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苦瓜蛋白抗肿瘤作用及其分子机制
熊术道1, 尹丽慧1, 李景荣2, 叶爱芳1, 章圣辉1, 温博贵3Ξ
(11 温州医学院附属第一医院医学科学研究所, 浙江 温州　325000; 21 温州医学院附属第一医院 急诊科,
浙江 温州　325000; 31 汕头大学医学院 分子生物学研究室, 广东 汕头　510031)
摘　要: 目的　探讨苦瓜蛋白对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响和荷瘤小鼠血清基质金属蛋白酶 MM P22、MM P29 的活
性及变化以及细胞因子白细胞介素26 ( IL 26) 及肿瘤坏死因子2Α (TN F2Α) 表达的影响。方法　将清洁级 ICR 雄性
小鼠按体重随机分成5 组, 建立肝癌 H 22皮下移植瘤模型, 分为模型组、苦瓜蛋白高、中、低剂量 (100、50、25 m gökg)
组及环磷酰胺组 (CTX, 40 m gökg) , 各组均 ip 给药, 观察苦瓜蛋白对肿瘤生长的影响; 分离血清, 明胶酶谱法检测
荷瘤小鼠血清基质金属蛋白酶MM P22、MM P29 的活性及其变化, EL ISA 检测细胞因子 IL 26 及 TN F2Α表达。结果
　苦瓜蛋白组与模型组相比, 肿瘤质量明显减轻 (P < 0101) , 小鼠体重也较模型组小鼠轻 (P < 0101) ; 苦瓜蛋白
(100、50、25 m gökg) 组及 CTX 组抑瘤率分别为 85181%、66189%、52105%、65110% ; 各苦瓜蛋白组与模型组相
比,MM P22、MM P29 的活性降低, 酶原表达下调 (P < 0101) ; 细胞因子 IL 26 及 TN F2Α表达明显下调 (P < 0101) ,
上述作用与苦瓜蛋白剂量相关。结论　苦瓜蛋白具有较强的体内抗肿瘤活性; 其抗肿瘤作用可能与苦瓜蛋白抑制
MM P s 的活性及表达, 以及调节 IL 26 及 TN F2Α等细胞因子的表达水平有关。
关键词: 苦瓜蛋白; 移植性肿瘤; 基质金属蛋白酶
中图分类号: R 286191　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253- 2670 (2008) 03- 0408- 04
　　苦瓜蛋白 (momo r charin glycop ro tein s) 是从
苦瓜籽中分出的一种相对分子质量约为 30 000 的
碱性糖蛋白质, 属于 I型核糖体失活蛋白 ( ribo som e
inh ib it ing p ro tein, R IP)。R IP 具有明显的抗肿瘤、
抗病毒作用, 具有极高的药用价值[1, 2 ]。前期研究表
明苦瓜蛋白可以明显诱导 K562 细胞产生细胞凋
亡[3 ]。为进一步研究苦瓜蛋白对动物移植性肿瘤的
作用及分子机制, 笔者研究了不同剂量苦瓜蛋白对
移植性肝癌 H 22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及其对荷瘤
小鼠基质金属蛋白酶 (m atrix m eta llop ro tease,
MM P s) MM P22、MM P29 的活性与变化以及细胞 因子白细胞介素26 ( IL 26) 及肿瘤坏死因子2Α(TN F2Α) 表达的影响。1　材料111　仪器及试剂: Im age m aster 凝胶成像系统( GE health )、EL x800 酶 标 仪、IL 26 及 TN F2ΑEL ISA 试剂盒购自B io sou rce 公司。112　实验动物与细胞株: 清洁级 ICR 雄性小鼠, 体重 18～ 22 g, 温州医学院实验动物中心提供。 ICR小鼠 H 22腹水瘤细胞由浙江中医药大学生命科学系惠赠。2　方法
·804· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2007207207
