全 文 ：基金项目:国家自然科学基金资助项目(81173515);江苏省中药资源产业化过程协同创新中心重点项目(ZDXM-2-4);江苏省研究生培养创新
工程
作者简介:东水华，女，硕士研究生 研究方向:中药化学 * 通讯作者:梁侨丽，女，博士，教授 研究方向:中药活性成分研究
Tel:(025)85811512 E-mail:liangqiaoli2008@ 163. com
荆三棱中新化合物 sparstolonin B对脑出血大鼠脑损伤的保护作用
东水华1，汤雅敏1，刘杰1，杨清武2，梁侨丽1* (1. 南京中医药大学药学院，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，南京
210023;2. 第三军医大学新桥医院神经内科，重庆 400037)
摘要:目的 研究 sparstolonin B(8，5-dihydroxy-4-phenyl-5，2-oxidoisocoumarin，SsnB)对脑出血(intracerebral haemorrhage，
ICH)诱导的大鼠脑损伤的保护作用。方法 体外 Transwell实验观察 SsnB对血红蛋白(hemoglobin，Hb)诱导的小胶质细胞损
伤神经元的影响;采用自体血注射脑出血模型，出血后的第 1、3、5、7 天观察 SsnB 对 ICH 大鼠神经功能缺损评分(neurological
deficit score，NDS)，脑组织含水量的影响，ELISA法检测 ICH 大鼠脑组织匀浆中炎性细胞因子白细胞介素(IL)-6、IL-1β 和肿
瘤坏死因子(TNF)-α的含量变化。结果 第 1、3 天，5 和 15 mg·kg －1 SsnB都能减少 ICH大鼠的 NDS，降低 ICH 大鼠脑组织
含水量，明显下调脑血肿周围组织中炎性细胞因子的含量。结论 SsnB 对 ICH 大鼠脑损伤有保护作用，其机制可能与 SsnB
保护受损神经元，减轻脑出血大鼠神经功能缺损，降低脑组织含水量和炎症因子有关。
关键词:Sparstolonin B;脑出血;神经元存活率;神经功能缺损评分;脑组织含水量;炎性因子
doi:10. 11669 /cpj. 2016. 18. 008 中图分类号:Ｒ965 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2016)18 － 1574 － 05
Protective Effects of Sparstolonin B on Mouse with Intracerebral Haemorrhage
DONG Shui-hua1，TANG Ya-min1，LIU Jie1，YANG Qing-wu2，LIANG Qiao-li1* (1. School of Pharmacy，Nanjing Uni-
versity of Chinese Medicine，Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Ｒesources Industrialization，Nanjing 210023，
China;2. Department of Neurology，Xinqiao Hospital ＆ the Second Affiliated Hospital，The Third Military Medical University，
Chongqing 400037，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To study the protective effects of sparstolonin B(8，5-dihydroxy-4-phenyl-5，2-oxidoisocoumarin，Ss-
nB)on mouse with intracerebral haemorrhage(ICH). METHODS The effect of SsnB on neuronal cell death induced by Hb using a
microglia-neuron transwell system was investigated. Autologous nonanticoagulated blood was collected from the tail artery of the mouse
and then injected into the striatum using a syringe pump. Neurological deficit of the mouse with ICH was assessed 1，3，5 and 7 d after
SsnB administration using modified neurological severity score system，and brain water content of the mouse cerebral tissues after ICH
was measured at the same day． The concentrations of pro-inflammatory cytokines in perihematoma tissues，including interleukin-6，in-
terleukin-1β and tumor necrosis factor-α，were measured by ELISA assay. ＲESULTS The results show that SsnB significantly re-
duced the neurological deficit scores and the brain water content，and inhibited the levels of IL-6，IL-1β and TNF-α at first day and
third day after ICH. CONCLUSION SsnB can improve the brain injury in mouse induced by ICH. The mechanism may involve in-
creased the neuronal survival rate and decreased expression of pro-inflammatory cytokines of mouse after ICH.
