全 文 ：猫人参注射液抗肝癌作用和对免疫功能的影响
　　万旭英　张　晨　凌昌全　李　柏
第二军医大学长海医院　上海　200433
　　摘要　目的:初步探讨猫人参注射液抗动物移植性肝癌及其对荷瘤小鼠免疫功能的影响。方法:体内抗肿瘤实验采用液下
接种肿瘤细胞及实体瘤称重的方法 ,腹腔接种肿瘤液观察荷瘤动物存活率 ,采用3H-TdR掺入法检测猫人参注射液对荷瘤小鼠
脾 T淋巴细胞转化功能和 NK 细胞活性的影响;流式细胞仪检测荷瘤小鼠 T 细胞亚群。结果:猫人参注射液 100g/kg、50g/ kg、
25g/kg 连续尾静脉注静 10 天后 ,对小鼠皮下移植性 H22肝癌的抑瘤率分别为 62.16%、35.14%、17.13%,有较明显的剂量依赖性
(P>0.05)。剂量为 100g/ kg时抗肿瘤作用较理想 , 且可延长腹水型肝癌小鼠的生存期 , 对H22肝癌小鼠脾脏(胸腺)指数 、脾淋巴
细胞转化指数 、T 细胞 CD4+/CD8+比值有升高趋势 ,略高于生理盐水组(P <0.05), CTX 对荷瘤小鼠细胞免疫功能则有明显的抑
制作用(P >0.05)。结论:猫人参注射液具有良好的抗肝癌作用。
关键词　猫人参　肝癌　小鼠移植性肿瘤　细胞免疫
Anti-hepatocarcinoma Activity and Immunopharmacological Effects of Maorenshen Injection Wan Xuying , Zhang
Cheng ,Ling Changquan , et al Changhai Hospital of Second Military Medical University , Shanghai(200433)
Objective:To investigate preliminary antitumor activity of Maorenshen injection , a Chinese folk medicine prescription ,
on transplanted liver cancer from animal , and observe the effect of immune function on tumor-bearing mice.Methods:Antitu-
mor activities were assayed by weighing tumor and the survival period of mice bearing tumor ,Splenocyte proliferation in-
duced by ConA and the activity of NK cells were measured by 3HTdR incorporation.T cell subsets was measured by flow cy-
tometry.Result:The comparison analysis revealed that under the doses of 100 ,50 and 25g/kg , i.v.,bid X10d , the average
tumor inhibitory rates to mice tumor H22 were 62.16%,35.14%,17.13%, respectively.The present studies confirmed the
potent dose-dependent antitumor activity against liver cancer cell in vivo.It showed significant antitumor effect compared
with control group under the doses of up to 100g/kg(P<0.05)and prolonged the survival days of mice-bearing hepatic
cancer H22 with abdominal administration.Meanwhile ,Maorenshen injection did not significantly inhibit cellular immunity.
Spleen(thymus gland)index , splenocyte proliferation induced by ConA and CD4+/CD8+ T cell had a tend to increase
compared with control group(P<0.05), and on the contrary ,CTX exhibited pronounced inhibition.Conclusion:Maoren-
shen injection had significant antitumor effects and did not significantly inhibit cell-mediate immunity.It was a promising
new anticancer drug candidate for further research.