基金项目: 浙江省中医药管理局资助课题 (2002C080) ; 广东省教育厅自然科学研究项目 (Z02041) ; 浙江省教育厅研究项目 (20062
1779)
作者简介: 熊术道 (1970—) , 男, 硕士, 助理研究员, 研究方向为肿瘤分子生物学及抗肿瘤药理学。
T el: (0577) 86550296　E2m ail: xshdao@ 163. com3 通讯作者　温博贵　T el: (0754) 8900437
211　苦瓜蛋白的分离与纯化: 预冷梯度丙酮沉淀得
到的苦瓜籽粗蛋白经 SP Sepharo se H igh Perfo r2
m ance 阳离子交换色谱柱在 GE2H ealth 中压色谱
系统中分离纯化得到的一种相对分子质量约为
25 200 的碱性糖蛋白质[4, 5 ]。
212　荷瘤小鼠模型的建立: 无菌条件下抽取肝癌小
鼠腹水中的 H 22细胞, 无菌生理盐水调整肿瘤细胞
浓度为 1×106ömL , 于 ICR 小鼠左前肢腋下行无菌
皮下接种, 细胞总数为 2×105ö只。
213　实验动物分组及处理: 将清洁级 ICR 雄性小
鼠按体重随机分成 5 组 (每组 12 只) , 建立肝癌 H 22
皮下移植瘤模型, 分别为苦瓜蛋白低、中、高剂量
(25、50、100 m gökg) 组、模型组给以等量生理盐水、
环磷酰胺 (CTX, 40 m gökg)。各组均 ip 给药, 给药
体积为每只 012 mL , 每日1 次, 连续 12 d。停药后次
日对小鼠进行眼静脉穿刺取血, 离心分离血清, - 20
℃ 冻存备用。
214　苦瓜蛋白对荷瘤小鼠肿瘤抑制作用: 停药后次
日处死小鼠, 剥离瘤体称其质量, 计算肿瘤生长抑制
率 (抑瘤率)。
抑瘤率= (模型组平均瘤质量- 治疗组平均瘤质量) ö模
型组平均瘤质量×100%
215　MM P s 酶谱检测: 血清MM P 酶谱检测参考
文献方法[6 ]。配制 715% 分离胶 (含 011% 明胶)
和 5% 浓缩胶, 取 1∶20 稀释小鼠血清 10 ΛL 加等
体积无变性 2×SD S 上样缓冲液进行电泳, 电泳完
成后剥离凝胶, 用 215% T ritonX2100 中洗脱 15
m in×2 后, 凝胶置于反应液 [ 50 mmo löL T ris2HC l
(pH 7. 5) , 150 mmo löL N aC l, 10 mmo löL CaC l2,
0. 02% N aN 3 ] 37 ℃ 孵育过夜。取出凝胶进行考马
斯亮蓝染色并脱色, 结果用 Iam gem aster 进行拍
照, 结果分析采用 quan t ity one 软件进行积分吸光
度扫描分析。其中:MM P 活性表现为深色背景中的
白色或浅色条带。其中相对分子质量 92 000 为
MM P29 酶原相应条带, 84 000 为其活化形式;
72 000 为MM P22 酶原相应条带, 64 000 为其活化
形式相应的条带。
216　 IL 26 及 TN F2Α检测: 严格按 EL ISA 试剂盒
说明书操作, 检测血清中 IL 26 及 TN F2Α水平。
217　统计学处理: 用 O ne2w ay ANOV E 统计方法
进行 studen t2t 检验。
3　结果
311　色谱分离得到的峰蛋白经 SD S2PA GE 电泳
及等电聚焦电泳, 考马斯亮蓝 G2250 染色鉴定为相
对分子质量约为 25 200, 等电点 (P I) 约为 813 的
单一条带蛋白。
312　苦瓜蛋白对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用: 不同剂
量苦瓜蛋白及 CTX 对 ICR 小鼠 H 22实体瘤均有明
显抑制作用 (表1)。25、50、100 m gökg 苦瓜蛋白组
及 CTX 组抑瘤率与模型组比较差异非常显著
(P < 0101) , 苦瓜蛋白高剂量与中、低剂量组间差异
显著 (P < 0105) , 中、低剂量组间无统计学意义
(P > 0105)。同时, 苦瓜蛋白组及 CTX 组 ICR 小鼠
体重较模型组轻 (P < 0101)。