KEY WOＲDS:sparstolonin B;intracerebral hemorrhage;neuronal survival rate;neurological deficit score;brain water content;pro-
inflammatory cytokines
脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是急性
脑血管病的主要病种之一，发病率、死亡率和致残率
极高，全世界每年约有 3 百万脑出血新发病人。近
20 年，亚洲脑出血中风占每年中风新发病人 20% ～
30%。随着对 ICH 发病机制深入研究，已经证实
ICH后进入脑组织的血液及其代谢产物导致的炎症
损伤是 ICH后神经功能缺损的最主要原因，炎症在
ICH的病理进程中起着关键作用，炎症损伤脑组织
并严重影响 ICH的预后［1］。
文献［2］报道了活血化瘀中药荆三棱(Scirpus
yagara)块茎抗炎有效部位对脑出血损伤小鼠有保
护作用，sparstolonin B(8，5-dihydroxy-4-phenyl-5，2-
oxidoisocoumarin，SsnB)是从荆三棱抗炎有效部位中
分离得到的新天然产物，结构式见图 1，具有显著抗
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炎作用，是一个 TLＲ2 和 TLＲ4 信号通路抑制剂，能
明显抑制巨噬细胞炎症反应，显著提高内毒素小鼠
存活率，降低小鼠炎症损伤［3-4］。SsnB 能抑制 HU-
VECs 细胞炎症反应，减少单核细胞黏附于内皮细
胞，抑制脂多糖(LPS)诱导的 HUVECs Erk1 /2 和
Akt蛋白的激活［5］。SsnB 能抑制 LPS 和血小板源
性生长因子(PDGF)刺激的血管平滑肌细胞
(VSMCs)中单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、肿瘤坏死
因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6 表达，显著抑制
LPS 和 PDGF 诱导的 VSMCs Erk1 /2 和 Akt 蛋白的
激活［6］。本实验进一步考察 SsnB 对脑出血大鼠是
否有保护作用。
1 材 料
SsnB为本课题组从荆三棱块茎分离得到的新
化合物，经 HPLC 检测，化合物纯度大于 99. 0%;
DW －2000 脑立体定位仪(成都泰盟软件有限公
司);SD雄性大鼠，SPF 级，180 ～ 220 g，6 ～ 8 周龄
(浙江省实验动物中心);新生小鼠(浙江省实验动
物中心);IL-6、IL-1β、TNF-α 试剂盒(美国 eBio-
science公司);神经元 β-微管蛋白Ⅲ抗体(美国 Co-
vance公司);Alexa Fluor  488 goat anti mouse IgG
染料和 Hoeschst 染料(美国 Invitrogen 公司);FBS
(美国 Gibco公司)。
2 方 法
2. 1 Transwell实验
分别取出生 1 d 以内的新生小鼠，冰浴分离出
大脑皮层，1%胰酶消化成单细胞悬液，小胶质细胞
用 10% FBS + DMEM/F12 培养，神经元用 2% FBS +
DMEM/F12 培养，每 3 d 换液，2 周后纯化。Tran-
swell小室分上下 2 层，上室接种小胶质细胞，加入
20 μmol·L －1 Hb 或 10 μmol·L －1 SsnB，下室接种
神经元细胞。36 h后移除上室，加入神经元 β-微管
蛋白Ⅲ抗体，用 Alexa Fluor  488 goat anti mouse
图 1 8，5-dihydroxy-4-phenyl-5，2-oxidoisocoumarin(SsnB)
的结构式
Fig. 1 Chemical structure of 8，5-dihydroxy-4-phenyl-5，2-ox-
idoisocoumarin(SsnB)
IgG染色，细胞核用 Hoechst 染色，共聚焦显微镜下
观察染色情况。四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测
