全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月·913·
参考文献：
[1]姚宗凡，黄英资．姚晓敏．药用植物栽培手册[M]．上海：
上海中医药大学出版社．2001．
[2]高文远，贾伟．药用植物大规模组织培养[M]．北京：化
学工业出版社，2005．
[3]刘合刚，刘国牡．射干速生高效栽培技术[J]．中草药，
2001，32(8)：749—751．
[4]崔翠，王季春，何凤发．等．光照时间和碳源对试管薯形
成的影响[J]．西南农业大学学报，2001，23(6)：547-548．
[5]史玮，王蒂．马铃薯试管薯诱导影响因素的研究[J]．甘
肃科技，2007，23(Z)：204—206．
[6]自淑霞，安忠民，冯学赞，等．马铃薯试管薯诱导因子研究
图2试管根茎的发芽率 [73呈袭善只亍麓’芸茹，15等(5．)：影2响71-大27岩3．桐试管块茎形成的
Fig．2Germinationrateofrhizomeinvitro 若干因素口]．上海师范大学学报：自然科学版，2006，35
研究。 (5)：71—75·
本实验初步探索出射干试管根茎诱导的最佳培 ‘83掣蠢乞基焉?，冀琵’6●。试管芋诱导的研究啪·园艺
养基为MS+6一BA2mg／L+NAA0．5mg／L+白糖 [9]何弈昆，朱长甫，何孟元，等·半夏小块茎的形态发生及人
6％。发芽率可以达到61．03％。研究数据为今后相关[。。]喜墓季糍翌：篓兰茎≮薯釜嚣≥术48的2-研48究5．[J]．中
方面的研究和射干工厂化生产育苗提供理论依据。 国中药杂志·2001，27(11)：824—827·
烟草悬浮培养细胞对呋喃橐吾酮的生物转化研究
严春艳h2，于荣敏¨，吕华冲1，张德志1
(1．广东药学院药科学院，广东广州 510006}2．暨南大学药学院，广东广州510632)
摘 要：目的 研究烟草悬浮培养细胞对呋喃橐吾酮(I)的生物转化。方法将外源底物呋喃橐吾酮乙醇溶液投
入预培养i0d的烟草悬浮培养细胞中，共培养4d后终止转化，通过HPLC检测方法，并利用各种色谱技术分离纯
化转化产物，最后根据其理化性质和光谱数据进行结构鉴定。此外，实验还考察了共培养时间对转化率的影响。结
果呋喃橐吾酮(1)在烟草细胞中发生了转化，分离鉴定出两个转化产物：3-OXO—eremophila一1，7(11)-dien一12，8一
olide(1)和3-OXO一8一hydroxyeremophila一1，7(11)一dien一12，8-olide(I)。转化的最佳共培养时间为5d，此时总的摩
尔转化率最高(53．1％)。结论首次利用烟草悬浮培养细胞转化倍半萜类化合物呋喃橐吾酮并获得成功。
关键词：烟草；悬浮培养；生物转化；呋喃橐吾酮
中图分类号：R282．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)06—0913一04
BiotransformationffurannoljgularenonebycellsuspensionculturesofNicotianat b cum
YANChun—yanl，YURong—min2，LUHua—chon91，ZHANGDe—zhil
(1．CollegeofPharmacy，GuangdongPharmaceuticalUn versity，Guangzhou510006，ChinaI
2．CollegeofPharmacy，JinanUn versity，Guangzhou510632，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatethebiotransformationffurannoligularenonebycellsusp nsion
culturesofNicotianat b cum．MethodsFurannoligularenonewasddedt thmediumofthesuspension
cellsofN．tabacumafterprecuhuredfor10 ．thentheywereco—culturedforanother4d．The
biotransformedproductsweredetectedwithHPLCandisolatedbyvariouschromatographicmethods．The
chemicalstructuresofbiotransformedproductswereelucidatedon hebasisoftheirphysicochemicalpro—
pertiesandspectroscopicdata．Otherwise，thenfluenceofCO—culturedtimeonconversionratiowas
investigatedeither．ResultsThesubstrate，furannoligularenone(I)，wassuccessfullybiotransformed