表 1　苦瓜蛋白对肝癌移植瘤 H22小鼠体重及瘤质量的
影响 (x±s, n= 12)
Table 1　Effect of momordin on body we ight and tumor　
we ight of H22m ice (x±s, n= 12)
组别 剂量ö(m g·kg- 1) 体重ög 瘤质量ög 抑瘤率ö%
模型 - 32110±1191 1149±0134 -
苦瓜蛋白 25 27140±41053 3 0171±01173 3 52105
50 24102±21063 3 0149±01183 3 66189
100 21189±11833 3 0121±01153 3 85181
CTX 40 25108±21163 3 0152±01223 3 65110
　　与模型组比较: 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs model group
313　苦瓜蛋白对荷瘤小鼠血清MM P s 的影响: 不
同剂量苦瓜蛋白及 CTX 对 H 22 荷瘤小鼠血清
MM P s 表达及活性均有明显的下调作用, 与模型组
比较, 差异非常显著 (P < 0101) ; 不同苦瓜蛋白剂量
组间差异显著 (P < 0105) ,MM P s 表达及活性下调
与苦瓜蛋白处理的剂量的高低呈正相关, 以高剂量
组变化最明显, 见表2。
314　苦瓜蛋白对荷瘤小鼠血清 IL 26 和 TN F2Α的
影响: 不同剂量苦瓜蛋白及 CTX 对 H 22荷瘤小鼠血
清 IL 26 和 TN F2Α表达均有明显的下调作用, 与模
型比较, 差异非常显著 (P < 0101) ; 不同苦瓜蛋白剂
量组间差异显著 (P < 0105) , IL 26 和 TN F2Α表达
下调与苦瓜蛋白处理的剂量的高低相关, 其中高剂
量组 IL 26 和 TN F2Α表达下调最明显, 见表3。
4　讨论
　　苦瓜作为药食同源的植物, 苦瓜蛋白药理活性
显著, 不良反应小, 具抗肿瘤、抗病毒等作用, 具有极
大的药用价值。其中苦瓜蛋白属于 I型 R IP, 是从苦
瓜种仁中分离出来的一类能够使核糖体失活、抑制
细胞蛋白质合成的碱性糖蛋白。近年来研究发现某
些植物来源的 I 型 R IP 能够诱导肿瘤细胞产生凋
亡[1～ 3 ], 而对正常的小鼠上皮培养细胞 (Sm ac213)
无抑制作用[7 ]。另外, 前期研究表明苦瓜蛋白可以明
·904·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
表 2　苦瓜蛋白对肝癌移植瘤 H22小鼠血清MM Ps 的影响 (x±s, n= 12)
Table 2　Effect of momordin on MM Ps in serum of H22m ice (x±s, n= 12)
组别
剂量ö
(m g·kg- 1)
积分吸光度
MM P29 酶原 活性MM P29 MM P22 酶原 活性MM P22
模型 - 1 395145±301131 908196±102153 796173±212194 1 125115±331181
苦瓜蛋白 25 1 237145±2361943 3 801135± 931913 3 816150±1131883 3 979114±1561053 3
50 785155±2431953 3 548156±1371353 3 736194±1851063 3 914169±1551163 3
100 536167±1331723 3 323179±1161393 3 653101± 331823 3 629138±1211373 3
CTX 40 582134± 861533 3 408171±1021373 3 738184± 491653 3 706172±1151323 3
　　　与模型组比较: 3 3 P < 0101
　　　3 3 P < 0101 vs model group
表 3　苦瓜蛋白对肝癌移植瘤 H22小鼠血清 IL -6 和 TNF-Α
表达的影响 (x±s, n= 12)
