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虎杖苷对脑出血性损伤大鼠血清白细胞介素1和脑组织
Bcl2 蛋白表达的影响
刘 铭1 ,刘 华2 ,张国平2 ,张宇燕3 ,万海同3 ,杨洁红3 *
收稿日期: 20100415
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30873430, 30973933) ; 浙江省中医药管理局项目 ( 2007CA061)
作者简介:刘 铭( 1968 ) ,男,主任医师,主要开展中医临床基础研究。Email: yann oo7376@ 126. com
* 通讯作者 杨洁红 Email: yannoo7376@ sin a. com
( 1 浙江大学医学院附属邵逸夫医院,浙江 杭州 310016; 2 浙江大学医学院附属第二医院, 浙江 杭州 310009;
3 浙江中医药大学心脑血管病研究所,浙江 杭州 310053)
摘 要:目的 探讨虎杖苷对大鼠脑出血性损伤的治疗作用及作用机制。方法 采用 型胶原酶诱导大鼠脑出
血,建立脑出血模型, 观察虎杖苷对大鼠神经功能症状、脑组织中超氧化物歧化酶 ( SOD) 活力、丙二醛 ( MDA ) 水
平,脑组织 Bcl2 蛋白表达, 及血清中白细胞介素1( IL1) 水平的影响。结果 与脑出血模型组相比, 虎杖苷
( 25、50、100 mg / kg)可显著改善脑出血后神经功能缺损, 提高脑组织 SOD 活力、降低 M DA 水平, 增加 Bcl2 蛋白
表达,降低血清中 IL1水平,其作用与剂量呈正相关。结论 虎杖苷通过对抗自由基损伤,抗凋亡及抗炎等作用,
发挥对大鼠脑出血损伤的治疗作用。
关键词:虎杖苷; 脑出血; 型胶原酶; Bcl2 蛋白; 白细胞介素1
中图分类号: R286 2 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2010) 12 2010 04
Effect of polydatin on IL1 in serum and protein expression of Bcl2 in brain tissue
of cerebral hemorrhage injured rats
LIU M ing 1 , LIU Hua2 , ZHA NG Guoping2 , YANG Jiehong3 , ZHANG Yuyan3 , WAN Haitong3
( 1 Sir Run Run Shaw H ospital of Medical Co lleg e, Zhejiang Univ ersity , H ang zhou 310053, China; 2. Second Affiliated
H ospital o f Medical Colleg e, Zhejiang Univer sity, Hang zhou 310053, China; 3. Institute of Cardio vas cular Diseases,
Zhejiang Chinese Medical Univer sity, H ang zhou 310053, China)
Abstract: Objective To explore the ef fects and mechanisms of polydatin on rats w ith brain hemo r
r hag ic injur y. Methods The cerebral hemorrhage model in rats w as induced by local inject ion of type
col lag enase and they w er e randomly divided into six groups. The t reated g roups w er e t reated w ith polyda
t in and N aoxuekang; The normal and control groups w ere only t reated w ith w ater. The changes of neuro
logical defect w ere observ ed. The act ivity of SOD, the content of MDA, the protein expressions of Bcl2 in
brain t issue, and the contents of IL1 in serum were measured. Results Compared w ith the cerebral
hemo rrhage model g roup, polydat in ( 25, 50, and 100 mg/ kg) could signif icant ly reduce the symptoms of
neurolog ical deficit s of cer ebral hemor rhage rats, raise the act iv ity of SOD, r educe the content of MDA,
increase the pro tein expressions of Bcl2, and decr ease the contents of IL1 in ser um. Its effects w ere pos
it ively cor related w ith the doseef fect . Conclusion Polydat in has therapeut ic ef fect on rats o f cerebral
hemo rrhage, through against free radical damage and inhibit ing neuronal apoptosis and inf lammatory .
