全 文 ：3 结论
3. 1 三七上喷施烯酰吗啉可溶性粉剂,其在三七块
根内的半衰期为6. 2 d,茎叶内的半衰期为3. 9 d、在
土壤中的半衰期为 5. 0 d,尤其在三七植株和土壤中
的降解较快。
3. 2 三七生长过程中,按常规浓度和频次施用烯酰
吗啉,最后一次施药距采挖时间 25 d以上, 其在三
七及茎叶中烯酰吗啉残留量小于日本肯定列表规定
三七中烯酰吗啉限量( [ 0. 1 mg/ kg) ,在土壤中的
残留量为低于 0. 02 mg/ kg。
按三七传统栽培方法,为节约成本和降低农药
残留,在三七采挖前一月左右, 不再施用农药,就烯
酰吗啉而言,只要控制好用药剂量和间隔期,既可有
效防治三七病害, 又可保证三七质量安全。
参考文献:
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含羞草中 6种黄酮苷的 RP-HPLC测定
朱建鑫1, 2 ,袁 珂1*
( 1.浙江林学院 天然药物研发中心,浙江 临安 311300; 2.河南中医学院药学院 ,河南 郑州 450008)
摘 要:目的 建立 RP-H PLC 法同时测定含羞草中 6 种黄酮苷的量。方法 采用高效液相色谱法, 色谱柱为Wa-
ter s XBr idge C18柱 ( 250 mm @ 4. 6 mm, 5 Lm) , 流动相: 甲醇 ( A )-1%冰醋酸水溶液 ( B) ( 25 B 75) , 体积流量 0. 8
mL/ min,柱温 25 e , 检测波长 340 mm。结果 6 个成分均能达到基线分离, 异荭草苷( Ñ )、荭草苷( Ò )、5, 7, 3c,
4c-四羟基-8-C- [A-L-鼠李糖- ( 1 y 2) ]-B-D-葡萄糖苷( Ó )、牡荆苷( Ô )、异牡荆苷( Õ )、5, 7, 3c, 4c-四羟基-8-C- [B-D-
芹糖- ( 1 y4) ]-B-D-葡萄糖苷( Ö )的线性范围分别为 0. 260~ 1. 300 Lg ( r = 0. 999 9) , 0. 490 ~ 2. 450 Lg ( r =
0 . 999 9 ) , 0. 700~ 3. 500 Lg ( r = 0 . 999 9 ) , 0. 276~ 1. 380 Lg ( r= 0 . 999 8 ) , 0. 266~ 1. 330 Lg ( r= 0 . 999 9 ) ,
0. 750~ 3. 750Lg ( r= 0 . 999 7 ) ; 平均回收率分别为 98. 6% ( RSD= 2. 31% ) , 98. 2% ( RSD= 2. 04% ) , 96. 4%
( RSD= 1. 85% ) , 96. 9% ( RSD= 1. 47% ) , 97. 3% ( RSD= 2. 19% ) , 97. 5% ( RSD= 1. 76% )。结论 本研究所建立
的方法操作简便、结果可靠, 为该类药材的入药及资源的质量评价提供了实验依据。
关键词:含羞草; 黄酮苷; RP-H PLC
中图分类号: R2821 6 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2009) 05 0812 03
含羞草为豆科( Legumino sae)含羞草属植物含
羞草 Mimosa p ud ica L.的全草 [ 1]。原产于热带美
洲,现广泛分布于世界热带地区,我国主要分布在华
南、华东、西南等地的山坡丛林、湿地、路旁, 植物资
源丰富。含羞草具有清热利尿、化痰止咳、安神止痛
之功效,临床多用于急性肝炎、肺结核咳血及带状疱
疹等症[ 2]。在前期研究中, 已从含羞草全草中分离
得到了黄酮苷类、酚类等化合物[ 3~ 7] 。在上述研究
的基础上建立了含羞草中 6种黄酮苷的 HPLC 测
定方法,并对采自不同地区的含羞草叶及茎进行了
定量测定分析, 为有效控制含羞草的质量及进一步
开发利用含羞草资源提供了参考依据。
1 仪器、试剂与材料
Water s 2695 高效液相色谱仪, W aters 2996