收稿日期：2007—09—26
作者简介：严春艳(1978一)，女．吉林人．博士，研究方向为天然药物活性成分的生物合成与生物转化。E—mail：ycybridge@163．com
*通讯作者 于荣敏 Tel：(020)85220386E—mail：tyrm@jnu．edu．cn
万方数据
·914· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月
byN．tabacumculturedcells．Twoproducts，3-oxo—eremophila一1，7(11)-dien一12，8一olide(I)and3-oxo-
8一hydroxyeremophila一1，7(11)-dien一12，8-olide(I)wereobtained．AfterCO—culturedfor5 ，themole
conversionratioofthesubstrateeachedthehighest(53．1％)．ConclusionIt’Sthefirstreport011
biotransformationffurannoligularenonebyN．tabacumculturedcells．
Keywords：NicotianatabacumL．；suspensioncultures；biotransformation；furannoligularenone
生物转化(biotransformation)，也称生物催化，
是指利用植物离体培养细胞、固定化的植物(或微生
物)细胞或酶等，对外源底物进行结构修饰而获得更
有价值产物的一种技术。植物细胞对底物具有酯化、
氧化、羟基化、糖基化、甲基化和乙酰化等多种转化
能力。生物转化技术被广泛应用于药物结构修饰、药
物代谢研究、新能源开发等领域。利用生物转化手段
对底物进行结构修饰，获得一系列化合物，进一步探
讨其构效关系，从中找到有新药开发价值的先导化
合物及其可能的生物合成途径，有着重要的理论意
义和实际应用价值[1’2]。
自1973年基因工程诞生以来，烟草Nicotiana
tabacumL．以其易于进行组织培养，容易得到再生
的转化植株而成为典型的基因工程模式植物，被誉
为植物界的“果蝇”。早在1980年Suga[33研究组就利
用烟草细胞对松油醇及其衍生物进行结构修饰，推
动了植物生物转化的快速发展。虽然人们利用其他
植物体系对生物转化进行了一些研究，但是烟草仍
然是国内外学者研究植物生物转化应用最多的培养
系统之一。
呋喃橐吾酮(furannoligularenone)属于eremo-
philane型倍半萜，为菊科橐吾属植物的主要活性成
分L‘]。该属多种药用植物的根及根茎用作中药紫菀
的代用品，有很长的药用历史，具有止咳化痰、活血
化瘀等功效。本实验首次利用烟草悬浮培养细胞对
外源底物呋喃橐吾酮进行了生物转化的研究，以期
获得活性转化产物，并对其生物合成的途径进行
探讨。
1材料与试剂
1．1 仪器与试剂：雷磁pHS～25数显pH计，上海
精密科学仪器有限公司；LDZX一40BI型立式自动
压力蒸气灭菌锅，上海申安医疗器械厂；HZQ—QX
全温振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；
EYELA旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；
SGWX一4显微熔点仪，上海精密科学仪器有限公
司；BurkerAdvance400MHz核磁共振波谱仪，
Bruker公司；HPLC：Agilent1200系列，自动进样
器及DAD检测器；色谱柱：PhenomenexC18(250
mm×4．6mm，5弘m)，美国菲罗门公司；Sephadex
LH一20，AmershamPharmaciaBiotechAB；色谱纯
甲醇由江苏汉邦试剂有限公司生产。薄层色谱硅胶，
青岛海洋化工厂。
1．2 底物：呋喃囊吾酮，质量分数>98％(HPLC
检测)。
1．3 培养体系：培养体系为本实验室利用烟草Ⅳ．
tabacumL．种子所培养的试管苗，然后经诱导得到
愈伤组织，培养数代后得到的烟草悬浮培养细胞系。
2实验方法
2．1烟草细胞培养体系的建立：以MS+1．0mg／L
2，4一D+0．2mg／LKT为基本培养基，蔗糖30g／L，
灭菌前pH值调至5．75，分装至250mL培养瓶中，每
瓶100mL。121℃高压灭菌20min。控制接种量为
每100mL培养基5g鲜质量烟草细胞，12d继代一
次。25℃暗培养，摇床转速110r／min。悬浮培养连
续继代3次后，获得稳定生长的液体培养体系，可用
作生物转化实验。
2．2烟草液体培养细胞生长曲线的绘制：配制液体
培养基30瓶，100mL／瓶，严格控制接种量。从第0
天起，每2天取样一次，每次取3瓶。烟草细胞用自来
水冲洗3次，55℃条件烘干至恒定质量后称取干质
量。以培养时间为横座标，细胞干质量为纵座标绘制
生长曲线。