Key words: polydat in; cerebral hemo rrhage; collagenase ; Bcl2 protein; interleukin1
!2010! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
脑出血是指非外伤性脑实质内的出血, 较脑缺
血有更高的死亡率和致残率, 是严重威胁中老年健
康的疾病之一。脑出血后引起机休和脑组织局部发
生系列病理性反应, 除早期血肿本身的占位效应外,
尚与多种机制有关, 如氧自由基损害、炎症反应等,
目前尚缺乏有效的治疗手段, 手术的远期效果尚存
争议。
虎杖苷 ( polydat in) 是从蓼科蓼属虎杖 Poly
gonum cusp idatum Sieb. et Zucc. 的干燥根茎中提
取的单体, 也称白黎芦醇苷[ 1] ,是白藜芦醇与葡萄糖
结合的产物,属于茋类化合物,即羟基二苯乙烯类化
合物,化学名称为 3, 4∀, 5三羟基茋3D葡萄糖苷
( 3, 4∀, 5tr ihydroxst ilbene3Dg lucoside)。虎杖
苷具有较强的生物活性, 具有抗血栓形成、抗动脉硬
化、扩张血管、改善微循环、保护血管内皮、防治脑缺
血等药理作用[ 2] 。本实验在建立脑出血模型的基础
上,观察虎杖苷对大鼠脑出血损伤后神经功能症状、
脑组织超氧化物歧化酶 ( SOD ) 活力、丙二醛
( MDA) 水平, 脑组织 Bcl2 蛋白表达, 及血清中白
细胞介素1( IL1) 水平的影响, 探讨虎杖苷对大
鼠脑出血损伤的治疗作用及作用机制。
1 材料
1 1 动物: 健康清洁级 SD 大鼠, 雄性, 体质量
360~ 400 g, 实验室符合国家动物实验设施屏障系
统标准,于温度 22~ 25 # 、相对湿度 40% ~ 70%
环境条件下饲养,购自浙江中医药大学动物实验研
究中 心, 动物实验 条件合格证: SYXK ( 浙 )
20080115。
1 2 药品与试剂:虎杖苷由浙江中医药大学心脑血
管病研究所制备, 质量分数∃95% , 批号 2008001。
脑血康片由通化东宝永健制药厂生产, 批号
080312。上述药品临用前以生理盐水配制溶液。
型胶原酶 ( Sigma 公司) , IL1 ELISA 试剂盒 (上
海晶美生物技术有限公司) , SOD、MDA 检测试剂
盒 (南京建成生物工程研究所) , Bcl2 (为 Rabbit
来源的多克隆抗体)、SABC 免疫组化染色试剂盒、
DAB 显色试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公
司) , 其余试剂均为分析纯。
1 3 仪器: AG135 电子天平 (灵敏度 0 000 1 g, 瑞
士梅特勒托利多仪器有限公司) , U niversal 32 高
速离心机 (德国 H ett ich 公司) , NU 6382E 型
85 # 超低温冰箱 (美国 Nuaire 公司) ,三维立体定
位仪 (第二军医大学, 江湾 %型 C) , 680 型酶标仪
(美国伯乐生命医学产品有限公司) , T U 1900 双
光束紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限
责任公司) , MIAS 2000 型图像分析仪 (四川大学
智胜软件股份有限公司)。
2 方法
2 1 脑出血动物模型制备 [ 3] : 大鼠用 10% 水合氯
醛麻醉后,固定于脑立体定向仪上, 头顶剪毛,常规
消毒,矢状切开头正中额顶部皮肤, 暴露颅骨,以前
囟为中心,向后 0 2 mm 向右旁开 2 9 mm ,用牙科
