全 文 ：益气养阴消癥通络中药对糖尿病肾病大鼠 TGF-B/ Smads
信号传导系统的影响
王月华, 陈志强* ,郭登洲,孙玉凤,张江华
(河北医科大学, 河北 石家庄 050017)
摘 要:目的 观察益气养阴消癥通络中药对糖尿病肾病 ( DN ) 大鼠 TGF-B/ Smads 信号传导系统的影响。方法
选择 46 只健康雄性 SD 大鼠,随机分为对照组 10 只, 造模组 36 只。除对照组外,造模组大鼠 1次性 ip 链脲佐菌
素 ( STZ) 60 mg/ kg, 造模组在糖尿病模型成模后,随机分为模型组、贝那普利组、中药组。成模 1 周后开始给药,
贝那普利组以 10 mg/ ( kg# d) ig 给药, 中药组以 26 g/ ( kg # d) ig 给药, 各组连续给药 23 周后处死动物。HE、
PAS 染色观察组织病变程度,免疫组化检测 TGF-B1、p-Smad2/ 3 的改变 , Western-blo tting 检测 Smad7 蛋白表达水
平。结果 与模型组相比,益气养阴消癥通络中药能够显著减轻 DN 大鼠肾组织病理损害, 免疫组化以及Western
blotting 显示,益气养阴消 9 通络中药能够显著下调 TGF-B1、p-Smad2/ 3 蛋白的表达,上调 Smad7 蛋白的表达。结
论 益气养阴消癥通络中药能够减轻 DN 的病理损害, 这一作用的实现可能是部分通过 TGF-B/ Smads 信号传导
途径实现的,即降低受体激活型 Smad 表达,上调抑制型 Smad7 表达。
关键词: 益气养阴消癥通络中药; TGF-B1 ; Smads 家族蛋白; 糖尿病肾病
中图分类号: R2861 1 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 04-0606-03
随着全球经济发展及人民生活水平提高, 慢性
肾脏病 ( chronic kidney diseases, CKD) 的疾病谱
也在不断发生变化。在发达国家,糖尿病肾病 ( dia-
betic nephropathy, DN) 是慢性肾功能衰竭的首位
原因,所占比例有逐年增长的趋势。我国 DN 病例
近年也在迅速增加, 糖尿病是 CKD 独立危险因素
已被公认 [ 1]。因此寻找防止或延缓 DN 发生发展的
有效途径和方法已成为世界范围的重大课题。近十
几年来我国中医药界也广泛地开展了中医药防治
DN 的研究, 且逐渐显示出较大的潜力和广阔的应
用前景。临床上采用益气养阴消癥通络中药治疗
DN,取得了较好的疗效 [ 2]。为给该药的临床应用提
供理论依据,本实验通过观察用药后 DN 大鼠肾组
织 TGF-B/ Smads 信号传导系统的变化, 探讨其对
DN 可能的作用机制。
1 材料
11 1 实验动物:选用健康雄性 SD 大鼠 46只,清洁
级,体质量为 ( 200 ? 10) g, 由河北医科大学动物中
心提供,合格证号 703058。
11 2 实验药物:益气养阴消癥通络中药,由黄芪、玄
参、地龙、鳖甲、丹参、大黄、乌梢蛇等组成, 经粉碎、
水煎浓缩至含生药 3 g/ mL, 河北医科大学中医院
制剂室提供。贝那普利片 (批号为 X0186,由北京
诺华制药有限公司生产)。
11 3 仪器和试剂:多聚赖氨酸 (美国 Sigma 公司) ,
山羊抗 p-Smad2/ 3 多克隆抗体 (美国 Santa Cruz
公司, p-Smad2、p-Smad3两种蛋白具有很高的同源
性,相对分子质量相近, p-Smad2/ 3这种抗体能同时
检测两种蛋白的存在, 有交叉反应) ,兔抗 Smad7 多
克隆抗体 (美国 Santa Cruz公司) , 兔抗 TGF-B1多
克隆抗体 (美国 Santa Cruz 公司) , SP 免疫组化染
色试剂盒、DAB 显色试剂盒 (北京中山生物技术有
限公司)。
2 方法
