全 文 ：○实验研究 ○
半边旗提取物 5F抗肿瘤作用的实验研究＊

戴 　滨 　崔 　燎 　吴　铁　邓亦峰　吴科锋
广东医学院药理教研室, 广东天然药物研究与开发实验室 (广东湛江 524023)
　　摘要:目的:观察半边旗提取物 5F体外 、 体内抗肿瘤活性及其毒性。方法:用MTT 法观察 5F注射液对 SPCA-1 ,
K562 瘤株的体外抗肿瘤作用;采用荷瘤小鼠瘤重 、 抑瘤率检测提取物 5F 对小鼠移植性肿瘤 S180 抑制作用;观察 5F
对荷艾氏腹水癌小鼠的生命延长率;胸腺指数 、 肝脏指数 、 脾脏指数 、 白细胞数等指标观察 5F 对免疫器官的影响。
结果:5F注射液对SPCA-1、 K562瘤株有显著的体外抗肿瘤作用;对小鼠肉瘤 S180也有抗肿瘤活性;对荷艾氏腹水癌
的小鼠生命有延长作用;同时对免疫系统有一定抑制作用。结论:半边旗有效成分 5F 有一定的体内 、 体外抗肿瘤活
性;对荷瘤小鼠功能有抑制作用。
　　关键词:半边旗　二萜类化合物　K562　SPCA-1　小鼠移植性肿瘤
　　中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3649 (2006)02-0010-03
　　Experimental Research on the function of anti-Cancer in the abstracts of pteris Semipinnata L./ Dai Bin 　Cui Liao　Wu
Tie　Deng Yifeng　Wu Kefeng.∥Department of pharmacology , Guangdong key Laboratory for Research and Development of Natural
Drugs , Guangdong Medical College (Zhanjiang Guangdong 524023)
　　Abstract　Objective:To observe the cytotoxic effects in vivo of 5F extracted from Pteris semipinnata L.and its toxicity.Methods:
MTT assay was used to assess the proliferation of SPCA-1 and K562 cells in vitro treated with 5F , and the inhibitory effects of 5F on
S180 tumors were observed in mice with subcutaneous inoculation of the tumor cells , and the inhibitory effects of 5F on Ehrlich Ascites
carcinoma were observed in mice with peritoneal inoculation of the tumor cells;At the same time , the thymus index , liver index and
spleen index were measured.Results:The 5F significantly inhibited the proliferation of SPCA-1 cells and K562 cells in a dose-dependent
in vitro.In the tumor-bearing mice , 5F inhibited the development of S180 tumor and prolonged the survival of Ehrlich Ascites carcinoma-
bearing mice.Conclusions:5F possesses antitumor effects both in vitro and in vivo.