Key words　Maorenshen , live cancer ,mice transplanted tumor , immunoregulatory
　　猫人参为地方性草药 ,是猕猴桃科植物对萼猕
猴桃(镊合猕猴桃)(Actinidia valvala dunn)的根 ,味
苦 、涩 、性寒 。归肺 、胃经。具有清热解毒 、消肿疖 、
祛风除湿的功效 ,主要用于骨髓炎 、疮疡脓肿 、风湿
痹痛 、肝硬化黄疸腹水 、麻风病等[ 1 ,2] 。猫人参的成
分和药理作用目前尚不清楚。至于单味猫人参的抗
肿瘤作用 ,国内外文献未见报道。我们多年来用猫
人参为主的方药治疗以肝癌为主的各种消化道肿
瘤 ,临床疗效明显 ,初步观察表明其具有提高病人生
存质量及延长生存期的功效 ,为了进一步发掘整理
和推广应用民间草药 ,规范临床用药 ,在临床治疗肝
癌有效的基础上 ,对猫人参的有效部位进行分离 、提
纯制成猫人参注射液 ,以荷肝癌(H22)为模型 ,研究其
体内抗肝癌活性和对细胞免疫功能的影响。
1　材料和方法
1.1　实验材料
1.1.1　动物与瘤株　Ⅱ级(清洁级)昆明种小鼠 ,雌
雄各半 ,体重(18g±2g),由上海医科大学动物实验中
心提供 ,动物的合格证:SCXK沪 2002-0002(Ⅱ级小
鼠)。实验动物环境合格证号:医动字第 02-65 号
(清洁级鼠)。H22小鼠肝癌细胞株由中科院细胞所引
进并由中医科实验室保存;YAC-1细胞(NK杀伤靶
细胞):由第二军医大学免疫学教研室提供。
1.1.2　药物与试剂　猫人参注射液:原药材购自上
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实
验
研
究
DOI :10.16466/j.issn1005-5509.2004.04.038
海医药材公司 ,经第二军医大学药学院生药教研室
鉴定为正品 ,是猕猴桃科植物对萼猕猴桃(镊合猕猴
桃)(Actinidia valvala dunn)的根 ,由长海医院药学部
制剂室 ,经一定工艺制成猫人参注射液 ,为棕黄色澄
明液体 ,含生药 5g/ml(浓度:500%),批号:021216;环
磷酰胺粉剂(CTX):上海华联制药有限公司生产 ,规
格:200mg/瓶 ,批号:010701;生理盐水注射液:上海长
海医院药学部生产 , 100ml ,批号:021023;刀豆蛋白
(ConA):上海华舜生物工程有限公司提供;3HTdR:上
海原子核研究所提供;闪烁液:含 0.8%PPO 和
0.06%POPOP 二甲苯溶液 ,水溶性配法;RPMI-1640
培养基:美国 Gibco 公司产;小牛血清:杭州四季青生
物工程公司产;大鼠抗小鼠 T 细胞表面标记单克隆
抗体:由长海医院中心实验室提供 。抗 Thy1.2
(CD3),抗 L3T4(CD4)和抗 Lyt2(CD8)分别检测小鼠总
T细胞 ,T 辅助细胞(Th),及 T 抑制细胞Ts;淋巴细胞
分离液:上海华精生物有限公司 。
1.1.3　仪器设备:电子天平称 ,49型玻璃纤维滤膜 ,
TRI-CARB 460 CD LIQUID SCINTILLATION SYSTEM β
液闪仪 ,FACScan流式细胞仪 , DYQ-II 型细胞收集
仪 ,游示卡尺 ,电子天平称。
1.2　实验方法
1.2.1　猫人参注射液对移植性肝癌的治疗作用　按
照:中医药管理局《中药新药研究指南》和《抗癌药物
研究与实验技术》中“抗肿瘤药物药效学指导原则”
规程进行实验。设阴性对照组 ,阳性对照组和猫人
参注射液 3个不同剂量组 ,按文献[ 3]制备移植性肝
癌模型小鼠接种肿瘤后随机分组。每组 10只小鼠 ,
次日给药 ,每天尾静脉注射 2次 ,连用 10天 。生理盐
水组:尾静脉注射等容积生理盐水注射液:CTX组:
尾静脉注射 CTX30mg/kg ,隔日 1次 ,连用 3次;猫人
参组Ⅰ :尾静脉注射猫人参注射液 100g/kg;猫人参
组Ⅱ:尾静脉注射猫人参注射液 50g/kg;猫人参组
Ⅲ:尾静脉注射猫人参注射液 25g/kg 。
实体型肝癌小鼠末次给药后次日处死动物 ,解