神经元细胞的存活率。
2. 2 大鼠 ICH模型的制备［7］
SD大鼠用 10%水合氯醛按照 300 mg·kg －1剂
量麻醉后俯卧固定于脑立体定位仪上，取尾动脉血
50 μL，用注射泵(5 μL·min －1)注射至左脑纹状体
(大鼠前囟冠状缝前 0. 2 mm、旁开 3 mm、深 6 mm);
注射完毕后，将针留置 10 min，然后缓慢将微量注射
器针头拔出，用医用骨蜡封闭骨孔，观察无出血后，
缝合头部皮肤。假手术组小鼠注射 25 μL无菌生理
盐水。
手术大鼠清醒后按 Logna等［8］创立的 5 级神经
功能缺陷评分方法对大鼠进行神经功能评分，选择
神经功能评分在 2 级以上的大鼠视为脑出血模型成
功，纳入实验对象，剔除神经功能评分 0 级或 4 级的
大鼠。
2. 3 分组与给药
实验分为假手术组组、ICH 组、5 和 15 mg·
kg －1组，每组 6 只大鼠，编号。各组做脑出血手术，
术后 2 h，腹腔注射相应药物(SsnB 用大豆油配制，
假手术组组和 ICH注射大豆油)，每天 1 次。
2. 4 脑出血小鼠神经功能缺损评分(NDS)
将 24 只小鼠随机分为 4 组。各组术后连续给
药 7 d，并在给药后的 1、3、5、7 d 参照文献［7］对各
组进行神经功能缺损评分，主要包括提尾反射、行走
测试、感觉测试、平衡测试、反射缺失和反常运动。
最大得分为 18 分，轻型伤:1 ～ 6 分;中型伤:7 ～ 12
分;重型伤:13 ～ 18 分。
2. 5 脑组织含水量测定
将 24 只小鼠随机分为 4 组。各组术后连续给
药 7 d，并在给药后的 1、3、5、7 d将大鼠麻醉后取出
脑组织，分离去除嗅脑、小脑和脑干等组织，剩余双
侧大脑半球，以进针孔为界冠状面切开脑组织，前半
部分出血灶及血肿周围脑组织用来检测脑组织含水
量，后半部分血肿周围脑组织置于 － 70 ℃冰箱冻
存，用来研磨脑组织匀浆进行炎症因子检测。称取
前半部分出血灶及血肿周围脑组织的湿重，然后置
于 100 ℃烤箱烘烤 24 h 后称量干重。脑组织含水
量计算方法:(湿重 －干重)/湿重 × 100%。
2. 6 ELISA法测定脑组织中炎症因子的含量
取假手术组、ICH 组、SsnB 不同剂量组大鼠不
同时间点血肿周围新鲜组织 0. 5 g，加入冰冷 PBS
使质量浓度为 10%匀浆，4 ℃，4 000 r·min －1，离心
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15 min，取上清液分装，－ 20 ℃保存备用。ELISA检
测组织匀浆液中的 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的表达变
化情况。
2. 7 统计分析
采用 GraphPad Prism 5 软件进行统计分析，数
据以 珋x ± s表示，两两均数比较使用 t 检验，P ＜ 0. 05
认为具有显著性差异。
3 结 果
3. 1 SsnB显著提高 Hb 诱导小胶质细胞损伤的神
经元存活率
通过 Transwell 实验考察 10 μmol·L －1 SsnB 对
Hb诱导小胶质细胞损伤神经元的保护作用。与空
白组比较，SsnB对神经元生长无影响，在 36 h 观察
期内神经元存活率一直稳定在 80%;而模型组(Hb
组)神经元存活率显著下降，在 24 和 36 h 分别为
41. 2%和 22. 1%，但同时给予神经元 SsnB 后，24 和
36 h神经元存活率得到显著提高，分别为 65. 3%和
40. 5%。表明 SsnB 对 Hb 诱导小胶质细胞损伤的
神经元有明显保护作用。结果见图 2。
3. 2 SsnB对脑出血大鼠神经功能缺损的影响
神经功能缺损评分(NDS)是用来评价脑出血严
重性的重要指标。ICH组的 NDS 显著高于假手术组
(P ＜0. 01)，表明脑出血手术是成功的;15 mg·kg －1
组在给药后的 1，3 d 均能明显改善大鼠的神经功能
缺损(P ＜0. 05)，而 5 mg·kg －1组只在给药后 1 d 能
显著降低脑出血大鼠 NDS(P ＜0. 05)，见图 3。
3. 3 SsnB对脑出血大鼠脑组织含水量的影响
脑出血大鼠在注射 SsnB 后脑组织含水量的变
