全 文 ：紫花苜蓿不同品种和不同季节黄酮量的比较研究
徐文燕1 ,高微微1 3 ,何春年1 ,佟建明2 3
(11 中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所 ,北京 　100193 ;
21 中国农业科学院北京蓄牧兽医研究所 ,北京 　100193)
摘 　要 :目的 　考察不同品种和采收季节对紫花苜蓿中黄酮量的影响。方法 　以苜蓿素为对照品 ,对紫外分光光
度法测定紫花苜蓿总黄酮的量进行方法学考察 ,对北京地区种植的 9 个紫花苜蓿品种在春、夏、秋季 3 个采收期总
黄酮的量进行测定分析。结果 　9 个紫花苜蓿品种中 ,“费纳尔”和“爱维兰”总黄酮量显著高于其他品种 ( P <
0. 05) ,其他 7 个品种间无显著差异 ( P > 0. 05) ;在 3 个采收季节中 ,各品种在秋季的黄酮量均高于春、夏两季 ,其中
“费纳尔”、“爱维兰”和“爱菲尼”总黄酮的量在 3 个季节差异不显著 ( P > 0. 05) ,“美标 304”、“胜利者”和“改革者”则
有显著差异 ( P < 0. 05) 。结论 　品种和采收季节对紫花苜蓿中的总黄酮的量均有明显影响 ,而不同品种中的总黄
酮对季节变化的敏感性不同。
关键词 :紫花苜蓿 ;黄酮 ;品种 ;采收季节 ;紫外分光光度法
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2009) 05 0815 03
　　紫花苜蓿 Medicago sati v a L1 为多年生豆科
(Leguminosa)草本植物[ 1 ] ,世界各地广泛作为牧草
使用。在我国主要分布于西北、华北、东北、西南地
区 ,栽培面积达到 2 ×106 hm2 。在我国民间用于治
疗消化不良、肺热咳嗽、黄疸、膀胱结石等症[2 ] 。现
代医学研究发现苜蓿具有降低胆固醇[3 ] 、防治冠心
病[4 ]等活性 ,紫花苜蓿主要含有黄酮、皂苷、香豆素、
甾醇、单萜和有机酸等化学成分 ,其中黄酮类化合物
是主要功效成分类群[5 ] 。开发苜蓿的药用功能对于
苜蓿产品的深层次开发以提高苜蓿的利用价值具有
重要意义。
大量研究表明 ,环境因子包括光照、温度、CO2
浓度、矿质营养和土壤水分等因素对植物中黄酮类
物质的合成具有显著影响[6 ] 。以往对紫花苜蓿中黄
酮的研究主要集中在化合物鉴定[5 ] 、抗植物病原
菌[7 ]及其代谢调控等方面[8 ] ,关于苜蓿黄酮的定量
检测方法报道很少 ,品种及环境因子对其生物合成
的影响尚不清楚。本实验选择目前广泛栽培的 9 个
优良紫花苜蓿品种为研究对象 ,以本实验室纯化的
苜蓿素为对照品 ,旨在建立紫花苜蓿中总黄酮的测
定方法 ,并通过量的对比 ,探讨品种、采收期对紫花
苜蓿黄酮生物合成的影响 ,为紫花苜蓿采收期的确
定以及苜蓿资源的开发利用奠定方法学基础。
1 　仪器与试药
PEG2Unican PU8000 —752C 紫外可见光分光
光度计 (上海经三分析仪器厂) ; KQ —250ODB 型超
声清洗器 (昆山超声仪器有限公司) ; HAN G PIN G
FA 1104 天平 (上海经三分析仪器厂) 。对照品苜蓿
素为本实验室自制 ,质量分数达到 98 %以上 ,实验
所用试剂均为国产分析纯试剂。
9 个紫花苜蓿品种“爱菲尼”、“爱维兰”、“改革
者”、“阿波罗”、“美标 304”、“胜利者”、“巨人”、“全
能”和“费纳尔”由中国农业科学院北京畜牧兽医研
究所杨青川研究员提供 ,种植于北京畜牧兽医研究
所苜蓿试验地 ,按随机区组设计 ,小区面积 8. 3 m2 ,
重复 3 次 ,田间管理一致。采收期分别为 2006 年 6
月 15 日、8 月 15 日和 10 月 15 日 ,样品生育期为初
花期。每个品种在 3 个试验小区内分别随机取 1 个
点 ,每点约 20～30 株 ,取植株地上部分 ,同一品种的
3 份样品混合 ,室温干燥。
2 　方法与结果
211 　对照品溶液制备 :苜蓿素对照品减压干燥至恒
重 ,精密称定 10. 02 mg ,加甲醇溶解定溶至 25 mL ,
得到质量浓度为 400. 8μg/ mL 的对照品溶液。
212 　供试品溶液制备 :干燥后的紫花苜蓿茎叶 ,粉