剖并完整分离肿瘤 , 称瘤重量 , 计算肿瘤抑制率
(IR);腹水型肝癌小鼠逐日观察并记录小鼠的死亡
情况 ,观察小鼠生生存期 ,计算生命延长率(%)。以
上实验重复 3次。
1.2.2　免疫器官指数的测定　实验同前 。将H22实
体型肝小鼠于接种后次日随机分为 5组 ,每组 10只 ,
用药 10天后 ,颈椎脱臼处死 ,剥取小鼠胸腺 、脾脏并
称重。计算脾脏(胸腺)指数:脾脏(胸腺)指数=脾
脏(胸腺)重(mg)/体重(g)。
1.2.3　小鼠脾 T 淋巴细胞转化功能测定　常规用
10%NBS-RPMI-1640培养液制备 4×106脾淋巴细
胞悬液 ,每组随机取 4个脾细胞标本 ,每个标本设 3
个复孔 ,将小鼠脾淋巴细胞悬液接种96孔板 ,每孔加
入100μl小鼠脾淋巴细胞悬液(细胞的终浓度为 5×
105/孔), 设空白对照(不加 ConA), 加入 55μg/ml-
ConA20μl/孔(终浓度为 5mg/L),置 37℃,5%CO2培养
箱内培养 48h后加 3HTdR0.5uCi/孔 ,继续培养 6h ,用
细胞收集仪收集细胞于 49型玻璃纤维滤纸上 ,洗涤
后 ,烤干 ,加入液闪液 ,液闪烁仪检测 cpm ,计算刺激
指数(stimulation Index ,SI)。刺激指数(SI)=ConA 刺
激管 cpmf均值/对照管 cpm均值。
1.2.4　小鼠 T细胞亚群检测　流式细胞术分析　每
组随机取 4个脾细胞标本 ,取小鼠脾淋巴细胞悬液
约1×106/ml ,分别加入荧光标记的 CD+3 ,CD+4 , CD+8
单抗各 100μl ,放 4 度温箱内 5min;用 Hands液洗二
次 ,2000r/min离心细胞 4min;用流式细胞仪检测:每
个样品收集 104 个细胞 ,用 Celifit软件分析;在荧光
直方图上分别计算出 CD+3 ,CD+4 ,CD+8 的阳性峰的百
分率 。
1.2.5　自然杀伤细胞(NK细胞)活性的检测　效应
细胞与靶细胞 50∶1 ,二种细胞悬液分别取 100μl加到
96孔板中 ,同时设对照空(只加标记的 YAC -1 细
胞),在 37℃,5%CO2培养箱内培养 24h ,收集细胞于
玻璃纤维滤纸上 ,烤干 ,加入液闪液 ,液闪泺仪检测
cpm ,并与对照组比较 ,NK细胞活性用特异性抑制率
pi表示。pi(%)=(1-实验值 cpm 值/靶细胞自然掺
入 cpm)×100%。
1.2.6　疗效评价　实体瘤疗效以肿瘤生长抑制率表
示 ,按下列公式计算肿瘤生长抑制率。
肿瘤抑制率(IR)=(对照组平均瘤重-治疗组平均
瘤重)/对照组平均瘤重×100%。
腹水型疗效评价以生命延长率表示
生命延长率(ILS)=(实验组平均存活天数/对照组平
均存活天数-1)×100%
1.2.7　统计方法　数据用 x±s表示 ,多样本比较用
单因素方差分析 ,两两比较采用Newman-Keuls检验。
2　结果
2.1　猫人参注射液对小鼠皮下移植性肝癌的抑制作用
荷瘤小鼠经猫人参注射液治疗后 ,在体重均无明显
的影响下 ,在50 ～ 100g/kg 剂量内 ,猫人参注射液对小鼠
肝癌H22均有一定的抑制作用 ,抑瘤率达 30%以上 ,且有
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　　浙江中医学院学报 2004年 7月第 28卷第 4期
万旭英,等:　猫人参注射液抗肝癌作用和对免疫功能的影响
较明显的剂量依赖性 ,随着剂量的增加 ,作用增强 ,给药
剂量为100g/kg时 ,抑制率达到 50%以上(P<0.05),接
近于CTX组(P<0.05)。(见表1)。
表 1　猫人参注射液对小鼠 H22移植性肝癌的作用(x±s)
组　别 剂量(g·kg-1)
动物数(n) 动物体重(g)
始/末 治疗前 治疗后 平均瘤重(g) 平均抑瘤率(%)
猫人参组Ⅰ 　100 30/ 28 20.12±2.77 31.15±5.02 　0.79±0.46■ 　　62.16
猫人参组Ⅱ 　　50 20/ 19 18.49±1.43 30.52±4.05 　1.20±0.49＊ 　　35.14
