mg/ kg 及 PPL 4
mg/ kg 组的差异有统计学意义。与对照组比较 ,其
余各组的 bcl22 表达量均见升高 ,且 HSYA 组较心
肌缺血模型 bcl22 表达量有升高趋势 ,但无统计学
意义。
215 　HSYA 对缺糖缺氧/ 再复氧损伤心肌细胞凋
亡比率与线粒体跨膜电位的作用 :表 4 结果可见 ,缺
糖缺氧/ 再复氧使心肌细胞凋亡率明显增加 ( P <
0101) , HSYA 可明显抑制缺糖缺氧/ 复氧所致心肌
细胞凋亡 ( P < 0105、0101) 。对照组心肌细胞膜电
位较高 ,经缺糖缺氧/ 再复氧损伤后的心肌细胞膜电
位降低 ,提示线粒体膜出现去极化。不同剂量的
HSYA组膜电位降低情况均有明显缓解 ,提示
HSYA 可缓解线粒体膜电位的下降。
·729·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 　讨论
　　细胞中存在着促细胞凋亡基因、抑制细胞凋亡
基因和细胞凋亡过程中表达的基因 ,其综合作用调
控着细胞凋亡的过程。Bcl22 基因家族是调节细胞 凋亡的主要基因家族 ,现已发现的成员有 Bcl22、Bcl2X1、Bcl2Xs、Bax 及 Mcl21 等。其中 Bax 蛋白可通过孔道形成增加线粒体外膜通透性促进凋亡 ,而Bcl22 则可与 Bax 结合抑制其作用而缓解凋亡。线
·829· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
表 2 　HSYA 对心肌缺血大鼠心肌 Bax 和 Bcl22 蛋白表达
及 TUNEL 着色细胞阳性率的影响 ( x ±s , n = 8)
Table 2 　Effect of HSYA on Bax and Bcl22 protein
expression in myocardium and TUNEL
positive rate of rats with myocardial
ischemia ( x ±s , n = 8)
组别 剂量/ (mg·kg - 1 ) Bax Bcl22 TUNEL 阳性细胞/ %
对照 - 80 093 ±16 740 76 278 ±14 711 0149 ±0124
模型 - 135 609 ±28 846 △△ 112 561 ±21 405 △△ 4136 ±2100 △△
HSYA 60 108 632 ±12 149 109 134 ± 9 510 0121 ±0110 3 3
120 117 380 ±21 641 3 113 083 ±16 485 0138 ±0120 3 3
240 122 902 ±18 642 123 353 ± 9 567 0175 ±0126 3 3
PPL 　4 115 397 ±22 266 126 211 ±17 317 0166 ±0143 3 3
　　与对照组比较 : △△P < 0101
　　与模型组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101
　　△△P < 0101 vs cont rol group
　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs model group
表 3 　HSYA 对心肌缺血大鼠心肌 bax 和 bcl22 m RNA
表达的影响 ( x ±s , n = 8)
Table 3 　Effect of HSYA on bax and bcl22 mRNA
expression in myocardium of rats with
myocardial ischemia ( x ±s , n = 8)
组别 剂量/ (mg ·kg - 1 ) bax/β2actin bcl22/β2actin
对照 - 01 80 ±01 49 01 38 ±0121
模型 - 11 86 ±01 21 △△ 01 55 ±0140
HSYA 60 11 59 ±01 53 01 56 ±0161
120 11 34 ±01 18 3 3 01 77 ±0147
240 11 33 ±01 21 3 3 01 98 ±0149
PPL 　4 11 35 ±01 26 3 3 01 52 ±0140
　　与对照组比较 : △△P < 0101 ; 　与模型组比较 : 3 3 P < 01 01
　　△△P < 0101 vs cont rol group ; 3 3 P < 0101 vs model group
表 4 　HSYA 对缺糖缺氧/ 再复氧损伤心肌细胞凋亡率
及线粒体膜电位的影响 ( x ±s , n = 6)
Table 4 　Effect of HSYA on apoptosis rate and mitochondrion
membrane potential of cardiomyocytes injured
by oxygen2glucose2deprivation/ reperfusion
( x ±s , n = 8)
组 　别 C/ (mmol ·L - 1 ) 凋亡率/ % VR
