全 文 ：半边旗有效成分 5F注射液体内外抗肿瘤药理作用研究＊
戴　滨　崔　燎　吴　铁　汤　南　梁念慈　邓亦峰
(广东医学院药理学教研室·广东天然药物研究与开发实验室 ,湛江　524023)
2002 11 12收稿 , 2003 01 04修回
＊国家自然科学基金资助课题(No 39870900)和广东省科委重大科
技攻关项目(No 9622007002)
作者简介:戴　滨 ,男 , 35岁 , 硕士生 , 主治医师。研究方向:抗肿瘤
药理学。 Tel:0759-2388405 , E-mail:daibinsanmei @ vip.
sina.com.cn;
崔　燎 ,女 , 40岁 ,副教授 ,硕士生导师。研究方向:骨药
理学和抗肿瘤药理学;
梁念慈 ,男 , 61岁 ,教授 ,博士生导师。 研究方向:生化药
理学
中国图书分类号　R 979.9;R 287;R 730.52
文献标识码　A　文章编号　1001-1978(2003)05-0508-04
摘要　目的　观察半边旗有效成分 5F注射液体外体内抗瘤
活性 、急性毒性作用及其对免疫器官的影响。方法　用
M TT 法观察 5F注射液对 SPCA-1 , K562 瘤株的体外抗肿瘤
作用;采用荷瘤小鼠瘤重 、抑瘤率检测 5F 注射液对小鼠移植
性肿瘤 S180 、HepA肝癌的抑制作用;通过检测 LD50、胸腺指
数 、肝脏指数 、脾脏指数 、白细胞数等指标观察 5F 注射液的
急性毒性及对其免疫器官的影响。结果　5F 注射液对 SP-
CA-1 , K562 瘤株有显著的体外抗肿瘤作用;对荷瘤小鼠肝癌
HepA、S180 在体内也有抗肿瘤活性 , 5F 注射液的半数致死
量(LD50)为 414.4 mg·kg-1。结论　5F 注射液具有一定的
体内体外抗肿瘤活性 ,同时对免疫功能有一定抑制作用。
关键词　半边旗;二萜类化合物;MT T 法;K562;SPCA-1;小
鼠移植性肿瘤
　　半边旗(Pteris semipinnata L ,PS)属凤尾蕨科植
物 ,广泛分布于南方各省 ,民间常用于治疗蛇伤 、外
伤出血 、菌痢 、肠炎 、肝炎等 。本课题组在筛选抗肿
瘤植物药时发现 ,半边旗的乙醇及水提取物显示良
好的体内外抗肿瘤活性[ 3 , 4] ,进一步从醇提物中分
离纯化后得到 5个成分:4F 、5F 、6F 、A 及 B ,经结构
鉴定 ,B是一个倍半萜类化合物 。其余 4 个均为二
萜类化合物[ 4] 。经以前研究证明 5F 、6F 、A 有抗肿
瘤活性 ,而 4F 、B无此作用[ 5 ～ 8] 。由于 5F 在植物中
含量最高 ,抗肿瘤作用较强。我们将 5F 按一定工
艺制成注射液 ,经鉴定该注射液化学性质稳定 ,可以
长期保存。本文旨在用体外 、体内研究方法观察 5F
注射液的急性毒性作用 、抗肿瘤活性及对荷瘤鼠免
疫器官的影响。为临床应用打下实验基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试验药物　5F 由广东天然药物研究与开发
实验室植化室分离纯化 ,结构经 UV , IR ,MS ,及1H-
NMR , 13C-NMR ,尤其是二维 NMR[ 1H-1H 二维相
关谱(1H-1HCOSY)、1H-13C-COSY] 、远程偶联相关
(化学位移)谱(COLOC)及核的 Overhauser 效应光
谱学(NOESY)确认 。5F 含量 44%。注射液制剂工
艺由本课题组制剂室完成 ,细胞培养给药用注射液
浓度为 50 g·L-1 , 临用前用 RPM I 1640培养基稀
释成各所需的浓度 。动物给药的配制:动物腹腔注
射时用生理盐水稀释至所需的浓度。
1.1.2　动物及瘤株　SPCA-1 , K562 由广东医学院
生化研究所提供 ,小鼠肝癌 HepA 、S180瘤株由中山
医科大学肿瘤研究所提供 ,细胞在 RPM I 1640 培养
基(Gibco)、含体积分数为 10%灭活小牛血清和青 1
×105 U·L -1 、链霉素 100 g·L-1的 5%CO2 孵箱中
培养传代。试验所用昆明种小鼠由广东医学院动物
中心提供。
1.1.3　试剂　RPM I 1640培养基(不含酚红)Gibco
公司 ,新生小牛血清购于杭州四季青生物材料公司;
5-FU为上海旭东海普药业有限公司产品。
1.2　方法