猫人参组Ⅲ 　　25 20/ 19 17.98±1.49 30.17±4.54 　1.53±0.81 　　17.30
生理盐水组 　　0.2★ 30/ 25 19.33±2.07 33.95±3.65 　1.85±1.42 　　　0
CTX组 　　0.03 30/ 25 19.57±2.53 30.71±4.37 　0.80±0.53■ 　　56.76
　　与生理盐水组、猫人参组Ⅲ比较 , ■P<0.01;与 CTX组、猫人参组Ⅱ比较, ■P>0.05;与猫人参组 Ⅲ比较 , ■P<0.05;生理盐水组比较 , ＊P<
0.05;★生理盐水组为 0.2ml/ 10g。
2.2　猫人参注射液对腹水型肝癌 H22小鼠生存期的
影响
猫人参组 Ⅰ腹水型肝癌癌 H22小鼠的生存期提
高 ,生命延长率为 19.90%,与阳性对照组比较接近 ,
猫人参组 Ⅱ 、Ⅲ对荷瘤小鼠的生存期作用不明显 ,提
示100g/kg 剂量的猫人参注射液可延长腹水型肝癌
H22小鼠的生存期。(见表2)
表 2　猫人参注射液对腹水型肝癌 H22小鼠生存期的影响(x±s)
分组 剂量(g·kg-1) 动物数(n) 平均生存期(天) 平均生命延长率(%)
猫人参组Ⅰ 　　　100 30 　　　13.43±0.67△ 　　　　　19.90
猫人参组Ⅱ 　　　50 30 　　　12.80±0.28 　　　　　13.40
猫人参组Ⅲ 　　　25 30 　　　11.55±0.64 　　　　　　2.18
生理盐水组 　　　　0.2★ 30 　　　11.20±0.35
CTX组 　　　　0.03 30 　　　13.50±1.61★ 　　　　　20.53
　　与生理盐水组比较 , △P<0.05 ,★注:生理盐水组为0.2mk/ 10g。
2.3　猫人参注射液对小鼠免疫器官指数的影响
猫人参注射液使小鼠肝癌 H22脾脏(胸腺)指数
有升高趋势 ,但无统计学意义(P >0.05)。CTX组脾
脏(胸腺)指数下降明显 ,与生理盐水组比较有统计
学意义(P<0.05)。见表 3。
表 3　猫人参注射液对小鼠脾(胸腺)指数(x±s)
肿瘤类型 组别 剂量(g·kg-1) 　　动物数(n)　　始/末 脾指数(g/100g) 胸腺指数(g/ 100g)
H22 猫人参组Ⅰ 　　100 20/18 　　0.92　±0.29■ 　　0.394±0.146■
H22 猫人参组Ⅱ 　　500 20/19 　　1.093±0.35 　　0.335±0.084
H22 猫人参组Ⅲ 　　　25 20/19 　　1.096±0.26 　　0.391±0.147
H22 生理盐水组 　　　0.2★ 20/17 　　0.89　±0.26 　　0.294±0.108
H22 CTX 组 　　　0.03 20/18 　　0.65　±0.18△ 　　0.195±0.059△
　　与生理盐水组比较 , ■P>0.05;与生理盐水组比较 , △P<0.05
2.4　猫人参注射液对荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化功能
的影响
剂量为 100g/kg 的猫人参注射液略有促进荷瘤
小鼠脾淋巴细胞转化作用 ,而 CTX组有抑制作用 ,两
组均无显著性 ,说明剂量为 100g/kg 猫人参注射液对
T淋巴细胞转化指数无明显的影响(见图 3)。
图 3 抑癌注射液对脾淋巴细胞转化功能的影响
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万旭英,等:　猫人参注射液抗肝癌作用和对免疫功能的影响
2.5　猫人参注射液对荷瘤小鼠 T细胞亚群的影响
由表 4中看出 ,猫人参组小鼠的 CD33 、CD+8 细胞
及 CD+4 /CD+8 的比值与生理盐水组相比略有升高 ,但
未达到显著的水平(P >0.05), 而 CTX 组的 CD+4/
CD+8 的比值明显低于生理盐水组(P<0.05),说明猫
人参注射液对 T 细胞无抑制作用 ,而 CTX则有明显
的抑制作用(见表 4)。
表 4　猫人参注射液对 T细胞亚群的影响(x ±s)
分组 n CD4 CD8 CD3 CD4/ CD8