2．3生物转化方法[5]：烟草细胞在上述培养条件下
预培养10d，精确称取底物(I)，乙醇溶解使质量浓
度为20mg／mL，底物溶液无菌注入3瓶培养物中，
0．5mE／瓶，迅速摇匀，同样条件下继续培养4d。另
取3瓶培养物，每瓶加入相同体积的乙醇(不含底
物)作为空白对照。
2．4转化产物的检测[6]：底物加入培养物中，共培
养一段时间后，抽滤，分别获得烟草培养物和培养
基。培养物用蒸馏水冲洗3次，于55℃条件下烘干至
恒定质量，粉碎成粉末状，称取10mg粉末置量瓶
中，甲醇定容至5mL，超声提取1h后，甲醇补足至
刻度；培养基定容至100mL后，取10mL，一20℃保
存。将提取液、培养基经0．45弘m微孔滤膜滤过后用
于HPLC检测。
万方数据
中草蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月·915·
同法平行处理对照组培养基和培养物，进行
HPLC检测。
HPLC检测条件：流动相为45％甲醇水溶液；体
积流量：1．0mL／min；柱温：25℃；检测波长：280
am；进样量：10弘L。
2．5转化产物的分离纯化：将128mg底物(I)加
入预培养10d的烟草细胞培养瓶中，共培养4d。抽
滤，分别获得烟草细胞培养物和培养基。培养物用蒸
馏水冲洗3次，55℃条件下烘干至恒质量。培养物用
甲醇提取。合并提取液和培养液，55C减压蒸干，得
浸膏。上大孔树脂柱初步分离。再经甲醇溶解，行硅
胶柱色谱分离，氯仿一甲醇梯度洗脱；合并，减压蒸
干。甲醇溶解残渣，上SephadexLH一20柱，甲醇洗
脱，经重结晶，得转化产物Ⅱ(5mg)和Ⅲ(4rag)。
2．6共培养时间对生物转化的影响(≠一C曲线)[7]：
精确控制接种量，向18瓶预培养了10d的烟草细胞
培养瓶中分别加入20mg／mL底物乙醇溶液0．5
mL，培养条件同上。分别在共培养1、2、3、4、5、6d后
取出3瓶终止转化。抽滤获得培养物和培养基，处理
方法同2．4。
3 结果
3．1 烟草液体培养细胞生长曲线的绘制：烟草细胞
悬浮培养的生长曲线见图1。在本试验条件下，细胞
培养O～6d处于延迟生长期，6～12d处于对数生
长期，12～18d处于平台生长期。形态观察发现，在
继代后第10d左右时烟草细胞生长最旺盛，细胞分
散性好。综合考虑，烟草细胞最佳的继代周期在12～
14d，适宜的底物加入时间为8～10d。
t／d
图1 烟草悬浮细胞培养的生长曲线
Fig．1Growthcurveincellsuspensioncultures
ofN．tabacum
3．2转化产物的HPLC检测：比较对照组和实验组
的HPLC谱图(图2)可看出，在实验组中存在2个新
色谱峰(保留时间为8．6min和10．9min)，结合TLC
结果可以初步判定该生物转化是成功的。
3．3 产物的结构鉴定：化合物I：C，。H。。O。，无色针
晶，mp184～186℃，1H—NMR(CD30D，400MHz)
0 5 10 15 20
t／min
A一对照组烟草细胞甲醇提取液&实验组烟草细胞甲醇提取液
A—MeOHextractof ontrolcu tures
B-MeOHextractofexperimentalcul ures
图2底物l在烟草细胞中生物转化的HPLC图谱
Fig．2HPLCChromatogramofbiotransformation
ofSUbstratel incellsofN．tabacum
艿：6．67(dd，J=10．0，2．0Hz H一1)，6．00(dd，J=
10．O，3．2Hz，H一2)，2．50(q，J=6．8Hz，H一4)，2．34
(d，，一13．5Hz，H一6a)，2．82(d，J一13．5Hz，H一
6b)，4．93(m，H～8)，1．47(dd，，=12．3，1．4Hz，H一
9a)，2．58(dd，J=13．6，6．8Hz，H一9b)，2．91(m，H一
10)，1．79(t，J一1．71Hz，H一13)，0．62(S，H一14)，
1．12(d，J一6．8Hz，H一15)。13C—NMR艿：151．9(C一
1)，130．2(C一2)，202．5(C一3)，44．2(C一4)，45．0(C一
5)，35．2(C一6)，161．9(C一7)，81．5(C一8)，37．9(C一
9)，55．0(C一10)，123．6(C一11)，176．6(C一12)，8．0
(C一13)，11．5(C一14)，7．6(C一15)。参考文献数据‘引，
将化合物Ⅱ鉴定为3-oxo—eremophila一1，7(11)-dien-
12，8一olide。
化合物I：C，5H。80。，无色针晶，mp204～206
℃，1H—NMR(CD30D，400MHz)8：6．83(dd，J=
10．0，2．0Hz，H一1)，6．15(dd，J=10．0，3．3Hz，H一
2)，2．78(q，J=6．8Hz，H一4)，2．52(br．d，L厂一13．2
Hz，H一6a)，2．86(d，J=13．1Hz，H一6b)，1．89(t，J=