1.2.1　5F 注射液急性毒性观察
1.2.1.1　5F 注射液的 LD50测定　参照药理实验
方法学[ 1]分为预试验和正式试验 ,预试验找到大致
剂量范围后 ,进行正式试验。正式实验将小鼠随机
分成 6组 ,每组 10只。 ♂♀各半 ,药物浓度按等比
递增 ,分别为:96.04 、137.2 、196 、280 、400 、570 mg·
kg
-1 ,一次性腹腔注射给药 ,给药后立即观察动物
反应情况 。在 24 h 内多次观察 ,以后每天观察 1次
以上 ,连续观察7 d。记录动物毒性反应情况和死亡
动物分布 ,死亡动物及时进行尸检 ,记录病情变化。
具体指标参照药理实验方法学要求 ,结果用 Bliss统
计方法计算 LD50值 。
1.2.1.2　5F 注射剂对荷瘤小鼠的白细胞数 、免疫
器官指数的影响　d 0 动物接种 S 180瘤株 , d 1开
始给药 ,连续给药 10 d , d 11 处死动物 ,取血计数白
细胞 ,准确称量动物体重 、肝重 、脾重 、胸腺重量 ,按
·508· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2003 May;19(5):508 ～ 11
公式:
脏器指数=脏器重量/体重
计算肝脏指数 、脾脏指数 、胸腺指数 。
1.2.2　5F 注射液体外抑瘤作用观察
1.2.2.1　5F 注射液对 SPCA-1 瘤株的抑瘤作用　
SPCA-1瘤株生长于含体积分数为 10%灭活小牛血
清 、1×105 U·L-1青霉素和 100 mg·L-1链霉素的
RPM I 1640完全培养基中 ,置 37 ℃、5%CO2 饱和
湿度孵箱内培养[ 2] 。MTT 法参照 Hanse 等[ 9] 的方
法。取对数生长期细胞 ,以台盼蓝染色 ,要求活细胞
数大于 95%,以 7×108·L-1活细胞数接种于 96 孔
培养板中。待其完全贴壁后 ,更换含不同浓度药物
的1640完全培养基 100μl·well-1 ,继续培养 24 、48
、72 h后 ,加 5 mg·L-1 MTT 试剂 20 μl·well-1 ,孵
育5 h ,吸去培养基 ,加 DMSO 150 μl ,待其完全溶解
后 ,用酶标仪测定吸光度(A)。按公式计算细胞生
长抑制率 ,药物半数抑制浓度 IC50按改良 Karber 公
式计算。实验重复 3次。
细胞生长抑制率=〔1-给药组吸光度(A)对照组吸光度(A)〕×100%
1.2.2.2　5F 注射液对 K562 瘤株的抑瘤作用　本
试验方法与上述方法基本相同 ,不同之处在于每孔
加入 7×108·L-1活细胞悬液 90μl ,立即加入含不同
浓度药物的 RPM I 1640 完全培养基 10 μl·well-1 ,
加入MT T 后不用吸去培养基 ,直接加入DMSO 150
μl。实验重复 3次。
1.2.3　5F 注射液对小鼠移植瘤的抑瘤作用观察
1.2.3.1　5F 注射液对 HepA 肝癌的抑瘤作用　取
接种 8 d的 HepA瘤株制成 1×107·L -1细胞悬液 ,
每只小鼠腋下接种 0.2 ml。24 h 后将小鼠随机分
成 6组 ,每组 10只 ,每日小鼠称重后 ,按体重腹腔给
药1 次 ,连续给药 10 d。同时设 5-FU , 溶剂空白
组 ,10 d后小鼠称重 、处死 、取瘤块 、肝脏 、脾脏 、胸
腺称重 ,取血液计数白细胞数 。
1.2.3.2　5F 注射液对 S 180 的抑瘤作用　方法同
上 ,每只接种 S180瘤细胞 2×106·L -1 。
2　结果
2.1　急性毒性作用
2.1.1　LD50测定结果　小鼠腹腔给药后立即出现
兴奋 、活动增多 、呼吸加快 , 400mg·kg-1 、570 mg·
kg-1组动物出现缓慢抽搐 ,570 mg·kg -1组 3只小
鼠口腔有出血 ,2 h 后所有动物转入抑制状态 ,活动
减少 ,嗜睡 ,呼吸减慢。24 h内 570 mg·kg-1组动物
有 8只死亡 。400 mg·kg -1组有 2只死亡 。其余死
亡的动物均发生在 48 h 内。死亡动物解剖 ,除 3只
动物胃内有少量血液外 ,其余动物大体标本未见明
显异常。死亡动物分布见 Tab 1 , 5F 注射液半数致
死量为 414.4 mg·kg-1 。