钻在颅骨表面钻孔, 用固定在立体定向仪上的微量
注射器 ( 5 L,针头直径 0 7 mm) 沿钻孔进针垂直
插入脑组织,深约 6 mm (此处为尾状核位置) , 缓慢
注入含 1 U /L 型胶原酶的生理盐水 1 2 L,留
针 8 m in 缓慢出针,用牙科水泥封闭颅骨上的钻孔,
缝合切口 (假手术组仅钻开颅骨不注入胶原酶)。
2 2 分组与给药: 60 只大鼠随机分为 6 组:假手术
组、模型组、虎杖 ( 25、50、100 mg/ kg ) 组、脑血康
( 1 2 g/ kg) 组,每组 10 只。以上各组均于造模前
0 5 h ig 给药 1次,造模后连续给水、给药 4 d, 每天
2 次, 每次 3 mL (假手术组、模型组给予等容积生
理盐水) ,第 5天进行神经症状评级后断头处死, 取
脑,取脑前 12 h 禁食,自由饮水。
2 3 神经症状观察: 参照 Bederson 等 [ 4]的标准制
定。&级, 无明显障碍; %级, 提起鼠尾使鼠头下垂
位,患侧前肢回收屈曲于胸前, 正常侧的前肢伸展;
∋级, 追尾; (级, 追尾且偏瘫侧腿长拖, 眼分泌物
多,睑模糊; )级, 站立不稳,倒向健侧不能立起。
2 4 血清 IL1、脑组织 SOD 活力、MDA 水平及
Bcl2蛋白表达测定: 大鼠用 10% 水合氯醛 ( 0 4
mL/ 100 g) ip 麻醉,由腹主动脉抽取 4~ 6 mL 血
液,静置 60 m in 后, 4 000 r/ min 离心 10 m in, 取血
清,置 - 85 # 冰箱保存, 用于血清中 IL1的测
定;心脏灌流后,断头取脑, 低温下取出右侧脑组织,
靠额极的 1/ 2 脑组织, 称定质量后加生理盐水制成
10% 组织匀浆, 3 000 r/ min 离心 10 min, 取上清
液, - 85 # 冰箱保存,用于脑组织匀浆 SOD、MDA
测定; 靠枕叶的 1/ 2 脑组织,置于 4% 多聚甲醛溶
液中固定, 石蜡包埋, 切片, 免疫组化法测定 Bcl2
蛋白表达。脑组织匀浆 SOD 活力、MDA 测定采用
比色法; Bcl2 蛋白表达采用 SABC 免疫组化染色
法;血清中 IL1用 ELISA 法测定, 并分别按照各
试剂盒说明书操作。
2 5 数据处理: 计量资料比较用 t 检验,以 x ∗ s 表
示;等级资料比较用 Ridit 分析, 所有数据采用
SPSS 11 5 统计软件进行统计。
!2011!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
3 结果
3 1 神经症状观察:结果见表 1。脑出血模型组与
假手术组比较, 神经症状评级显著升高 ( P< 0 01) ,
结合 Ridit 值,可见神经症状以模型组最严重, 虎杖
苷低剂量组次之, 虎杖苷高、中剂量组程度较轻, 假
手术组最轻。
表 1 虎杖苷对脑出血大鼠神经功能症状的影响
Table 1 Effect of polydatin on neurological symptoms
of cerebral hemorrhage rats
组别
剂量/
( mg ! kg- 1 )
动物/
只
神经缺损症状
&级 %级 ∋级 (级 )级
假手术 - 10 10 0 0 0 0
模型 - 10 1 2 4 2 1
虎杖苷 25 10 2 2 3 3 0
50 10 2 4 2 2 0
100 10 3 4 3 0 0
脑血康 1 200 10 2 3 4 1 0
3 2 对脑出血大鼠脑组织 SOD活力和 MDA 水平
的影响:结果见表 2。脑出血模型组脑组织匀浆中
SOD 活力与假手术组相比显著降低 ( P< 0 01) , 虎
杖苷高、中剂量组与模型组相比均能显著提高 SOD