　　Key words:pteris semipinnata L.　terpenoid　MTT method　SPCA-1　K562　mice transplantation tumor
　　半边旗 (Pteris semipininnata L, PsL)属凤尾蕨科植物 , 广
泛分布于南方各省 , 民间常用于治疗蛇伤 、 外伤出血 、 菌痢 、
肠炎 、 肝炎等[ 1] 。本课题组在筛选抗肿瘤植物药时发现 , 半
边旗的乙醇及水提取物显示良好的体内外抗肿瘤活性[ 2 , 3] ,
随后从醇提物中分离纯化得到 5 个成分:4F、 5F、 6F、 A 及
B。经结构鉴定 , B是一个倍半萜类化合物 , 其余 4 个均为二
萜类化合物[ 4] 。经体外研究证明 5F、 6F、 A 有抗肿瘤活性 ,
而 4F、 B 无此作用[ 5 ～ 8] 。本文旨在用体外 、 体内研究方法观
察半边旗提取物 5F抗肿瘤活性及对荷瘤鼠毒性影响 , 为临床
应用打下实验基础。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　半边旗有效成分 5F 原料药　由天然药物研究与开发
实验室邓亦峰老师提供 , 药物为白色结晶 , 其中 5F 含量
46%, 其余为 4F , 药物中不含 6F。
1.1.2　半边旗有效成分的提取　参考张晓[ 4] 、 邓亦峰老师改
进 , 半边旗全草 5kg , 洗净风干 , 以体积分数为 95%的乙醇
回流提取 3次 , 合并提取液 , 减压浓缩至原体积的三分之一 ,
上活性碳柱 , 以 EtOH-CHCl3 (10∶1)洗脱 , 减压浓缩得淡黄
色固体 (120g)。取此固体 10g , 经硅胶柱层析 , 以氯仿-甲醇
系统分段洗脱 , 在 CHCl3-CHCl3OH (90∶2～ 90∶6)洗脱部分分
别得到 6F (99.7mg), B (60mg), 4F (80.7mg), 5F (9.5g)
及 A (200mg)。
1.1.3　动物和瘤株　清洁级昆明种小白鼠 18 ～ 22g , 雌雄各
半 , 购自广东医学院实验动物中心;SPCA-1 , K562 瘤株和肉
瘤 S180、 艾氏腹水癌购自中山医科大学 , 本教研室传代。
1.1.4　试剂　5-FU , 上海旭东海普药业有限公司生产。
1.2　方法
1.2.1　SPCA-1、 K562细胞培养　癌细胞贴壁培养于含 10%灭
活小牛血清 、 100U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素的 RPMI-1640
完全培养基中 , 置 37℃、 5%CO2饱和湿度孵箱内培养。细胞
经 0.25%胰酶分散传代和收获 , 取对数生长期细胞进行实验。
K562 细胞培养同上 , 但不用胰酶消化 , 直接传代和收获 , 取
对数生长期细胞进行实验。
1.2.2　半边旗提取物 5F对 SPCA-1 瘤株的抑瘤作用　SPCA-1
瘤株生长于含体积分数为 10%灭活小牛血清 、 1×105U/L 青
霉素和 100mg/L链霉素的 RPMI-1640 完全培养基中 , 置 37℃、
5%CO2 饱和湿度孵箱内培养[ 9] 。MTT法参照 Hanse 等[ 10] 的方
法。取对数生长期细胞 , 以台盼蓝染色 , 要求活细胞数大于
95%, 以 7×108/ L活细胞数接种于 96孔培养板中 。待其完全
贴壁后 , 更换含不同浓度药物的 1640 完全培养基 100μl/well ,
继续培养 24、 48、 72h 后 , 加入 5mg/LMTT 试剂 20μl/well , 孵
·10· 四　川　中　医Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine 2006 年第 24卷第 2 期Vol.24 , No.2 , 2006　
基金项目:国家自然科学基金资助课题 (编号:39870900)和广东省科委重大科技攻关项目 (编号:9622007002)
育 5h , 吸去培养基 , 加 DMSO 150μl , 待其完全溶解后 , 用酶