Tab 1　Acute toxici ty effcts of pareenteral solution 5F(LD50)
Animal
Drug/mg·kg -1
96.04 137.2 196 280 400 570
LD50
/mg·kg-1
Test number 10 10 10 10 10 10
Death number 0 0 0 1 4 9 414.4
2.1.2　5F 注射剂对白细胞数 、免疫器官指数的影
响　结果见 Tab 2 ,3个剂量组的 5F 注射液对荷瘤
鼠血白细胞数无影响。高剂量时可引起小鼠胸腺指
数减小(P <0.01),与 5-FU 作用相似。3个剂量组
5F 注射液均引起小鼠脾脏指数增加(P <0.05)。3
个剂量组 5 F 注射液的肝脏指数虽然比对照组升
高 ,但无统计学意义(P >0.05)。
2.2　5F注射液的体外抑瘤作用
2.2.1　5F 注射液对 SPCA-1抑瘤作用　药物作用
后在相差显微镜下观察 ,细胞皱缩 ,变圆 ,随着时间
的延长逐渐发展为细胞膜破裂 ,细胞溶解。Tab 3
结果显示 5F 对肿瘤细胞有明显的抑制作用 ,并且
呈剂量 、时间依赖关系 , 对 SPCA-1 瘤株 24 、48 、72
h的 IC50分别是 100.9 、52.0 、 25.5μmol·L -1 。
2.2.2　5F 注射液对 K562 抑瘤作用 　药物作用
后 ,K562细胞生长受抑制 ,随着时间的延长逐渐发
展为细胞膜破裂 ,细胞溶解 。Tab 4结果显示 ,5F 注
射液对 K562细胞 24 、48 、72 h的 IC50分别是 81.4 、
29.6 、 21.2lμmol·L-1 。
2.3　5F注射液对小鼠移植瘤的抑瘤作用
2.3.1　5F 注射液对荷瘤鼠 HepA的抑瘤作用　结
Tab 2　Effects of pareenteral solution 5F on the leucocyte number and the exponent of immune organ( x ±s)
Group
Dose
/mg·kg -1
Leukocyte number
/ ×108·L -1
Thymus exponent
/×10-3
Spleen exponent
/ ×10-3
Liver exponent
/ ×10-3
Con trol 11.50±2.32 2.95±0.681 5.29±0.900 65.7±8.27
5-FU 10 7.68±2.04＊＊ 1.85±0.565＊＊ 3.83±0.695＊＊ 61.3±9.51
5F 100 11.50±3.20 1.80±0.823＊＊ 6.45±1.64＊ 72.0±7.93
50 12.40±2.56 2.42±0.834 6.12±1.51＊ 74.7±9.01
25 10.50±3.15 2.74±0.473 6.67±1.51＊ 70.0±8.23
　　＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs cont rol group by t test
·509·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2003 May;19(5)
Tab 3　Inhibi tory effects of pareenteral solution 5F on SPCA-1 cell
Drug
Concent ration
/μmol·L-1
Inhibitive rate/ %
24 h 48 h 72 h
5F 149.7 47.4 75.0 85.3
74.9 32.8 61.7 76.2
37.4 23.6 36.4 69.9
18.7 9.2 16.2 43.0
9.4 0 7.1 28.5
IC50/μm ol·L -1 96.7±14.57 54.2±4.76 25.9±3.46
5-Fu 384.6 25.9 61.5 89.0
192.3 23.6 54.3 80.2
96.2 21.8 44.5 60.3
48.1 15.8 39.2 56.3
24.0 15.5 34.0 53.9
IC50/μm ol·L -1 267.1±
19.16
107.8±
25.22
51.6±
11.47
　　Average were determined by repeat three t imes