PAD检测器; Empow er 色谱工作站; AB265-S 分析
天平(瑞士 Mett ler To ledo 公司) , M illipo re超纯水
机(法国 M illipo re公司) ,甲醇、乙腈为色谱纯试剂,
水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
5, 7, 3c, 4c-四羟基-8-C-[ A-L-鼠李糖-( 1y2) ]-B-
D-葡萄糖苷、5, 7, 3c, 4c-四羟基-8-C-[ B-D-芹糖-( 1y
4) ]-B-D-葡萄糖苷、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆
苷 6种对照品均由本实验室分离得到,通过1H-NMR
和13C-NMR、MS测定[ 3~ 7] ,并与相关文献报道对比确
证了结构,且通过 HPLC峰面积归一化法标定质量分
数均在 98%以上。含羞草样品于2007年8月分别采
自三亚、南宁、广州及福州不同地区,由海南大学药用
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* 收稿日期: 2008- 08-04 基金项目:浙江省森林培育重中之重学科开放基金资助项目( 200607)作者简介:朱建鑫( 1984 ) ) ,男,硕士,主要从事中药化学成分研究。
* 通讯作者 袁 珂 T el: ( 0571) 63743607 E- mai l: yuan _ke001@ 163. com
植物学教授黄世满鉴定为豆科( Leguminosae)含羞草
属植物含羞草Mimosa pudica L1。
2 方法与结果
21 1 色谱条件:色谱柱为 Waters XBridge C18柱( 250
mm @ 4. 6 mm, 5 Lm) ;流动相:甲醇-1%冰醋酸水溶液
( 25B75) ;洗脱时间: 60 min;体积流量0. 8 mL/ min;检
测波长为 340 nm,柱温 25 e 。在此色谱条件下, 6种
黄酮苷类成分能达到较好分离,与相邻色谱峰的分离
度均大于2. 0,理论塔板数均大于 10 000,托尾因子在
1. 5~ 2. 0。对照品溶液和样品溶液的色谱图见图 1。
Ñ-异荭草苷 Ò -荭草苷 Ó-5, 7, 3c, 4c-四羟基-8- C-[A- L-鼠李糖-( 1y 2) ]-B- D-葡萄糖苷 Ô-牡荆苷
Õ-异牡荆苷 Ö-5, 7, 3c, 4c-四羟基- 8-C-[B-D-芹糖-( 1y 4) ]-B-D-葡萄糖苷
Ñ- isorient in Ò -orient in Ó- 5, 7, 3c, 4c-trih yd rox y-l 8-C- [A-L-rhamnopyranosy-l ( 1y 2) ]-B- D-glucopyranosyl fl avone
Ô-vitex in Õ-is ovitexin Ö- 5, 7, 3c, 4c-trih ydroxy-l 8-C-[B-D- apios e- ( 1y 4) ]-B-D-glucopyran os yl f lavone
图 1 对照品( A)、含羞草叶( B)和含羞草茎( C)的 HPLC图谱
Fig. 1 HPLCChromatograms of reference substances ( A) , M1 pudica leaves ( B) , and M1 p udica stems (C)
21 2 对照品溶液的制备: 分别精密称取异荭草苷
1. 63 mg、荭草苷 2. 45 mg、牡荆苷 1. 38 mg、异牡荆
苷1. 33 mg、5, 7, 3c, 4c-四羟基-8-C-[A-L-鼠李糖-
( 1y 2) ]-B-D-葡萄糖苷 3. 50 mg、5, 7, 3c, 4c-四羟基-
8-C-[B-D-芹糖-( 1 y 4)-B-D-葡萄糖苷 3. 75 mg , 混
合后分别用 75% 甲醇水溶液超声溶解, 定容至