21 1 动物的分组及造模:选用清洁级健康雄性 SD
大鼠 46 只,普通饲料适应性喂养 1周, 代谢笼取尿
检测尿糖和尿蛋白均为阴性,按体质量随机分为对
照组 10只, 造模组 36 只。造模组大鼠 1次性 ip链
脲佐菌素 ( ST Z) 60 mg/ kg , 对照组注射等量生理
盐水, 72 h 后测血糖,以血糖值\16. 7 mmol/ L 为
糖尿病模型成功标准[ 3] 。造模组在糖尿病模型成模
后 1周,随机分为模型组、贝那普利组、中药组各 12
只。贝那普利组以 10 mg/ ( kg # d) ig 给药,中药组
以 26 g/ ( kg # d) ig 给药, 每周称体质量、测血糖各
#606# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
* 收稿日期: 2008- 09-15 基金项目:河北省自然科学基金资助项目 ( 2008001074) ; 河北省卫生厅资助项目 ( 08165)作者简介:王月华( 1973 ) ) ,女,河北省唐山市人,副主任医师,博士研究生,主要从事中西医结合肾脏疾病的临床与药物研究。
T el : ( 0311) 85990176 E-mail: w angyu ehua@ medmail. com. cn
* 通讯作者 陈志强 T el: ( 0311) 85990281 E-mail: Chen zhqiang@ tom . com
1次,每日同体积不同质量浓度 ig 给予相应药物,对
照组及模型组 ig 等量蒸馏水,各组连续给药 23周。
21 2 标本收集: 于注射 STZ 24 周末剖杀大鼠, 取
右侧肾脏,去掉被膜, 滤纸吸干血迹后取肾皮质 1
mm3 , 经 3% 戊二醛和 1% 锇酸磷酸钠缓冲液双固
定,做电镜观察,部分肾皮质保存于 - 80 e 冰箱中
用于 Western blo tt ing 检测, 部分用 4% 多聚甲醛
固定,做常规病理学观察及免疫组织化学观察。
21 3 病理形态学观察: 肾组织在 4% 多聚甲醛中
固定 24 h,用 75%、85%、95%、100% 乙醇梯度脱
水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋。常规病理切片, 分
别行 HE、PAS 染色, 光镜下观察肾脏皮质的基本
病理改变及肾小球基底膜、系膜基质、肾小管及间质
的改变情况。电镜组织取肾上极 1 mm3 , 迅速投入
4 e 预冷的 4% 戊二醛固定 1 h, 4 e 1% 锇酸后
固定 2 h,乙醇梯度脱水, 100% 丙酮脱水,丙酮与树
脂混合液浸透 15 min, 纯树脂浸透 30 min, 环氧树
脂包埋, Leica 超薄切片机切片, 醋酸铀、柠檬酸铅
双重电子染色, 日立 H ) 7500 型透射电子显微镜观
察、拍照。
21 4 免疫组化检测肾 T GF-B1、p- Smad2/ 3的表达:
用常规 SP 法。切片常规脱蜡和水化, 分别加入一
抗、二抗, 以 PBS 代替一抗为阴性对照, DAB 显色。
应用真彩医学图像系统通过光学纤维镜摄入图像,
放大 200倍, T GF-B1结果分析是对图像进行灰度交
换后,计算微机屏幕视窗内肾皮质阳性着色面积占
一个视野场面积的百分比。P-Smad2/ 3 的结果分
析是计算一个视野场中强阳性着色核占小管细胞核
总数的百分比。
21 5 Western blot t ing 印迹分析 Smad7 蛋白: 取
- 70 e 保存的肾皮质 50 mg,经冰冷的 01 01 mol/
L PBS 充分洗涤后置入玻璃匀浆器中,加入预冷的
蛋白裂解液 01 5 mL, 研磨成匀浆, 冰浴静置 30
min。4 e 、12 000 r/ min 离心 30 min, 取上清液。
采用 Bradford 法测定蛋白,每泳道上 80 Lg。蛋白