标仪测定吸光度 (A)。按公式计算细胞生长抑制率 , 药物半
数抑制浓度 IC50按改良Karber 公式计算。实验重复 3次。
1.2.3　半边旗提取物 5F对 K562 瘤株的抑瘤作用　本试验方
法与上述方法基本相同 , 不同之处在于每孔加入 7×108/L 活
细胞悬液 90μl , 立即加入含不同浓度药物的 PPMI1640 完全培
养基 100μl/well , 加入MTT后不用吸去培养基 , 直接加入 DM-
SO 150μl。实验重复 3 次。
细胞生长抑制率= [ 1-给药组吸光度 (A)] /对照组吸光度
(A) ×100%
1.2.4　荷瘤小鼠模型及抑瘤作用 、 胸腺指数 、 肝脏指数 、 脾
脏指数 、 白细胞数指标观察　小鼠移植瘤接种方法参考现代
药理实验方法[ 11] , 实验之 0d , 取接种于昆明小鼠腹腔内 8 ～
10 天的含瘤细胞腹水制成 1 ～ 2×107/ ml细胞悬液 , 每只小鼠
右腋下皮下接种 0.2ml , 瘤株细胞悬液进行细菌培养。 第 1d
检查瘤细胞培养情况 , 确定无污染后将小鼠随机分组 , 每组
10 只 , 每日小鼠在电子天平 (Acs-3D)上称重后 , 按体重腹
腔每日上午给药一次 , 连续给药 10d。 11d 小鼠称体重 、 处死
动物 、 分离瘤块 、 肝脏 、 脾脏 、 胸腺在电子天平 (JHANG-
PING FA 21.4S)称重。
抑瘤率=(对照组瘤重-用药组瘤重)/对照组瘤重×100%
肝脏指数 、 脾脏指数 、 胸腺指数用该器官重量除以体重。
1.2.5　腹水瘤模型及生命延长作用观察　小鼠移植瘤接种方
法参考现代药理实验方法[ 11] , 实验之 0d , 选择腹腔接种艾氏
腹水癌细胞后 8天的小鼠 , 抽取含瘤腹水 , 用生理盐水配制
成 1.5×107/ml瘤液 , 在无菌条件下于小鼠腹腔接种 0.2ml瘤
细胞悬液 , 瘤细胞悬液做细菌培养。实验第 1d , 检查瘤细胞
培养情况 , 未见污染 , 动物随机分成组。每日腹腔注射给药
一次 , 共 10天。给药结束后停药 , 每日观察记录小鼠一般药
理反应及死亡情况 , 对未见瘤株生长的动物给予剔除。
生命延长率=(用药组生存时间-对照组生存时间)/对照组
生存时间×100%。
2　结　果
表 1　提取物 5F对 SPCA-1瘤株的抑瘤作用
药物 药物浓度(μmol/L)
抑瘤率 (%)
24h 48h 72h
5F 149.7 47.4 75.0 85.3
74.9 32.8 61.7 76.2
37.4 23.6 36.4 69.9
18.7 9.2 16.2 43.0
9.4 0 7.1 28.5
　　IC50 (μmol/ L , x±s) 96.7±14.6 54.2±4.76 25.9±3.46
5-FU 384.6 25.9 61.5 89.0
192.3 23.6 54.3 80.2
96.2 21.8 44.5 60.3
48.1 15.8 39.2 56.3
24.0 15.5 34.0 53.6
　　IC50 (μmol/ L , x±s) 267.1±19.2 107.8±25.2 51.6±11.5
2.1　提取物 5F对 SPCA-1 瘤株的抑瘤作用　药物作用后在相
差显微镜下观察 , 细胞皱缩 , 变圆 , 从培养板上脱落下来 ,
随着时间的延长逐渐发展为细胞膜破裂 , 细胞溶解。表 1 结
果显示提取物 5F 对肿瘤细胞有明显的抑制作用 , 并且呈剂
量 、 时间依赖关系 , 对 SPCA-1 瘤株 24、 48、 7h 的 IC50分别是
100.9、 52.0、 25.5μmol/L。
2.2　提取物 5F对 K562 瘤株的抑瘤作用　药物作用后 , K562
细胞生长受抑制 , 随着时间的延长逐渐发展为细胞膜破裂 ,
细胞溶解。表 2 结果显示 , 提取物 5F 对 K562 细胞的抑瘤作
用随着时间的延长 、 剂量的增加逐渐加强 , 24、 48、 72h 的
IC50分别是 174.1、 30.7、 21.4μmol/L
表 2　提取物 5F对 K562瘤株的抑瘤作用