碎 ,过 40 目筛 ,取 1 g 左右 ,精密称定 ,置于 50 mL
容量瓶中 ,加 70 %乙醇 ,超声提取 60 min ,补加 70 %
乙醇至刻度 ,摇匀 ,滤过 ,为供试品溶液。
213 　测定波长的选择 :分别取供试品溶液和对照品
溶液各 2 mL ,在紫外分光光度计上于 200～500 nm
·518·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
3 收稿日期 :2008208209　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家科技部“十一五”科技支撑项目 (2006BAD12B05)
作者简介 :徐文燕 (1980 —) ,女 ,河南省安阳市人 ,硕士研究生 ,主要从事植物化学与分析研究。
Tel : (010) 62812809 　E2mail :xuwenyan1980 @126. com3 通讯作者　高微微　E2mail :wwgao @implad. ac. cn 　佟建明　E2mail :tjm606 @263. net
扫描 ,结果对照品溶液与供试品溶液在 207 和 354
nm 处有最大吸收 ,为了避免低波长处杂质的干扰 ,
选择 354 nm 为检测波长进行样品测定。
214 　标准曲线的制备 :对照品溶液按 3. 206、4. 896、
5. 010、9. 619、10. 02、12. 83μg/ mL 配出系列质量浓
度对照品溶液 ,在 354 nm 波长处测定吸光度 ,扣除溶
剂空白 ,以吸光度 ( A)对质量浓度 ( C)进行线性回归 ,
得到标准曲线方程 : A = 0. 061 9 C + 0. 014 6 , R2 =
0. 999 6 ,线性范围 :3. 206～12. 83μg/ mL。
215 　精密度试验 :精密称取测试样品溶液 ,重复测
定 6 次 ,吸光度的 RSD 为 0. 11 %。
216 　稳定性试验 :精密吸取供试品溶液 ,于室温分
别放置 0、1、2、4、6、12、36、48 h 测定 ,吸光度的 RSD
为 3. 106 3 %。
217 　重现性试验 : 精密称取同批样品 5 份 , 按
11312 方法制备供试品溶液 ,测定吸光度 ,计算 ,总
黄酮的 RSD 为 0. 549 %。
218 　回收率试验 :取已测定的紫花苜蓿样品 5 份 ,
每份约 0. 073 g ,精密称定 ,分别精密加入苜蓿素对
照品 0. 030 8 g ,按 11 312 方法制备供试品溶液并测
定 ,加样回收率平均值为 98. 36 % ,RSD 为 2. 37 %。
219 　样品测定 :紫花苜蓿样品按 11312 方法制备供
试品溶液并测定 ,每份样品重复 3 次。数据处理用
SPSS 10. 0 软件进行单因子方差分析 ,L SD 测验进
行多重比较。
21911 　不同品种紫花苜蓿黄酮量的比较 :选择 6 月
份采收的 9 个紫花苜蓿品种 ,分别测定其茎叶比 (茎
质量/ 叶质量) 、叶片、茎及地上部植株样品中总黄酮
的量 ,结果见表 1。茎部总黄酮的量以“胜利者”最
高为 2. 537 mg/ g ,“爱菲尼”最低为 1. 753 mg/ g ;叶
片中总黄酮的量以“阿波罗”最高为 8. 83 mg/ g ,“改
革者”最低 6. 43 mg/ g ,各品种叶中黄酮的量差异显
著 ( P < 0. 05) ;植株中总黄酮的量以“费纳尔”最高
为 5. 58 mg/ g ,“改革者”最低为 4. 57 mg/ g ,其他品
种中“爱维兰”量较高为 5. 14 mg/ g。
通过比较可以看出 ,叶片中黄酮的量远远高于
茎 ,同一品种叶片中的黄酮量与茎中黄酮量没有明
显相关性 ,因此叶片比例高的品种黄酮的量相对较
高。不同品种之间植株黄酮的量存在差异 ,通过茎
叶比例得出的黄酮量推算值与茎叶混合样品的测量
结果相比差异不明显 ,说明样品的制备方法可以达
到充分均匀的程度。
21912 　不同采收季节总黄酮量比较 :栽培的紫花苜
蓿在北京地区一年收获 3～4 茬 ,分别在春、夏、秋 3
表 1 　不同品种紫花苜蓿黄酮量的比较 ( n = 4)