对照 - 31 94 ±1166 11000 ±01 078
缺糖缺氧/ 再复氧 - 71 53 ±2155 △△ 01785 ±01 046 △△
HSYA 0164 31 51 ±1155 3 3 01890 ±01 117
113 31 73 ±1144 3 3 01971 ±01 127 3
215 41 81 ±1173 3 01969 ±01 155 3
　　与对照组比较 : △△P < 0101 ;
　　与缺糖缺氧/ 再复氧组比较 : 3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01
　　△△P < 0101 vs cont rol group ; 3 P < 01 05 　3 3 P < 0101 vs oxy2
gen2glucose2deprivation/ reperfusion group
粒体与细胞凋亡的关系是目前研究的热点 ,而众多
因子引起线粒体膜通透性的增高为引发细胞凋亡的
重要环节。线粒体内膜的低通透性和离子浓度梯度
的存在是维持跨膜电位的基础。跨膜电位下降为细
胞凋亡的早期变化 ,许多诱导剂引发细胞凋亡时均
可见线粒体膜电位的下降 ,一旦线粒体跨膜电位崩
溃 ,则细胞凋亡不可逆转。线粒体被激活时 ,膜通透
性增加 ,膜电位下降 ,细胞色素 C、Smac (second mi2
tochondria2derived activator of caspase) 、凋亡诱导
因子和核酸内切酶 G 等细胞凋亡蛋白释放到胞质
中 ,细胞色素 C 迅速与 Apaf21 (Apoptosis Protease
Activating Factor 1) 结合 ,引起 caspase29 的活化 ,
紧接着 casepase23、casepase26、casepase27 被激活 ,
导致细胞凋亡。线粒体释放的 Smac 等因子可以通
过去除凋亡蛋白抑制剂直接活化效应器 caspase ,
A IF 转移至胞核迅速引起染色质凝聚 ,而核酸内切
酶 G 可以通过切割染色质 DNA 引起 DNA 的断
裂 ,这些作用都诱发了细胞的凋亡[8 ,9 ] 。Rh123 是
一种亲脂性阳离子荧光染料 ,可结合到线粒体基质 ,
其荧光的增强或减弱可反映线粒体内膜电位的变
化。本实验结果表明 ,正常心肌细胞线粒体膜电位
较高 ,缺糖缺氧再复氧损伤后线粒体膜电位减低 ,不
同剂量的 HSYA 组膜电位下降均有明显缓解 ,提示
保护线粒体、改善能量代谢可能为 HSYA 缓解心肌
细胞缺血所诱导的凋亡的重要机制。另外发现
HSYA 可抑制 ISO 造成的心肌缺血模型大鼠心肌
组织 bax mRNA 表达量的增加 ,提示 HSYA 可通
过影响凋亡相关基因的表达变化缓解心肌缺血导致
的心肌细胞凋亡。
ISO 是β受体激动剂 ,其诱发的大鼠急性心肌
缺血与β肾上腺素受体激动、促进心肌收缩和耗氧
量增加有关。本研究 TUN EL 染色结果表明 ,
HSYA 处理组和 PPL 处理组较心肌缺血组凋亡比
率明显降低 ,提示 HSYA 可缓解 ISO 引起心肌缺
血所诱导的心肌细胞凋亡。本实验结果表明 ,
HSYA 和 PPL 均可减轻 ISO 所造成的心肌细胞排
列紊乱和线粒体肿胀 ,而 PPL 为β受体阻滞剂 ,且
发现 HSYA 具β受体拮抗作用[10 ] ,提示 HSYA 可
通过拮抗β受体减轻心肌细胞损伤 ,这可能也是其
缓解 ISO 所致心肌缺血的机制之一。
红花黄色素作为治疗冠心病心肌缺血的药物已
经上市 ,虽然目前对于其缓解心肌缺血的研究已有
不少报道 ,但由于中药的复杂性 ,对于红花黄色素中
各种成分的作用机制还应该进行更细致的研究。多
组分多靶点的协同作用是中药作用的特点 ,从各个
角度深入分析研究中药有效成分的作用机制并对其
进行综合分析 ,对于指导临床用药 ,对于发展中医理
论 ,具有重要的理论与现实意义。
·929·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
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栀子和地黄环烯醚萜类成分抗炎作用的虚拟评价
邢 　洁1 ,2 ,徐为人2 3 ,刘 　鹏2 ,刘冰妮2 ,符海霞1 ,2 ,刘 　巍2 ,王玉丽2 ,汤立达3
(11 天津医科大学基础医学院 ,天津 　300070 ; 21 天津药物研究院 天津市新药设计与发现重点实验室 ,天津 　300193 ;
31 天津药物研究院 天津药代动力学与药效动力学省部共建国家重点实验室 ,天津 　300193)
摘 　要 :目的 　研究理论评价方法的合理性 ,对栀子和地黄内所含的环烯醚萜类化合物的抗炎作用可能机制进
行虚拟评价。方法 　选择炎症相关的 39 个受体晶体结构 ,利用 Schro¨dinger 软件计算小分子、受体活性位点的
描述指标和对接结果 ,考察对接得分中的非特异成分。结果 　配体的非特异得分与其分子特征描述符存在明显
的相关性 ,主要包括 chilv_ C、PEO E_ VSA25、SlogP_VSA3、SlogP_ VSA5 4 个指标。分子经过评价后发现代号为