25 mL的量瓶中, 制成质量浓度分别为65. 2、98. 0、
55. 2、53. 2、140. 0、150. 0 mg/ mL 的混合溶液, 经
0. 45 Lm微孔滤膜滤过,滤液作为对照品溶液。
2. 3 样品溶液的制备:将含羞草样品置 50 e 烘箱
中干燥至恒定质量, 粉碎成细粉,过 100目筛。精密
称取各待测样品 1. 0 g,加入 70%甲醇 30 mL 浸泡
6 h后,每次加入 70%甲醇 30 mL, 超声提取 2次,
每次 30 min, 滤过。合并滤液, 浓缩干后用适量水
分散, 分别用乙醚、醋酸乙酯萃取。分去有机层,水
层减压浓缩至干, 用 75%甲醇水溶液溶解定容, 经
0. 45 Lm微孔滤膜滤过, 滤液作为样品溶液, 备用。
2. 4 线性关系考察:对照品混合溶液采用自动梯度
进样,进样量分别为 5、10、15、20、25 LL,按照/ 2. 10
项下的色谱条件测定。以对照品进样量为横坐标,
色谱峰面积值为纵坐标绘制标准曲, 计算回归方程,
见表 1。
表 1 6 种黄酮苷的回归方程
Table 1 Regression equation of six kinds of glycosyl flavones
黄酮苷 回归方程 r 线性范围/Lg
异荭草苷( Ñ ) Y= 2. 61@ 103 X - 1. 57@ 105 0. 999 9 0. 260~ 1. 300
荭草苷( Ò ) Y= 4 . 62 @ 103 X - 1 . 04 @ 10 5 0. 999 9 0. 490~ 2. 450
5, 7, 3c, 4c-四羟基-8- C-[A- L-鼠李糖-( 1y 2) ]-B- D-葡萄糖苷( Ó ) Y= 2 . 23 @ 10 3 X - 1 . 05 @ 105 0. 999 9 0. 700~ 3. 500
牡荆苷( Ô ) Y = 4 . 46 @ 103 X- 7 . 63 @ 104 0. 999 8 0. 276~ 1. 380
异牡荆苷( Õ ) Y= 4 . 62 @ 10 3 X - 1. 04@ 105 0. 999 9 0. 266~ 1. 330
5, 7, 3c, 4c-四羟基-8- C-[B- D-芹糖- ( 1y 4) ]-B-D-葡萄糖苷( Ö ) Y= 2 . 15 @ 10 3 X - 7 . 96 @ 10 4 0. 999 7 0. 750~ 3. 750
21 5 精密度试验: 精密吸取混合对照品溶液, 按
/ 21 10项下的色谱条件连续进样 5次, 进样量为 10
LL, 记录 6种黄酮苷的峰面积,计算 RSD 值。结果
Ñ ~ Ö 的 RSD 分别为 21 83%、11 86%、21 27%、
21 63%、21 62%、21 79%。
216 重现性试验:精密称取同一批含羞草样品 5份,
每份 1 g,按/ 21 30项下样品溶液的制备方法制备样品
溶液,每种样品溶液测定 3次, 每次进样 10 LL,取平
均值。按照/ 21 10项下的色谱条件进行分析, 计算 6
种黄酮苷质量分数,结果Ñ~ Ö的 RSD分别为1. 16%、
1. 35%、1. 48%、2. 52%、1. 76%、2. 44%。
21 7 稳定性试验:取/ 21 30项下的样品溶液,室温放
置,分别于 0、2、4、6、8、10、12 h, 按照/ 21 10项下的色
谱条件进样10 LL测定,记录峰面积值。结果Ñ~ Ö的
RSD分别为 01 86%、11 32%、21 12%、1196%、21 08%、
11 94%,表明样品溶液在 12 h内稳定。
21 8 加样回收率试验:精密称取 5份已测定的同一
批含羞草样品,每份分别精密加入/ 21 20项下的对照
#813#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
品溶液 5 mL,按照/ 21 30项下样品溶液的制备方法
制得样品溶液, 按/ 21 10项下的色谱条件进行测定。
结果 Ñ ~ Ö 6 个成分的平均回收率分别为 981 6%、