质经 10% SDS-PAGE 垂直凝胶电泳后,电转移至
PVDF 膜上, 5% 脱脂奶粉 37 e 封闭 2 h。一抗
4 e 过夜,二抗 37 e 2 h。每步后均 TT BS 漂洗,
10 min @ 3 次, 最后 DAB 显色。杂交信号在 Im-
agetoo l图像分析系统中进行。
21 6 统计学分析: 数据以 x ? s 表示, 应用 SPSS
131 0 统计软件进行组间方差分析。
3 结果
31 1 实验大鼠的一般状况:对照组大鼠饮食正常,
眼睛有神,反应敏捷,被毛紧披, 肌肉丰满,粪便呈麦
粒状, 尿量正常。其余 3组注射 ST Z 后, 均出现明
显的多饮、多食、多尿症状, 并慢慢出现精神萎靡、反
应迟钝、少动抱团。实验最后 1周, 与对照组相比,
造模各组大鼠明显体型瘦小、骨骼突出、肌肉偏少,
上述症状以模型组最为显著。治疗期间造模各组均
有大鼠死亡情况, 其中模型组死亡 3只,贝那普利组
死亡 1只,中药组死亡 2只,死亡原因估计为高血糖
引起代谢紊乱最终导致脏器衰竭。
31 2 病理形态学观察结果:光镜下对照组肾小球结
构完整,未见肾小球肥大, 肾小球毛细血管基底膜、
系膜、基质未见明显异常改变;模型组可见肾小球肥
大,肾小球毛细血管基底膜增厚,肾小球系膜细胞增
生、系膜基质增多,系膜区增宽; 部分肾小管发生空
泡变性,肾小管萎缩,透明管型形成; 各治疗组较模
型组有不同程度改善。电镜下对照组肾脏组织结构
正常,肾小球基底膜均匀无增厚, 上皮足突分布均
匀;模型组大鼠肾小球毛细血管基底膜高度增厚,大
部分呈匀质样增厚,部分增生呈丘状隆起;足细胞足
突广泛融合;内皮细胞高度融合, 窗口大部分消失。
其他各组大鼠肾小球毛细血管基底膜较正常呈匀质
样增厚,足细胞局部融合, 内皮细胞部分融合,窗口
部分消失。
31 3 免疫组织化学染色
31 31 1 T GF-B1蛋白的表达: 见表 1。T GF-B1在肾
小球上皮细胞及系膜区、毛细血管袢、肾小囊壁层上
皮细胞、肾小管上皮细胞胞浆以及小管间质均有表
达,半定量分析结果显示: 与对照组相比, 模型组和
两个治疗组的表达要明显加强 ( P< 01 05) ,与模型
组比较, 贝那普利组和中药组的表达要明显降低
( P< 01 05) ,贝那普利组和中药组之间的比较则无
明显差异 ( P> 01 05)。
31 31 2 p-Smad2/ 3蛋白的表达:见表 1。对照组 p-
Smad2/ 3 呈广泛且弱阳性表达,见于肾小管的上皮
细胞核和间质内浸润的单核细胞核。半定量分析结
果显示,与对照组相比,模型组和各治疗组阳性增强
的核占小管细胞的百分比显著增加 ( P< 01 05) , 与
模型组比较,贝那普利组和中药组的表达明显降低
( P< 01 05) ,贝那普利组和中药组之间的比较则无
明显差异 ( P> 01 05)。
31 41 Smad7 Western 蛋白印迹: 见表 1。与对照
组相比,模型组和各治疗组的表达要明显降低 ( P<
01 05) , 与模型组比较, 贝那普利组和中药组的表达
要明显上升 ( P< 01 05) , 贝那普利组和中药组之间
#607#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
的比较则无明显差异 ( P> 01 05)。
表 1 各组大鼠肾脏 TGF-B1、p-Smad2/ 3 和 Smad7 蛋白
表达的影响 ( x? s)
Table 1 Protein expression of TGF-B1, p-Smad2/ 3,
and Smad7 in rat kidney of different
groups ( x ? s)
组别 动物/只 TGF-B1 /% p- Smad2/ 3/ % Smad7
对照 10 19 ? 5 41 41? 01 56 11 00? 01 05