活力, 且量效关系呈正相关。提示虎杖苷可显著提
高脑出血损伤大鼠脑组织中 SOD 活力 ( P< 0 01、
0 05)。脑出血模型组脑组织匀浆中 MDA 水平与
假手术组相比显著升高 ( P< 0 01) ,虎杖苷高、中剂
量组、脑血康组与脑出血模型组相比均显著降低。
提示虎杖苷能显著降低脑出血大鼠脑组织中 MDA
表 2 虎杖苷对脑出血大鼠脑匀浆 SOD 活力和
MDA 水平的影响 ( x∗ s, n= 10)
Table 2 Effects of polydatin on activity of SOD
and level of MDA of cerebral hemorrhage
rats ( x ∗ s, n= 10)
组别 剂量/
( mg ! kg - 1 )
SOD/
(U ! mg - 1)
M DA /
( nmol! mg- 1 )
假手术 - 51 62 ∗ 2 97 8 01∗ 1 52
模型 - 30 70 ∗ 3 84* * 16 48∗ 1 61* *
虎杖苷 25 33 19 ∗ 3 30 14 58∗ 2 31
50 34 67 ∗ 3 75 12 12∗ 1 79+
100 43 58 ∗ 3 38 + + 10 91∗ 1 29+ +
脑血康 1 200 40 58 ∗ 3 43 + + 11 51∗ 2 19+ +
与假手术组比较: * * P< 0 01
与模型组比较: + P < 0 05 + + P < 0 01
* * P < 0 01 v s Sham group
+ P < 0 05 + + P< 0 01 v s m odel group
水平 ( P< 0 01、0 05)。
3 3 对脑出血大鼠脑组织中 Bcl2 蛋白表达的影
响:采用 SABC法进行 Bcl2免疫组化染色,显微镜
下观察,脑组织神经元细胞胞质中有棕黄色颗粒者
为阳性细胞,结果见图 1。每张免疫组化切片中采
集 10 个具有代表性的 400 , 互不重叠视野, 计数
Bcl2蛋白染色阳性细胞个数,取其平均值作为该标
本的阳性细胞数,结果见表 3。模型组 Bcl2 蛋白染
色阳性细胞数明显增多,虎杖苷高、中剂量组与模型
组相比, Bcl2 蛋白染色阳性细胞数明显增多 ( P<
0 01、0 05)。提示虎杖苷具有抗神经元凋亡的作用。
图 1 免疫组化检测 Bcl2 蛋白表达
Fig. 1 Protein expression of Bcl2 detected by immunohistochemistry
3 4 对脑出血大鼠血清中 IL1的影响:由表 3可
知,脑出血模型组血清中 IL1水平明显升高 ( P<
0 01) ,虎杖苷高、中剂量可明显降低 IL1水平, 与
模型组比较,差异显著 ( P< 0 01、0 05) , 表明虎杖
苷能显著抗脑出血引起的炎症反应,减少炎症因子
的释放。
4 讨论
脑出血是发病率较高的脑血管疾病, 而且三分
之一的患者在发病后一段时间内出现继发性神经功
能损伤。而氧自由基在脑出血继发性脑损害中也起
重要作用,脑出血时由于血肿压迫周围脑组织和微
血管,病灶周围存在大范围低灌注区,产生大量超氧
阴离子自由基[ 5] ;同时损伤区发生明显炎性反应[ 6] ,
激活的多形核白细胞也产生大量氧自由基。所产生
的自由基除了可使蛋白质及其他有机分子变性外,
还可与细胞脂质的疏水部分反应生成脂质自由基,
通过过氧化反应, 破坏细胞膜, 损害细胞完整性, 最
终造成细胞广泛损伤, 产生脑水肿。自由基还可导
!2012! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
表 3 虎杖苷对脑出血大鼠脑组织中 Bcl2 蛋白阳性