13．4Hz，H一9a)，2．54(dd，J=13．2，3．4Hz，H一9b)，
3．24(br．dd，J=11．5，1．0Hz，H一10)，1．95(d，J=
1．56Hz，H一13)，0．78(s，H一14)，1．27(d，J=6．86
Hz，H一15)。”C—NMR艿：152．1(C一1)，130．0(C一2)，
202．6(C一3)，44．6(C一4)，45．6(C一5)，36．8(C一6)，
169．2(C一7)，104．7(C一8)，39．7(C一9)，55．1(C一10)，
125．4(C一11)，173．9(C一12)，8．0(C一13)，10．9(C一
14)，7．5(C一15)。参考文献数据‘引，将化合物Ⅲ鉴定
为3-OXO一8一hydroxy—eremophila一1，7(11)一dien-12，
8一olide。
3．4 转化产物I的时效(￡一C)曲线；从图4中可看
出，在培养物中，产物随着共培养时间的延长而增
加 在5d时达到最大量(46．3mg／L)后开始下降；
万方数据
·916· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月
I Ⅱ m
图2转化产物I和Ⅲ在烟草细胞中的生物合成途径
Fig．3BiosynthesispathwayofcompoundsI andIiincellsofN．tabacum
而在培养基中产物先升高，2d达到最高(1．8rag／ 化能力。培养的植物体系对外源底物发生羟基化等
L)，然后缓慢下降。 转化反应是因为底物对其产生了伤害性刺激‘钆103，
f
0
●
暑
￥
昌
挥
钆
导
彝
糠
蜜
f
0
●
吕
￥
高
霉
钆
导
醐
撩
密
t／d
圈4共培养时间对转化产物I在烟草细胞中产量的影响
Fig．4Effectofco·cultureimonyieldofcompoundi
incellsofN．tabacum
转化产物Ⅲ的￡一C曲线：从图5中可以看出，培
养物中，产物随着共培养时间的延长逐渐增加，3d
时升至最高(62．5mg／L)，而后逐渐下降；而在培养
基中产物量逐渐上升，5d时量最多(1．3mg／L)，而
后开始下降。
P
0
●
∞
吕
￥
兰
霹
{L
}
霉
猕
蜜
，
0
●
昌
￥
吕
霹
钆
导
蝴
撒
密
t／d
图5共培养时间对转化产物ll在烟草细胞中产量的影响
Fig．5Effectofco-culturetimonyieldofcompoundⅢ
incellsofN．tabacum
4讨论
本研究首次利用烟草悬浮培养细胞对倍半萜类
化合物呋喃橐吾酮进行生物转化研究并获得成功。
结果表明，该生物转化系统对底物具有氧化和羟基
进而激活了植物细胞内的相关酶系统，从而产生生
物催化作用，这被认为是一种减毒过程。目前，人们
普遍认为选择细胞对数生长期的中、早期加入外源
底物有利于转化反应的发生，且对细胞的损伤比较
小。实验中预培养10d后加入底物，因为此时细胞
正值对数生长期，系统的酶活力强，转化效率高。
实验还表明，转化产物Ⅱ和Ⅲ在培养物和培养
基中均有分布，且以培养物中为主。从产物的时效曲
线可以看出若以获得不同的产物为目的，共培养时
间也应不同(产物I为5d，产物Ⅲ为3d)。若考虑总
转化最高，应共培养5d，此时总转化率为53．1％。
参考文献：
rl-I于荣敏．天然药物活性成分的生物合成与生物转化口]．中
草药，2006，37(9)：1281—1288．
[2]IshiharaK，HamadaH，HirataT，eta1．Biotransformation
usingplantculturedcells口]．JMolCatsB；Enzym，2003，
23：145—170．
[3]SugaT，AokiT，HirataT，eta1．Transformationof
terpineolswithtobaccosuspensioncellsl-J]．ChemLett，
1980(3)：229—230．
[4]TorresP，AyalaJ，GrandeC， ta1．Furanoeremophilane
derivativesfromSeneciojTavus口]．Phywchemisty，1999，
52：1507—1513．
[5]严春艳，张章，于荣敏，等．何首乌毛状根生物转化对苯
二酚生产熊果苷的研究[J]．中国中药杂志，2007，32(3)：
192—195．
[6]YancY，YuRM．Zhangz-eta1．Biotransformationof4一
hydroxybenzenderivativesby hairyrootculturesof
PolygonummultiflorumThunb．口]．JIntegrPlantBiol，
2007，49(Z)：207—212．
[7]张章，陈敏青．任盛芳，等．转基因西洋参冠瘿组织生物
合成熊果苷的研究[J]．中草药，2006，37(5)：759—761．