Table 3　Effect of momordin on expression
of IL -6 and TNF-Α in serum
of H22m ice (x±s, n= 12)
组别 剂量ö　 (m g·kg- 1) IL 26ö(pg·mL - 1) TN F2Αö(pg·mL - 1)
模型 - 29110±1127 116116±4189
苦瓜蛋白 25 20123±01983 3 89122±21993 3
50 4172±01863 3 60104±31413 3
100 0198±01693 3 55188±11543 3
CTX 40 12138±01763 3 57121±11263 3
　　与模型组比较: 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs model group
显诱导 K562 细胞产生凋亡, 同时细胞黏附分子
CD 54 表达上调与苦瓜蛋白诱导肿瘤细胞凋亡相
关[3 ]。
本实验结果表明, 苦瓜蛋白对小鼠移植性肿瘤
H 22的生长有显著的抑制作用, 且同剂量呈正相关;
高、中剂量组抑瘤率高于 CTX 阳性对照组。同时,
各剂量组及 CTX 组小鼠的体重有一定的下降, 说
明在上述给药剂量范围内苦瓜蛋白和 CTX 一样还
是具有一定的毒副作用。
MM P s 作为一组 Zn2+ 依赖性具有相关结构的
内肽酶, 可水解细胞外基质。它们在生理状态下主要
参与组织发育、伤口愈合、骨生长及血管生成等参与
组织的重建等; 在病理情况下,MM P s 则能促进许
多疾病的发生、发展, 如参与肿瘤的侵袭和转移以及
促进新生血管的形成等病理过程, 在肝癌等肿瘤中
高表达MM P22 及MM P29, 因此阻断细胞外基质
降解及抑制MM P s 活性已逐渐成为肿瘤治疗的新
靶点[8～ 9 ]。本研究结果表明, 苦瓜蛋白对MM P22 及
MM P29 的酶原及其活性具有明显的抑制作用, 作
用与苦瓜蛋白剂量呈正相关, 其中, 以MM P29 活性
降低最为明显。因此, 苦瓜蛋白通过抑制MM P s 的
合成, 特别可能是抑制其活性等机制来发挥抗肿瘤
生长、侵袭和转移作用。
肿瘤细胞以自分泌和旁分泌方式表达的多种细
胞因子, 这些细胞因子可以调节肿瘤细胞的生长。肝
癌、食道癌、胃癌、大肠癌、肺癌等恶性肿瘤患者血清
中 IL 26 及 TN F2Α等细胞因子表达明显升高, IL 26
及 TN F2Α表达上调与恶性肿瘤的治疗及预后密切
相关[10 ]。本研究结果表明, 苦瓜蛋白处理移植性肝
癌 H 22荷瘤小鼠时, 可见血清中 IL 26 及 TN F2Α表
达明显下降, 说明苦瓜蛋白抗肿瘤作用时, 通过诱导
细胞凋亡等方式导致肿瘤细胞数目的减少, 引起肿
瘤细胞分泌到循环系统中的 IL 26 及 TN F2Α等细胞
因子水平相应降低所致。因此, IL 26 及 TN F2Α变化
可能反应了苦瓜蛋白抗肿瘤作用的药用效果, 至于
IL 26 及 TN F2Α变化本身是否参与了其抗肿瘤的病
理生理过程, 尚需进一步研究加以阐明。
综上所述, 苦瓜蛋白具有较强的体内和体外抗
肿瘤作用的活性; 其抗肿瘤作用可能和苦瓜蛋白具
有抑制MM P s 的活性及其表达, 以及调节 IL 26 及
TN F2Α等细胞因子的表达水平有关。
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以血清药理学方法研究复方丹参缓释片的缓释作用
邱明丰1, 2, 彭　腾2, 罗海燕4, 杨远友3, 谢秀琼2, 贾　伟1Ξ
(11 上海交通大学药学院, 上海　200240; 21 成都中医药大学药学院, 四川 成都　610075; 31 四川大学原子核
科学技术研究所, 四川 成都　610041; 41 海南医学院 药学系, 海南 海口　571101)
摘　要: 目的　以含药血清钙拮抗作用为指标, 研究复方丹参缓释片缓释作用。方法　以自制复方丹参片作对照,
心肌缺血模型犬口服复方丹参缓释片后, 在规定时间点取血清样品, 用45Ca 跨膜内流测量技术测定含药血清钙拮