模型 9 70 ? 9 v 291 34? 21 86v 01 29? 01 05v
中药 10 38 ? 11 v* 131 61? 21 15v* 01 70? 01 08v *
贝那普利 11 41 ? 8 v* 141 23? 21 03v* 01 67? 01 06v *
与对照组比较: v P< 0105; 与模型组比较: * P < 01 05
v P< 01 05 v s con tr ol group; * P < 01 05 v s model group
3 讨论
在前期临床实践中, 根据中医学病机理论,结合
DN 的临床特征、发病机制及其病理特点,逐步认识
到该病的病情虽然复杂, 但在早期和中期大多以气
阴两虚、瘀血阻络、癥瘕积聚为其基本病机, 治疗当
以益气养阴、化瘀软坚、消癥通络为主, 为此结合多
年的临床用药经验, 拟定了以益气养阴、消癥通络为
主的中药复方制剂, 方中主要由黄芪、玄参、地龙、鳖
甲、丹参、大黄等组成。方中地龙、鳖甲通络活血软
坚散结为君,丹参、大黄活血凉血为臣, 使活血而血
不妄行,方中又用黄芪来益气,玄参养阴, 黄芪益气
有走而不守之性,既可益气又可鼓气,不仅可以扶正
固本,又可以助丹参、地龙、乌梢蛇等药行血消瘀祛
邪治标。诸药相伍通补并用、标本兼顾,络脉瘀阻可
消、正气亏虚可益。用该方在临床上治疗早中期的
DN,取得了良好的临床疗效 [ 2]。
肾纤维化是各种原因所致肾脏疾病进展至终末
期肾功能衰竭的共同病理特征。作为一种强效的致
纤维化因子, T GF-B1表达升高与多种原因引起的肾
纤维化密切相关,被认为是肾纤维化最重要的作用
因子之一[ 4] , T GF-B信号系统调控着各种慢性肾小
球损伤的一系列的病理生理过程,其中包括促进细
胞外基质聚集, 抑制其降解,诱导足细胞的凋亡以及
肾小管上皮细胞的转分化[ 5, 6] , 从而介导肾小球的
硬化,肾间质纤维化, 引起肾功能的丧失。Smad 蛋
白是目前所知 T GF-B受体的胞内激酶底物,介导了
T GF-B的胞内信号转导 [ 7]。TGF-B首先与 Ò 型受
体结合,形成复合物,随后Ñ型受体也加入到复合物
中与 TGF-B结合。随后 Ñ型受体 GS 区被 Ò 型受
体磷酸化,活化的 Ñ型受体与下游底物相互作用,将
信号传递下去。Smads 家族蛋白在将 T GF-B信号
从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起关键作
用。活化的 TBRI 磷酸化激活受体激活型 Smads
( Smad2、3) 蛋白,吸引共同介质型 Smad4形成低聚
体复合物,转移到细胞核内, 调节转录活动,从而调
节细胞的增殖、分化、移行、凋亡。这一复合物可以
引起 Smad7 蛋白启动子转录增加, 表达上调,
Smad7 可竞争性的与 TBRI 结合, 反馈性抑制
Smad2、3 磷酸化,起到调节作用。
在本研究中应用益气养阴消癥通络中药进行药
物干预治疗,观察其对 DN 的防治作用。发现益气
养阴消癥通络中药组大鼠 T GF-B1、p-Smad2/ 3蛋白
较模型组显著下降,还发现保护性 Smads 家族蛋白
Smad7 的蛋白在益气养阴消癥通络中药组中较模
型组有所上升。以上结果提示, 益气养阴消癥通络
中药能够减轻 DN 的病理损害, 这一作用的实现可
能是部分通过降低受体激活型 Smad 表达, 上调抑
制型 Smad7 实现的。
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更正:由于作者笔误,应作者要求将本刊 2008年第 39卷第 10期上第 1549页右栏正数第 16行(约
240 d 苗龄, , ,) 0更正为/ (约 120 d 苗龄, , ,) 0。特此更正。
5中草药6杂志编辑部
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