化情况结果见表 1。从表 1 中可知，出血后，大鼠脑
组织中的含水量会显著升高(P ＜ 0. 01)，并在 3 d
达到最大，即 82. 14%;15 mg·kg －1组在 1，3 d 均能
显著 降 低 脑 出 血 大 鼠 脑 组 织 中 的 含 水 量
(P ＜ 0. 05)，其中出血后 1 d 脑组织含水量下降了
1. 53%，3 d下降了 2. 21%;而 5 mg·kg －1组只在 3
d 能明显降低脑出血大鼠脑组织中的含水量
(P ＜ 0. 05)，其使脑组织含水量下降了 2. 14%。
3. 4 SsnB对脑出血大鼠脑组织中炎性细胞因子表
达的影响
采用 ELISA 法检测炎症因子 TNF-α、IL-1β 和
IL-6 在脑出血大鼠脑组织中的含量变化。假手术组
和 ICH组结果见图 4，由图 4 可以看出，TNF-α、IL-
1β和 IL-6 在脑出血大鼠中的表达水平显著增高
(P ＜ 0. 01)，并且在 3 d 达到最大值。与 ICH 组
图 2 SsnB对 Hb 诱导小胶质细胞损伤的神经元保护作用
(× 200)
A －对照组;B － SsnB组;C － Hb 组;D － Hb + SsnB 组;E －细胞存活率(n =
4)。神经元 β-微管蛋白Ⅲ显绿色，细胞核显蓝色。与 Hb组比较，1)P ＜0. 01
Fig. 2 SsnB increased the survival rate of neurons(× 200)
A － control;B － SsnB;C － Hb;D － Hb + SsnB;E － cell viability(n =4). Neuronal
class Ⅲ beta tubulin indicating neurons:green;DAPI indicating nuclear staining:
blue. 1)P ＜0. 01，compared with Hb group
图 3 各组不同时间脑出血大鼠神经功能缺损评分． n =6，珋x ± s
与假手术组组比较，1)P ＜0. 01;与 ICH组比较，2)P ＜0. 05
Fig. 3 NDS in different time． n = 6，珋x ± s
1)P ＜0. 01，compared with sham group;2)P ＜0. 05，compared with ICH group
比较，15 mg·kg －1在出血后的 1，3 d 能显著抑制
TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的表达水平(P ＜ 0. 05 或
P ＜ 0. 01)，在出血后的 5 d 能显著抑制 IL-1β 的表
达水平(P ＜ 0. 01);5 mg·kg －1在出血后的 1 d能显
著 抑 制 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的 表 达 水 平
(P ＜ 0. 05)，在出血后的 3 d 能显著抑制 TNF-α 和
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IL-1β的表达水平(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)，在出血后
的 5 d能显著抑制 IL-6 的表达水平(P ＜ 0. 05)。与
ICH组相比，5 mg·kg －1组在 1 d 使大鼠脑组织中
TNF-α，IL-1β 和 IL-6 含量分别降低了 21. 28%，
10. 60%和 17. 87%;在 3 d，使大鼠脑组织中 TNF-α
和 IL-1β 含量分别降低了 22. 87%和 16. 10%;在 5
d，使大鼠脑组织中 IL-6 含量降低了 13. 94%。与
ICH组相比，15 mg·kg －1组在 1 d 使大鼠脑组织中
TNF-α，IL-1β 和 IL-6 含量分别降低了 29. 58%，
18. 28%和 17. 07%;在 3 d，使大鼠脑组织中 TNF-α，
IL-1β和 IL-6 含量分别降低了 33. 68%，24. 37%和
16. 93%;在 5 d，使大鼠脑组织中 IL-1β 含量降