Tab 4　Inhibitory effects of pareenteral solution 5F on K562
Drug
Concent ration
　/μmol·L -1
Inhibitive rate/ %
24 h 48 h 72 h
5F 149.7 57.0 82.6 91.7
74.9 48.8 76.8 88.3
37.4 35.3 67.6 83.7
18.7 10.3 37.0 51.6
9.4 0 14.3 15.6
IC50/μmol·L -1 　　　　　
　
174.1±
33.44 30.7±10.58 21.4±5.11
5-FU 384.6 17.8 47.8 77.3
192.3 10.5 36.5 68.9
96.2 6.17 32.5 57.6
48.1 3.5 30.5 54.6
24.0 2.54 24.5 47.8
IC50/μmol·L -1 　　　　　
　
410.8±
59.28
165.3±
50.22
65.4±
7.54
　　Average were determined by repeat three t imes
果见 Tab 5 , 3个剂量组的 5F 注射液对 HepA 肝癌
的抑瘤率分别达到 27.8%(P <0.05)、45.4%(P <
0.01)、54.5%(P <0.01)。提示 5F 注射液腹腔注
射具有抗肿瘤的活性。
2.3.2　5F 注射液对荷瘤鼠 S180的抑瘤作用　结
果见 Tab 6 ,3个剂量组的 5F 注射液对 S180的抑瘤
率分别为 25.6%(P >0.05)、27.0%(P >0.05)和
31.8%(P >0.05)。
3　讨论
毒性实验结果表明 ,初步观察 5F 注射液的急
性毒性主要表现在中枢神经系统的过度兴奋或抑制
以及出凝血系统毒性。具体机制还有待研究。该药
腹腔注射的 LD50为 414.4 mg·kg-1 ,其有效剂量为
50 mg·kg-1 ,表明该药毒性较小 ,安全范围大 ,作用
缓和 。在荷瘤鼠用药 10 d后 ,表现为用药量较大时
对胸腺有抑制作用 , 3 个剂量组对脾脏均有增大作
用 。与阳性药 5-FU 相比该药没有降低白细胞作
用 。5F 注射液体外试验显示出良好的抗肿瘤作用 ,
抑瘤率呈时间和剂量的关系 ,对 SPCA-1 、K562瘤株
的 IC50均低于 5-FU 。5F 注射液体内仍然具有抗肿
瘤作用。本实验显示 5F 注射液体内抗 HepA 肝癌
的作用强于 S180 ,表明该药抗肿瘤作用有选择性 。
　　关于 5F 抗肿瘤机制研究 ,李金华等[ 10 , 11]研究
曾证明 5F 化合物体外具有抑制肿瘤细胞端粒酶 、
拓扑异构酶活性 。王京滨等[ 12 ～ 14]研究认为 5F 化
合物体外具有抑制 bcl-2 、bax 的表达以及抑制
MAPK的活性。根据文献报道[ 15 ～ 17] ,含α,β 亚甲
基环戊酮结构的化合物可经 Michael加成反应与含
巯基的酶
Tab 5　Inhibitory effects of pareenteral solution 5F on HepA( x ±s)
Group
Dose
/mg·kg -1
Before experiment w w t
/ g
Af ter experiment w wt
/g
Tumor w eight
/ g
Inhibitory rate
/ %
Cont rol 20.1±1.45 30.2±1.77 0.927±0.312
5-FU 10 19.9±1.42 27.3±1.43＊＊ 0.390±0.108 57.9＊＊
5F 100 19.8±1.32 26.1±1.28＊＊ 0.422±0.094 54.5＊＊
50 20.0±1.47 28.2±1.39 0.506±0.251 45.4＊＊
25 20.1±1.67 28.9±2.60 0.631±0.345 27.8＊＊
　　＊＊P<0.01 vs cont rol group by t t est
Tab 6　Inhibitory effects of pareenteral solution 5F on scarcom 180( x ±s)
Group
Dose
/mg·kg -1
Before experiment
w wt/ g