98. 2%、96. 4%、96. 9%、97. 3%、97. 5% , RSD分别
为 2. 31%、2. 04%、1. 85%、1. 47%、2. 19%、1. 76%
( n= 5 )。
21 9 样品测定:分别取采自不同产地的含羞草样品
(叶和茎) ,按照/ 21 30项下样品溶液的制备方法进行
提取,经 0. 45 Lm 微孔滤膜滤过, 分别制成样品溶
液,按照/ 21 10项下的色谱条件进行测定,进样量 20
LL,采用外标法以峰面积计算 6种黄酮苷的质量分
数,结果见表 2。
表 2 含羞草中 6 种黄酮苷的测定结果 ( n= 3 )
Table 2 Determination of six kinds of glycosyl flavones inM1 pudica (n= 3 )
地区 含羞草叶/ ( mg # g- 1 )Ñ Ò Ó Ô Õ Ö
含羞草茎/ ( m g # g- 1)
Ñ Ò Ó Ô Õ Ö
三亚 0. 853 1. 283 2. 450 0. 575 0. 623 2. 250 0. 658 0. 821 1. 640 ) ) 1. 590
广州 0. 792 1. 061 2. 361 0. 421 0. 596 2. 146 0. 536 0. 721 1. 425 ) ) 1. 206
南宁 0. 821 1. 170 2. 436 0. 612 0. 606 2. 179 0. 612 0. 798 1. 539 ) ) 1. 527
福州 0. 683 0. 982 2. 075 0. 386 0. 564 1. 632 0. 513 0. 693 1. 327 ) ) 1. 009
3 讨论
31 1 流动相的选择:以甲醇-水系统洗脱, 6种黄酮
苷成分不能完全分离, 色谱峰的峰形及分离度均较
差。冰醋酸可以抑制样品的电离, 改善拖尾现象, 因
此在流动相中加入冰醋酸进行考察。分别用0. 1%、
0. 5%、1. 0%的冰醋酸水溶液进行实验,流动相比例
选用 35B 65 和 25B 75, 结果表明当冰醋酸浓度为
1. 0% ,比例为 25 B75时, 6种黄酮苷成分达到了较
好的分离,拖尾现象明显改善。
31 2 检测波长、柱温和体积流量的选择: 利用二极
管阵列检测器检测, 得到 200~ 500 nm 各波段的三
维色谱及光谱图。结果表明, 6种黄酮苷成分在 340
nm 波长下均有较大吸收, 且响应值适中, 各峰分离
效果好,故选择 344 nm 作为检测波长。对柱温 20、
25、30 e 和体积流量 0. 5、0. 8、1. 0 mL/ min进行考
察,在柱温 25 e ,体积流量 0. 8 mL/ min 时各峰的
出峰时间及分离度较好。
根据上述实验结果, 选择以甲醇( A)-1% 醋酸
水溶液( B) ,洗脱比例: 25( A) , 75% ( B) ; 洗脱时间:
60 m in; 体积流量 0. 8 mL/ min; 检测波长为 340
nm ;柱温 25 e 为色谱优化条件。
31 3 由表 2可以看出,不同地区的样品由于生长环
境(土壤、温度和光照等)不同,其有效成分的量有一
定差异。总体上看黄酮苷的量以海南三亚为最高;
从同一地区的样品来看, 含羞草叶比茎中有效成分
的量明显高出许多。
我国含羞草资源丰富,在民间作为一种草药偶有
临床应用,但由于对其化学成分及其量分布不够明
确,因此一直以来影响了含羞草的开发利用。本实验
在明确其化学成分的基础上,建立了含羞草中 6种黄
酮苷的 HPLC定量测定方法,并对采自不同地区、不
同部位含羞草样品中 6种黄酮苷成分的量进行了同
时测定与分析。该研究结果为进一步了解不同产地、
不同自然环境条件下含羞草中黄酮苷量的分布规律
以及对其进一步开发利用提供了理论及科学依据。
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#814# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月