低了 29. 28%。
4 讨 论
Toll样受体(TLＲs)在天然免疫和炎症反应中
起着重要作用，其能识别病原相关分子模式激活炎
症信号级联反应，产生一系列炎症介质［9-10］。最近
临床研究发现，ICH 炎症反应与 TLＲ 活化密切相
关［11-12］，脑出血患者外周血中单核细胞 TLＲ2 和
TLＲ4 的表达明显增加，并且 TLＲ2 和 TLＲ4 的表达
增加与病人的不良预后有着密切联系，其激活后释
放的多种酶和炎症介质会加重局部组织水肿和神经
细胞损害，从而影响脑出血的预后［10］。小胶质细胞
是脑组织中的巨噬细胞，正常情况下，对神经元有保
护作用;当病人脑出血发生时，小胶质细胞上的
TLＲs会在几分钟内被 Hb激活，产生各种细胞
表 1 脑出血大鼠脑组织含水量 . n = 6，珋x ± s
Tab. 1 Brain water content(%)in mice with intracerebral haemorrhage. n = 6，珋x ± s
Group
Brain water content /%
1 d 3 d 5 d 7 d
Sham 78. 64 ± 0. 26 78. 32 ± 0. 87 77. 67 ± 0. 32 77. 54 ± 0. 37
ICH 81. 99 ± 1. 101) 82. 14 ± 1. 301) 80. 49 ± 1. 391) 79. 62 ± 0. 931)
SsnB 5 mg·kg － 1 80. 69 ± 1. 06 80. 00 ± 0. 942) 79. 89 ± 1. 62 79. 09 ± 1. 30
SsnB 15 mg·kg － 1 80. 46 ± 0. 902) 79. 93 ± 0. 952) 79. 19 ± 1. 23 79. 08 ± 1. 04
注:与假手术组比较，1)P ＜0. 01;与 ICH组比较，2)P ＜0. 05
Note:1)P ＜0. 01，compared with sham group;2)P ＜0. 05，compared with ICH group
图 4 SsnB对血肿周围组织中炎性细胞因子的影响 . n = 6，珋x ± s
A － TNF-α的影响;B － IL-1β的影响;C － IL-6 的影响。与假手术组比较，1)P ＜0. 01;与 ICH组比较，2)P ＜0. 05，3)P ＜0. 01
Fig. 4 Levels of inflammatory factors in perihematoma tissues of mice with intracerebral haemorrhage． n = 6，珋x ± s
A － levels of IL-6;B － levels of IL-β;C － levels of TNF-α;1)P ＜0. 01，compared with sham group;2)P ＜0. 05，3)P ＜0. 01，compared with ICH group
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因子、趋化因子、自由基、NO 以及其他潜在的毒性
因子，加剧患者的脑损伤［13］。
前期发现荆三棱块茎抗炎有效部位对脑出血损
伤有保护作用［2］，SsnB 是该有效部位的成分之一，
且 SsnB具有显著抗炎作用，是一个 TLＲ2 和 TLＲ4
信号通路抑制剂。本实验研究 SsnB 对 ICH 后大鼠
脑损伤的保护作用，体外实验结果表明，SsnB 能显
著提高 Hb诱导小胶质细胞损伤的神经元存活率。
体内实验结果显示，SsnB能明显减少 ICH大鼠的神
经功能缺损评分，降低脑组织含水量，下调脑组织中
炎性因子 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的表达。其作用机
制可能与 SsnB保护受损神经元，减轻脑出血大鼠神
经功能缺损评分，降低脑组织含水量和炎症因子
有关。
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(收稿日期:2016-01-08)
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