Af ter experiment
w w t/g
Tumor w eight
/ g
Inhibitory rate
/ %
Cont rol - 20.9±1.35 27.5±1.67 1.25±0.461
5-FU 10 21.1±1.25 25.3±1.42＊＊ 0.617±0.235 50.7＊＊
5F 50 21.3±1.42 27.2±1.56 0.854±0.280 31.8＊
25 20.6±1.38 26.8±2.13 0.914±0.260 27.0
12.5 20.5±1.47 27.6±1.64 0.931±0.312 25.6
　　＊P<0.05 ＊＊P<0.01 vs cont rol group by t t est
·510· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2003 May;19(5)
结合 ,导致酶失活 ,从而显示这类化合物的细胞毒作
用。5F 也具有相同的化学结构 ,本课题组研究中观
察到 ,用不同浓度的 5F 作用 SPCA-1 细胞 24 h后 ,
DNA合成曲线为上升型曲线 ,提示 5F 与巯基酶结
合是可逆的 ,并不能完全抑制巯基酶的活性 , 破坏
DNA的结构 。
综上所述 , 5F 注射液体内外实验研究都显示出
稳定的抗瘤活性 ,且与一般的抗肿瘤药物不同 ,该药
不降低白细胞数。与以往水提物 、醇提物[ 3]相比 ,
在抗瘤活性相当的情况下 ,本注射剂的用药量明显
减少 。因此具有用药量容易控制 、药效稳定 、药物毒
性较小的优点。可考虑进入临床试用。
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Study on the anti-tumor effect of utility component
extracted from Pteris semipinnata L in vitro and in vivo
DAI Bin ,CUI Liao , WU Tie , TANG Nan , LIANG Nian-Ci ,DENG Yi-Feng
(Dept of Pharmacology , Guangdong Medical Colloge , Guangdong Key Labaratary
for Research and Development of Natural Drugs , Zhanjiang　524023)
ABSTRACT　AIM　To study the ef fect of anti-tu-
mor and tox ici ty of 5F in vi tro and in vivo and the
effect on the mouse immune organ.METHODS　Cy-
totoxici ty assay w as tested by M TT method.M ice
neoplasia weight , ant i-tumor rate , thymus exponent ,
liver exponent , spleen exponent and leucocy te num-
ber w ere applied to detect the inhibit ion on S180 and
hepatocarcinoma in mouse RESULT　5F has the ac-
tivity on anti-tumor in v itro and in vivo and decrease
the thymus exponent of mouse loaded w ith tumor.
CONCLUSION　The parenteral solution of 5F has
the ef fect on anti-tumor and reduced immunological
function.
KEY WORDS 　Pteris semipinnata L;terpenoid;
MTT method;K562;SPCA-1;mice transplatat ion
tumor
·511·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2003 May;19(5)