细胞数和血清中 IL1 的影响 (x ∗ s, n= 10)
Table 3 Ef fects of polydatin on positive cell number
of Bcl2 and IL1 in serum of cerebral
hemorrhage rats ( x∗ s, n= 10)
组 别 剂量/
( mg! kg- 1)
Bcl2 阳性
细胞/个
IL1/
( ng ! mL- 1)
假手术 - 6 1 6 ∗ 3 30 0 499 ∗ 0 053
模型 - 26 2 2 ∗ 4 03* * 0 921 ∗ 0 080* *
虎杖苷 25 36 9 8 ∗ 5 06 0 755 ∗ 0 083+
50 40 3 4 ∗ 6 11+ 0 738 ∗ 0 061+
100 49 0 6 ∗ 3 98+ + 0 641 ∗ 0 069+ +
脑血康组 1 200 39 2 0 ∗ 6 20+ 0 767 ∗ 0 074+
与假手术组比较: * * P < 0 01
与模型组比较: + P< 005 + + P< 0 01
* * P< 0 01 v s Sham gr ou p
+ P< 0 05 + + P < 0 01 v s model gr ou p
致脑组织微血管内皮细胞坏死, 引起脑血管通透性
增加,进一步加重脑水肿。本实验结果显示, 脑出血
后大鼠出现神经功能缺损明显, 脑组织 SOD 活力
显著下降,过氧化产物 MDA 显著增高,证实脑出血
时脂质过氧化反应增强, 抗自由基酶活力下降,显示
自由基与脑出血后脑组织的损伤密切有关。
细胞凋亡是不同于细胞坏死的一种细胞死亡形
式,其过程受多种相关基因及其蛋白调控,有研究表
明,细胞凋亡机制参与了脑出血继发性神经细胞损
伤。其中 Bcl2 家族在凋亡调控基因中位于重要地
位[ 7] , Bcl2 蛋白是一种膜合蛋白, 为中枢神经系统
主要的神经保护性蛋白, 它存在于细胞的线粒体、核
膜等处。Bcl2 家族既能阻抑坏死又能阻抑凋亡 [ 8] ,
一般认为, Bcl2 基因家族是一种重要的内源性抗凋
亡因子,过度表达后可抑制 Ca2+ 超载、阻止凋亡基
因信号的传递或基因产物的诱导、抑制由于氧自由
基、兴奋性氨基酸等诱发的神经细胞凋亡 [ 910]。本
实验结果发现, 假手术组大鼠脑组织中 Bcl2 蛋白
有较低水平的表达, 与假手术组相比,脑出血模型组
Bcl2 蛋白表达显著增加。
研究表明, 脑出血后存在明显的炎症反应,炎症
反应参与了脑出血后继发性脑水肿和脑损害的病理
生理过程,是具有血管系统的活体组织对损伤发生
的反应。动物试验证明, 脑出血后发生的炎症反应,
较非出血性脑损伤更为明显[ 11] 。Del Bigio 等[ 12] 发
现血凝块及受损的脑组织能释放化学趋化因子, 包
括凝血酶,促进中性粒细胞向血肿及周围脑组织转
移,成为活化的白细胞。活化的白细胞能够释放各
种细胞因子,如: IL1、IL6、肿瘤坏死因子 ( T NF
)、干扰素!( IN F!) 和氧自由基等, 加重脑损伤。
本实验结果显示, 脑出血后大鼠血清中 IL1水平
明显升高,证实脑出血后伴有明显炎症反应。
本实验结果表明, 虎杖苷可改善脑出血损伤后
大鼠神经功能缺损症状, 使脑组织 SOD 活力增强,
M DA 降低;同时使脑组织 Bcl2 蛋白表达增加,血
清中 IL1降低,且虎杖苷各剂量组量效呈正相关。
提示虎杖苷具有提高细胞抗氧化和抑制其脂质过氧
化作用,减轻自由基对脑组织损伤的作用,并具有明
显抗凋亡作用,同时通过减轻炎症反应,发挥虎杖苷
对脑出血损伤的治疗作用。
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