Table 1 　Comparison of flavonoids′content in different
M1 sativa cultivars ( n = 4)
品种 总黄酮/
(mg ·g - 1 )
茎 叶 植株推算值 3 植株样品 3 3
爱菲尼 1. 753 ±0. 001 a 3 3 37. 175 ±0. 001 c 4. 632 ±0. 001 4. 656 ±0. 012 a
巨人 2. 052 ±0. 004 c 7. 725 ±0. 006 e 4. 650 ±0. 004 4. 662 ±0. 044 a
胜利者 2. 537 ±0. 007 e 7. 399 ±0. 006 d 4. 603 ±0. 006 4. 650 ±0. 287 a
美标 304 1. 909 ±0. 006 b 6. 760 ±0. 011 b 4. 800 ±0. 008 4. 835 ±0. 105 ab
改革者 1. 911 ±0. 008 b 6. 427 ±0. 003 a 4. 522 ±0. 005 4. 570 ±0. 077 a
阿波罗 2. 167 ±0. 010 c 8. 830 ±0. 015 i 4. 664 ±0. 011 4. 680 ±0. 096 a
全能 2. 172 ±0. 004 c 8. 346 ±0. 001 g 4. 781 ±0. 003 4. 793 ±0. 305 a
爱维兰 2. 293 ±0. 009 d 8. 122 ±0. 001 f 5. 123 ±0. 005 5. 144 ±0. 410 b
费纳尔 1. 917 ±0. 004 b 8. 809 ±0. 002 h 5. 436 ±0. 003 5. 581 ±0. 017 b
　　3 茎叶推算值 = 茎的黄酮量×茎在植株地上部分所占比例 + 叶
的黄酮量×叶在植株地上部分所占比例3 3 植株样品 :为植株地上部分茎叶测定值3 3 3 L SD 测验 ( P = 0. 05) ,同一列标记字母相同差异不显著
( P > 0. 05)3 calculated values of content = flavonoids′content of stem ×
ratio of stem to aerial part of plant + flavonoids′content of leaves ×
ratio of leaves to aerial part to plant3 3 measurement values of aerial part of plant3 3 3 values in same column followed by same letter are not
statistically different at P = 0. 05 by L SD test
个季节 ,本实验对春、夏、秋季 3 次采收的 9 个紫花
苜蓿品种中总黄酮量的测定分析结果见表 2。结果
表明所有品种 10 月采收的样品中总黄酮量普遍高
于 6 月和 8 月采收的样品。各季节采收的苜蓿品种
中总黄酮的量均以“费纳尔”和“爱维兰”较高 ,“改革
者”较低。各品种中“爱菲尼”、“爱维兰”和“费纳尔”
3 个采收期总黄酮的量差异未达到显著水平 ( P <
0. 05) ,说明这 3 个品种的总黄酮的量受季节影响相
对较小 ;而“美标 304”、“胜利者”和“改革者”中总黄
酮的量在 3 个季节中均表现出显著差异 ( P <
0. 05) ,黄酮对季节变化较为敏感。
3 　讨论
紫花苜蓿中已报道的黄酮类 (flavonoid) 成分共
40 个 ,是紫花苜蓿的主要化合物类型[5 ] ,苜蓿素
(t ricin)是其中的活性成分之一[9 ] 。紫外分光光度
方法利用黄酮类化合物有明显紫外吸收的特性 ,普
遍用于测定植物中总黄酮的量。选择合适的对照品
和测定波长是该方法需要考察的主要因素 ,由于不
同植物所含黄酮类型不同 ,在对照品和测定波长的
选择上有明显差异。丛媛媛等[10 ] 以芦丁为对照品 ,
测定了新疆地区紫花苜蓿中总黄酮的量为0. 258 % ,
与本实验测定的结果 4. 6 %～5. 6 %有较大差距 ,一
方面可能是苜蓿品种与栽培地区不同 ,另一方面对