药物 药物浓度(μmol/ L)
抑瘤率 (%)
24h 48h 72h
5F 149.7 57.0 82.6 91.7
74.9 48.8 76.8 88.3
37.4 35.3 67.6 83.7
18.7 10.3 37.0 51.6
9.4 0 14.3 15.6
　　IC50 (μmol/L , x±s) 174.1±33.4 30.7±10.6 21.4±5.11
5-FU 384.6 17.8 47.8 77.3
192.3 10.5 36.5 68.9
96.2 6.17 32.5 57.6
48.1 3.50 30.5 54.6
24.0 2.54 24.5 47.8
　　IC50 (μmol/L , x±s) 411±59.3 165±50.2 65.4±7.54
2.3　提取物5F对荷瘤小鼠的抑瘤作用　表 3结果显示 , 提取
物 5F对荷瘤小鼠肿瘤生长有抑制作用 , 三个剂量组的 5F溶液
对S180 的抑瘤率分别是 46.6%、 40.7%、 31.5%, 差异有显著
性 (P<0.01)。三个剂量组的 5F 溶液对小鼠的白细胞数没有
影响 , 常用抗肿瘤药物 5-FU 则表现出白细胞降低的效应;高
剂量的 5F溶液小鼠胸腺萎缩 , 体积 、 重量均降低, 差异显著
(P <0.01);三个剂量组的 5F溶液组小鼠脾脏重量增加 , 差异
显著 (P<0.05)。 5F溶液对小鼠肝脏指数没有影响。
表 3　提取物 5F对荷瘤小鼠的抑瘤作用 ( x±s)
组别 剂量(mg/ kg)
初次体重
(g)
末次体重
(g) 瘤重 抑瘤率%
对照组 - 20.3±1.32 27.6±1.65 1.25±0.465 -
5-FU 10 20.6±1.45 25.3±1.43＊＊ 0.617±0.24 50.6＊＊
5F 50 20.9±1.35 27.4±1.56 0.668±0.28 46.6＊＊
5F 25 21.0±1.40 26.8±1.64 0.741±0.23 40.7＊＊
5F 12.5 20.5±1.38 27.5±1.53 0.856±0.27 31.5＊＊
　　注:＊ P<0.05　＊＊ P<0.01 VS control
表 4　提取物 5F对荷瘤小鼠免疫器官及白细胞的影响 ( x±s)
组别 剂量(mg/kg)
白细胞数
(×108/ L)
胸腺指数
(×10-3)
脾脏指数
(×10-3)
肝脏指数
(×10-3)
对照组 - 11.5±2.32 2.96±0.681 5.29±0.900 65.7±8.28
5-FU 10 7.68±2.04＊＊1.85±0.565＊＊3.83±0.695＊＊ 61.3±9.51
5F 50 11.5±3.20 1.80±0.823＊＊ 6.45±1.64＊ 72.0±7.93
5F 25 12.4±2.56 2.42±0.834 6.12±1.51＊ 74.7±9.01
5F 12.5 10.5±3.15 2.74±0.473 6.67±1.51＊ 70.0±8.23
　　注:＊ P<0.05　＊＊ P<0.01 VS control
2.4　提取物 5F对荷艾氏腹水癌小鼠生命延长作用　表 5 显
示结果显示 , 提取物 5F对荷艾氏腹水癌的小鼠生命有延长作
·11·2006年第 24卷第 2期Vol.24 ,No.2 ,2006 四　川　中　医Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine
用 , 三个剂量组的 5F溶液对荷艾氏腹水癌小鼠的生命延长率
是 72.6%、 34.8%、 17.0%, 差异有显著性。
表 5　提取物 5F 对荷艾氏腹水癌小鼠的生命延长作用
组别 剂量 (mg/ kg) 生存时间 (d, x±s) 生命延长率%
对照组 - 13.5±1.60 -
5-FU 10 28.1±6.83 108.1＊＊
5F 50 23.3±8.65 72.6＊＊
5F 25 18.2±3.40 34.8＊
5F 12.5 15.8±1.49 17.0＊