[8]张朝凤。张勉，屈蓉，等．侧茎橐吾的倍半萜类成分研
究[J]．中国天然药物，2004，2(6)：341—343．
[9]于荣敏，赵昱．现代生物技术方法在中药现代化中的应用
[M]．北京：中国医药科技出版社，2005．
[10]GiriA，DhingraV，GiriCC，eta1．Biotransformationsusing
plantcells，organculturesandenzymesystems：Current
trendsandfutureprospects[J]．BiotechnolAdvt 2001，19l
175一】99．
万方数据
烟草悬浮培养细胞对呋喃橐吾酮的生物转化研究
作者： 严春艳， 于荣敏， 吕华冲， 张德志， YAN Chun-yan， YU Rong-min， L(U) Hua-chong
， ZHANG De-zhi
作者单位： 严春艳,YAN Chun-yan(广东药学院药科学院,广东,广州,510006;暨南大学药学院,广东,广州
,510632)， 于荣敏,YU Rong-min(暨南大学药学院,广东,广州,510632)， 吕华冲,张德志
,L(U) Hua-chong,ZHANG De-zhi(广东药学院药科学院,广东,广州,510006)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(6)
被引用次数： 1次

参考文献(10条)
1.于荣敏 天然药物活性成分的生物合成与生物转化[期刊论文]-中草药 2006(09)
2.Ishihara K;Hamada H;Hirata T Biotransformation using plant cultured cells 2003
3.Suga T;Aoki T;Hirata T Transformation of terpineols with tobacco suspension cells[外文期刊]
1980(03)
4.Torres P;Ayala J;Grande C Furanoeremophilane derivatives from Senecio flavus[外文期刊] 1999(8)
5.严春艳;张章;于荣敏 何首乌毛状根生物转化对苯二酚生产熊果苷的研究[期刊论文]-中国中药杂志 2007(03)
6.Yan C Y;Yu R M;Zhang Z Biotransformation of 4-hydroxybenzen derivatives by hairy root cultures of
polygonum multiflorum Thunb[外文期刊] 2007(02)
7.张章;陈敏青;任盛芳 转基因西洋参冠瘘组织生物合成熊果苷的研究[期刊论文]-中草药 2006(05)
8.张朝凤;张勉;屈蓉 侧茎橐吾的倍半萜类成分研究[期刊论文]-中国天然药物 2004(06)
9.于荣敏;赵昱 现代生物技术方法在中药现代化中的应用 2005
10.Giri A;Dhingra V;Giri C C Biotransformations using plant cells,organ cultures and enzyme
systems:Current trends and future prospects[外文期刊] 2001

本文读者也读过(6条)
1. 于荣敏.高越.吕华冲.张辉.姚新生 银杏细胞固定化培养及其影响因素考察[期刊论文]-中草药2004,35(7)
2. 严春艳.马伟丽.梁建.吕华冲.张德志.于荣敏.YAN Chun-yan.MA Wei-li.LIANG Jian.LU Hua-chong.ZHANG De-
zhi.YU Rong-min 转基因何首乌毛状根对8种活性成分的生物转化研究[期刊论文]-中国生物工程杂志2008,28(4)
3. 严春艳.马伟丽.颜雯雯.于荣敏.YAN Chun-yan.MA Wei-li.YAN Wen-wen.YU Rong-min 何首乌毛状根对倍半萜类
化合物Furannoligularenone的生物转化研究[期刊论文]-中药材2008,31(5)
4. 庞小雄.吕华冲.张怡红.王建壮 中成药及中药保健品中添加西地那非的快速检测方法[期刊论文]-中国医院药学
杂志2008,28(8)
5. 廖华卫.吕华冲.李晓蒙 超临界流体萃取烟草中天然烟碱[期刊论文]-广东药学院学报2002,18(2)
6. 孙明杰.吕华冲.邓桂兴.王霆.SUN Ming-jie.L(U) Hua-chong.DENG Gui-xing.WANG Ting 注射用头孢噻肟钠/舒
巴坦钠(2:1)[期刊论文]-中国新药杂志2008,17(7)

引证文献(1条)
1.张勇.曾鹏.贾琦.郭夫江.李医明.朱维良.陈凯先 大吴风草化学成分与药理活性研究进展[期刊论文]-中草药
2012(5)


本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200806038.aspx