照品不同也是重要的原因。Gammal [11 ]曾报道褐斑
·618· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
表 2 　不同采收期紫花苜蓿总黄酮量的变化 ( n = 4)
Table 2 　Variations in content of flavonoids in M1sativa
at different harvest seasons ( n = 4)
　品　种 总黄酮/
(mg ·g - 1)
6 月 8 月 10 月
爱菲尼 4. 656 ±0. 012 a 4. 818 ±0. 513 a 4. 947 ±0. 016 a
胜利者 4. 650 ±0. 287 a 4. 229 ±0. 011 b 5. 050 ±0. 016 c
巨人 4. 662 ±0. 044 a 4. 783 ±0. 158 a 5. 582 ±0. 020 b
美标 304 4. 835 ±0. 105 a 4. 247 ±0. 053 b 5. 017 ±0. 015 c
改革者 4. 570 ±0. 077 a 3. 811 ±0. 136 b 4. 962 ±0. 012 c
阿波罗 4. 680 ±0. 096 a 4. 721 ±0. 009 a 5. 405 ±0. 102 b
全能 4. 793 ±0. 305 a 4. 959 ±0. 078 a 5. 202 ±0. 063 b
爱维兰 5. 144 ±0. 410 a 4. 992 ±0. 045 a 5. 618 ±0. 024 a
费纳尔 5. 581 ±0. 017 a 5. 329 ±0. 036 a 5. 595 ±0. 070 a
　　L SD 测验 ( P = 0. 05) ,同一行标记字母相同为差异不显著
( P > 0. 05)
Values in same line followed by same letter do not indicate sig2
nificant difference at P = 0. 05 by L SD test
苜蓿 M1 arabica (Linn1 ) Huds1 中含有芦丁 ,而在
紫花苜蓿中未见含有芦丁的报道 ,笔者用 HPL C 检
测了试验所用的紫花苜蓿样品 ,未发现含有芦丁 ,因
此本研究选用苜蓿素为对照品 ,建立紫花苜蓿总黄
酮量的测定方法 ,其重现性和回收率的 RSD 值均在
3 %以下。
　　遗传与环境是影响植物次生代谢产物的两个主
要方面。本实验采用的品种均采自中国农业科学院
北京畜牧兽医研究所苜蓿品种对比试验地 ,气候、土
壤等环境差别不大 ,栽培管理措施一致 ,可以认为同
一采收期的品种间黄酮量的差异主要来源于遗传的
差异。9 个参试品种总黄酮的量有明显差异 ,其中
“费纳尔”和“爱维兰”为黄酮量较高的品种 ,“爱菲
尼”和“改革者”黄酮量较低 ,并且在 3 个采收季节表
现基本一致。由于紫花苜蓿叶片中黄酮的量远远高
于茎中的量 ,因此叶片比例高的品种黄酮量相对
较高。
紫花苜蓿在北京地区一年收割 3～4 次 ,分别为
5 月中下旬、6 月中下旬、8 月中下旬和 10 月中下
旬 ,由于采收季节不同 ,生长过程中温度、光照、湿度
有很大差异。来自于同一试验地同一品种的样品 ,
在不同采收季节黄酮量的变化主要来源于气候差
异。一般认为 ,高光照强度、低温以及较低的湿度有
利于黄酮类物质的合成[ 6 ] 。根据记录的气象数据 ,
实验当年 6 月平均温度为 25 ℃,紫外线强度为 3. 6
级 ,平均湿度为 55 % ;8 月平均温度为 28 ℃,紫外线
强度为 3. 8 级 ,平均湿度为 70 % ;10 月平均温度为
19 ℃,紫外线强度为 3. 5 级 ,平均湿度为 45 %。在
紫外线强度相差不大的情况下 ,10 月较低的温度和
湿度可能是样品中黄酮量较高的主要原因。
本实验首次报道了紫花苜蓿不同品种中的总黄
酮对季节变化的敏感性不同 ,即某些品种中黄酮的
量随季节变化不明显 ,而另外一些品种中黄酮的量
则显著受季节影响 ,具体机制有待进一步研究。
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