　　注:＊P<0.05　＊＊ P<0.01 VS control
3　讨　论
　　单味中药的化学成分 , 特别是有效成分的研究是研究复
方有效成分和开发新药的基础 , 迄今为止人们已对中药进行
大量的化学研究 , 并从单味的中药中分离得到大量的化合物 ,
其中不少应用于临床。如青蒿素治疗疟疾 , 雷公藤皂甙治疗
自身免疫性疾病 , 紫杉醇治疗癌症等。半边旗为民间常用的
草药 , 常用于治疗蛇伤 、 外伤出血 、 菌痢 、 肠炎 、 肝炎等。
本课题组在筛选抗肿瘤植物药时发现半边旗的乙醇及水提物
显示良好的体内外抗肿瘤活性。为发掘其中的有效成分 , 对
其水提物和醇提物进行进一步的分离提纯 , 从醇提物中分离
纯化得到 5个成分:4F、 5F 、 6F、 A及 B , 经结构鉴定 , B 是
一个倍半萜类化合物 , 其余 4 个均为二萜类化合物。本试验
所提到的 5F 含量是 46%, 由于是动物试验 , 需要的药量较
多 , 因此未进一步提纯。提取物中 5F含量最多 , 体外试验抗
肿瘤活性较强 , 为较理想的目标化合物。
　　首先进行体外试验 , 抗肿瘤药物的筛选方法中 , 我们选
择了四氮唑蓝法 [ MTT法] 。1983年由 Mosmann 在免疫学研究
中应用于鼠淋巴细胞系研究 IL-2 等细胞因于对细胞存活和增
效的影响 , 而建立 MTT 方法[ 12] , 随后 , Denizot 和 carmichael
等作了进一步改进并获得更好的效果 , 使之运用于人类肿瘤
细胞体外药敏试验[ 13 , 14] 。本研究采用标准抗肿瘤药物 5-FU
对K562 瘤株实验结果与文献[ 15]报道结果一致 , 符合检验要
求 , 因此本试验的方法可行 、 实验结果可靠。
　　从体外试验中我们观察到提取物 5F 有较强的抗肿瘤活
性 , 并且成剂量 、 时间依赖关系 , 药物作用 24 小时后即表现
出明显的抑瘤作用 , 48 小时和 72 小时抑瘤作用明显 , 与阳性
药5-FU相比 , 提取物 5F量效曲线陡直 , 而阳性药 5-FU量效
曲线则较平缓 , 反应出两药的不同特点 , 提取物 5F最低药效
浓度大于 5-FU的最低有效浓度 , 但高药物浓度时提取物 5F
的抑瘤率较 5-FU 高 , 提取物 5F 在 24、 48、 72 小时的 IC50均
小于阳性药 5-FU , 表明提取物 5F 在体外有较强的抗肿瘤活
性。
　　从癌细胞体外培养实验中 , 可得出提取物 5F具有抑制和
杀伤体外培养的癌细胞作用。但在体外实验中对癌细胞有抑
制和杀伤作用的药物 , 在活体中由于各种综合因素的作用不
一定具有抗肿瘤作用。为此进行了腹水型小白鼠生存时间和
荷瘤小白鼠瘤体生长抑制实验。在荷瘤 S180小白鼠瘤体生长
抑制实验中 , 观察到对照组肿瘤重大于 1.0g , 阳性对照药 5-
FU抑瘤作用为 50.6%, 因此动物模型可靠 , 用药组较对照组
瘤体重量轻 , 表明提取物 5F同样具有体内抗肿瘤活性。在腹
水型小白鼠生存时间实验中 , 用药组比对照组小白鼠平均生
存时间延长 , 表明提取物 5F能够抑制腹腔内小白鼠肿瘤细胞
的生长。试验中我们观察到在有效的剂量下提取物 5F对小鼠
的进食 、 活动 、 体重影响较小 , 而阳性对照组 5-FU对小鼠的
进食 、 活动影响较大 , 体重也有明显降低。常用抗肿瘤药物
临床应用中常常会引起患者白细胞降低的副作用 , 严重的病
例不得不停药 , 本试验中小鼠在使用 5-FU 后体重降低的同
时 , 白细胞数也有明显的降低。而提取物 5F在治疗剂量下 ,
对白细胞数没有影响 , 为该药的一个显著特点 , 这一特点对
其开发成临床用药非常有利。同时我们也观察到有效剂量下
提取物 5F对鼠的胸腺有抑制作用 , 用药后小鼠胸腺明显萎
缩 , 而脾脏重量则轻度增加。
　　综上所述 , 半边旗提取物 5F 体外 、 体内均有抗肿瘤作
用 , 有效剂量下对荷瘤小鼠体重 、 白细胞数影响较小 , 具有
开发成新药的价值。
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