抗作用, 考察含药血清的时间2钙拮抗作用规律。结果　复方丹参缓释片含药血清样品在 2～ 10 h 均有显著或极显
著的钙拮抗作用, 自制复方丹参片含药血清在 1～ 4 h 有显著或极显著钙拮抗作用。结论　复方丹参缓释片与自制
复方丹参片相比, 可延长钙拮抗作用持续的时间, 具有缓释作用, 含药血清钙拮抗作用测定方法可作为其缓释作用
评价的方法之一。
关键词: 复方丹参缓释片; 血清药理学; 45Ca 跨膜内流测量技术; 缓释作用
中图分类号: R 286164　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253- 2670 (2008) 03- 0411- 03
　　复方丹参属研制方[1 ] , 其成药复方丹参片和复
方丹参缓释片 (Compound D an shen Su sta ined2
release T ab let, CD ST ) 均为钙拮抗剂, 体外释放样
品钙拮抗作用研究表明, 复方丹参缓释片具有延缓
起效的作用[2 ]。本研究用血清药理学方法, 以含药血
清的钙拮抗作用为指标, 观察犬给予复方丹参缓释
片后, 不同时间含药血清钙拮抗作用的经时变化, 并
与自制复方丹参片进行比较, 旨在探讨复方丹参缓
释片体内缓释作用评价的方法。
1　材料
111　动物:W istar 大鼠, 体重 (200±20) g, 雌雄各
半, 四川大学华西医学院实验动物中心提供。6～ 8
月龄 Begle 犬 (合格证号医动字 2416013123) , 雄
性, (12±2) kg, 四川省医学科学院动物研究所犬养
殖场提供。
112　仪器与试剂: FJ—210T P 液体闪烁计数器 (西
安二六二厂) , 十六道生理记录仪 (美国 B IO PA C
公司)、ECG—6511 心电图机 (上海光电医用电子
仪器有限公司) , 动物呼吸机 (浙江大学医学仪器
厂) , 离心机 (北京医用离心机厂)。放射性同位素
45CaC l2 (1 570 M Bqög, 英国 Am ersham 公司) , 其
余试剂均为市售分析纯。
113　药品: 维拉帕米 (V erapam il, 江苏省连云港制
药厂, 批号为 991115, 2 mL ∶5 m g)。复方丹参缓释
片和自制复方丹参片, 成都中医药大学中药炮制与
药剂教研室自制, 每片 015 g, 含丹参酮Ê A 5167
m g、丹参素 13182 m g、原儿茶醛 2161 m g、三七总
皂苷 4812 m g、冰片 33121 m g [2 ]。
114　实验用溶液: 复合电解质溶液 (PSS 溶液) :
N aC l 137 mmo löL、CaC l2 1. 5 mmo löL、M gC l2 1. 0
mmo löL、KC l 3. 0 mmo löL、H EPES 20 mmo löL、葡
萄 糖 10 mmo löL ; 高 钾 PSS 溶 液: KC l 100
mmo löL、N aC l 400 mmo löL , 其余同 PSS 溶液; 无
Ca2+ 2EGTA [钙螯合剂, 乙二醇双 (Α2氨基乙酸) 醚
四乙酸 ]洗涤液: EGTA 10 mmo löL , 其余成分同
PSS 溶液 (无 CaC l2)。以上溶液用重蒸水配制, pH
为 714。甲苯闪烁液: PP0 510 g, 乙二醇乙醚 300
mL , 加甲苯定容至 1 000 mL。
2　方法
211　溶液制备: 以重蒸水为空白对照溶液, 盐酸维
·114·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2006206208
基金项目: 国家自然科学基金青年科学基金资助项目 (30000223)
作者简介: 邱明丰 (1970—) , 男, 山东省滕州人, 副教授, 博士, 硕士生导师, 主要从事中药新剂型和新制剂研究。
E2m ail: m fqiu@ sjtu. edu. cn3 通讯作者　贾　伟　T el: (021) 62932292　E2m ail: w eijia@ sjtu. edu. cn