M7、M9、M11 的环烯醚萜类化合物与抗炎类受体双特异性促分裂原活化蛋白激酶的结合较好。结论 　阐明了分
子特征描述符与非特异性得分的相关性模型 ,提出了选择性作用的分级评价标准 ,揭示了部分环烯醚萜类成分可
能的机制。
关键词 :栀子 ; 地黄 ; 环烯醚萜类 ; 抗炎作用 ; 虚拟评价 ; 非特异性评分
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0620930206
Virtual evaluation on anti2inflammatory activity of iridoids from cape jasmine fruit
and adhesive rehmannia root
XIN G Jie1 ,2 , XU Wei2ren2 , L IU Peng2 , L IU Bing2ni2 , Fu Hai2xia1 ,2 , L IU Wei2 ,
WAN G Yu2li2 , TAN G Li2da3
(11 School of Fundamental Medical Sciences , Tianjin Medical University , Tianjin 300070 , China ; 2. Tianjin Key Laboratory
of Molecular Design and Drug Discovery , Tianjin Institute of Pharmaceutical Research , Tianjin 300193 , China ;
3. Tianjin State Key Laboratory of Pharmcokinetics and Pharmacodynamics , Tianjin Institute
of Pharmaceutical Research , Tianjin 300193 , China)
Abstract : Objective 　To improve t he t heoretical evaluation met hod and elucidate t he anti2inflammatory
mechanisms of iridoids f rom adhesive rehmannia root and cape jasmine f ruit . Methods 　Thirty2nine crystal
st ruct ures of p roteins related inflammation were used as t he receptors for calculation. The descriptors for
active site of receptors and molecules were calculated by Schro¨ dinger sof tware package. The docking calcu2
lation was carried out wit h Glide standard met hod and score. Results 　The no2specific score of ligand
obviously correlated wit h molecular descriptors , including chilv _ C , PEO E_ V ES25 , SlogP _ VSA3 , and
SlogP_VSA5. After virt ual evaluation , M7 , M9 , and M11 of iridoids were found to have a potential bind2
ing ability with dual specificity mitogen2activated protein kinase kinase. Conclusion 　The no2specific score
could be p redicted wit h t he related model of molecular descrip tors. With the improved grading standards ,
t he possible anti2inflammatory mechanism of iridoids could be discovered.
·039· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 收稿日期 :2008212217　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :科技部支撑项目 (2007BAI41B01) ; 天津市支撑项目 (07ZCKFSH00300)
作者简介 :邢　洁 ,女 ,内蒙古人 ,硕士研究生 ,研究方向为新药设计和筛选。E2mail : xingyaojun @163. com3 通讯作者　徐为人　Tel : (022) 23003529 　E2mail : xwrtj @yahoo. com. cn