猫人参组 4 21.75±0.92 3.62±1.51 25.37±2.41 　　6.82±2.60
CTX组 4 17.36±3.41 4.96±1.57 22.31±3.78 　　3.76±1.27■
生理盐水组 4 19.65±3.75 3.58±0.25 22.75±3.74 　　6.48±1.37△
　　与生理盐水组比较 , △P>0.05;与生理盐水组比较 , ■P<0.05 ,
2.6　猫人参注射液对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响
猫人参注射液对荷瘤小鼠脾 NK细胞杀伤活性
下降不明显 ,接近与生理盐水组(P >0.05);CTX组
小鼠脾 NK细胞杀伤活性明是下降(P <0.05)。(见
图 4)
与生理盐水比较 , ＊P<0.05
图 4　猫人参对荷瘤小鼠 NK细胞活性的影响
3　讨论
肝癌属中医“肝积” 、“ 积” 、“臌胀”等范畴 ,肝
癌形成的原因之一 ,是六淫邪毒入侵 ,邪凝毒结 ,日
久成积。清热解毒法是治疗肝癌的治则之一 ,清热
解毒中药在临床治疗中晚期肝癌中发挥着非常重要
的作用 ,属于中医治则的攻邪法 ,猫人参具有的清热
解毒作用 ,我们从祛邪的角度 ,研究了猫人参注射液
对小鼠移植性肝癌 H22的抗肿瘤作用。实验结果表
明:荷瘤小鼠经猫人参注射液治疗后 ,在体重均无明
显的影响下 ,在 50 ～ 100g/kg 剂量内 ,猫人参注射液
对小鼠肝癌 H22均有一定的抑制作用 ,抑瘤率达 30%
以上 ,且有较明显的剂量依赖性 ,随着剂量的增加 ,
作用增强 ,给药剂量为 100g/kg时 ,抑制率达到 50%
以上(P<0.05),且可延长生存期接近于 CTX 组(P
>0.05)。鉴于我国抗癌药物筛选疗效评价标准中规
定药物抑瘤为 30%以上认为有意义 ,因而猫人参的
抗肿瘤作用是肯定的。
大量的研究表明[ 4] ,中草药具有免疫调节作用 ,
猫人参在发挥抗肿瘤作用的同时对细胞免疫功能是
否有影响尚未见有报道 ,目前文献报道较多的是猫
人参的近缘种。本实验选用几个常用的免疫检测指
标 ,初步探讨了 100g/kg剂量的猫人参对荷瘤小鼠细
胞免疫的影响 。实验结果显示:猫人参注射液对 H22
肝癌小鼠脾脏(胸腺)指数 、荷瘤小鼠脾淋巴细胞转
化指数 、CD3+、CD4+ 、CD4+/CD8+的比值有升高的趋
势 ,略高于生理盐水组 ,但无统计学意义(P>0.05),
NK细胞杀伤活性无明显的下降 ,接近于生理盐水组
(P >0.05)。CTX组以上指标均下降 ,差异有统计学
意义(P <0.05)。CTX作为化疗药物中的烷化剂 ,是
细胞毒类药物 ,有较强的免疫抑制作用 ,可以抑制细
胞免疫和体液免疫 ,故其在发挥强有力的抗肿瘤作
用的同时 ,毒副作用亦十分显著[ 5] 。猫人参在发挥
抗肿瘤作用的同时对细胞免疫功能无抑制作用。
本实验仅从细胞免疫的常用指标观察了剂量为
100g/kg 的猫人参注射液对荷瘤小鼠免疫功能的影
响 ,对其它免疫功能是否有影响及小剂量猫人参是
否对免疫功能有影响 ,均有待进一步研究。
参考文献
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册).上海科学技术出版社 , 1999.546
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江中医学院学报 , 2002 , 26(1):77 ～ 78
[ 3] 　徐叔云主编 , 药理实验方法学 , 第二版 , 北京:人民卫生
出版社.1991.428
[ 4] 　朱德志 , 郑显明.中药多糖抗肿瘤研究进展.中草药 ,
1999 , 20(1):38～ 41
[ 5] 　周宏灏主编.分子药理学.黑龙江科学技术出版社.
1999.57
(收稿日期:2004-3-26)
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　　浙江中医学院学报 2004年 7月第 28卷第 4期
万旭英,等:　猫人参注射液抗肝癌作用和对免疫功能的影响