全 文 ：t/ min3 2菝葜皂苷元3 2sarsasapogenin
图 2 　菝葜皂苷元对照品( A)和知母( B) HPLC图谱
Fig. 2 　HPLC Chromatograms of sarsasapogenin reference
substance ( A) and Rhizoma Anemar rhenae ( B)
　　知母为临床常用药 ,文献报道其有效成分大多
为皂苷类成分。为寻找与临床功效相对应的活性成
分已进行了许多基础研究。本实验选择知母中的代
表性成分菝葜皂苷元、芒果苷为指标 ,比较可知炮制
后知母中芒果苷和菝葜皂苷元的量均有不同程度的
升高 ,但至于其炮制机制目前还不是很清楚 ,其炮制
后量的改变机制及其与功效的关系需要进一步研究
探讨。
参考文献 :
[ 1 ] 　中国药典[ S] . 一部. 2005.
[2 ] 　郑民实 ,陆仲毅. 芒果苷与异芒果苷的抗单纯疱疹病毒作用
[J ] . 中国药理学报 ,1989 ,10 (1) :85.
[ 3 ] 　李好文 ,邓家刚 ,邓　静. 芒果苷国外研究进展[J ] . 广西中医
学院学报 ,2003 ,6 (4) :62.
[ 4 ] 　叶定江. 中药炮制学[ M] . 北京 :人民卫生出版社 1999.
多指标正交试验优选复方五仁醇胶囊含药血清的制备方法
罗 　琳1 ,窦志华2 ,丁安伟3 ,黄金华1 ,陈 　洁1 ,徐济良1 3
(1. 南通大学 ,江苏 南通 　226001 ;2. 南通大学附属南通第三医院 ,江苏 南通 　226006 ;
3.南京中医药大学 ,江苏 南京 　210029)
摘　要 :目的 　药效与化学指标相结合优选复方五仁醇胶囊含药血清制备方法。方法 　建立 CCl4 诱导的大鼠肝
细胞损伤模型 ,采用 L 8 (27 )正交设计给药和取血方案 ,制备大鼠含药血清或血浆 ,考察含药血清或血浆对损伤肝细
胞增值 (M TT)和培养上清液中丙氨酸氨基转移酶 (AL T) 的影响 ,高效液相法测定含药血清或血浆中五味子乙素
含量 ,并对结果综合加权评分和方差分析。结果 　给药方式及采血时间对结果有显著影响 ,且两者之间有交互作
用 ,血浆优于血清 ,但综合加权评分无统计学意义 ,动物是否造模无明显影响。结论 　复方五仁醇胶囊含药血清较
优的制备方法为正常大鼠连续 ig 给药 3 d ,上、下午各 1 次 ,末次给药后 2 h 采血分离血浆。
关键词 :复方五仁醇胶囊 ;含药血清 ;五味子乙素 ;正交试验
中图分类号 :R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0220238204
　　中药血清药理学是指在动物灌胃给药一段时间
内采血分离血清 ,用此含药物成分的血清 (含药血
清)进行体外药理试验的实验方法。该方法能反映
中药经胃肠道消化吸收 ,再经生物转化 ,最后产生药
理效应的过程 ,不仅反映药物中可吸收部分的直接
作用 ,且能反映药物成分在机体作用下形成的代谢
产物和药物诱生的机体内同源物质的间接效果 ,体
现了体外和体内实验较好的结合[1 ] 。近年来中药血
清药理学研究取得的成果表明 ,该方法值得推广应
用 ,但也存在一些问题与局限性 ,其中含药血清制备
技术的规范化亟待解决 ,包括供体动物的选择、给药
方案、采血时间、含药血清的处理、体系中含药血清
的加入量等[2 ] ,若忽视这些问题或处理不当 ,都会影
响研究的真实性和可信性 ,从而使研究的重复性降
低[3 ] 。复方五仁醇胶囊是以五味子为主的中药复方
制剂 ,治疗急慢性肝炎疗效确切[4 ] 。笔者拟以该制
剂为对象 ,探讨采用血清药理学与血清药化学方法
相结合研究中药复方药效物质基础的可行性。本实
验将药效与化学指标相结合 ,采用正交设计综合考
察动物是否造模、给药方案、采血时间和取血成分 4
个因素 ,优选含药血清的制备方法 ,为该制剂血清药
理学和血清药化学研究提供参考。
·832· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008203216　　　
基金项目 :江苏省中医药局科研项目 ( H05173) ;江苏省高校研究生科技创新计划项目 (140)
作者简介 :罗　琳 (1976 - ) ,女 ,江苏南京人 ,讲师 ,硕士 ,从事药理学研究。Tel : (0513) 85051726 　E2mail :luolin @ntu. edu. cn3 通讯作者　徐济良　Tel : (0513) 85051727 　E2mail :jlxu @ntu. edu. cn
1 　仪器、试药及动物
H ERA cell CO2 培养箱 (德国 Gmb H 公司) ;
B T - 200B 数显恒流泵 (上海沪西分析仪器厂) ;
B IO2TE K340 酶标仪 (美国 Sigma 公司) ;日立 7170
全自动生化分析仪 (日本日立公司) ;1100 Series 高
效液相色谱仪、HP 化学工作站 (美国 Agilent 公
司) 。
羟乙基哌嗪乙磺酸 ( H EPES ,香港 Farco 公司 ,
批号 L0024LJ 0101M21) ,乙二醇双 (22氨基乙醚) 四
乙酸 ( EGTA ,美国 Amresco 公司 ,批号 0732) ,胶原
酶 IV (美国 Sigma 公司 ,批号 0406) ,胰蛋白酶 (美
国 Sigma 公司 ,批号 030702) ,DM EM 培养基 (美国
Gibco 公司 ,批号 1255136) ,新西兰新生小牛血清
(美国 HyClone 公司 ,批号 DPEO166) ,溴化 32(4 ,52
二甲基噻唑)22 ,52二苯基四氮唑蓝 (M T T ,Amresco
公司 ,批号 1324B37) ,四氯化碳 (宜兴市第二化学试
剂厂 ,批号 20010608) ,复方五仁醇胶囊 (南通大学
附属南通第三医院 ,批号 050505) ,五味子乙素对照
品 (中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 ,批号
11732040110) 。
SD 大鼠 , SPF 级 ,体质量 (230 ±19. 8) g ,雌雄
各半 ,南通大学实验动物中心提供 ,许可证号 SYKX
(苏) 200220022。
2 　方法与结果
211 　正交试验制备含药血清、血浆 :以动物是否造
模 (A) 、给药间隔时间 (B) 、采血时间 (C) 、取血成分
(D)为考察因素 ,每个因素设 2 个水平 ,选用 L 8 (27 )
正交表安排试验 ,见表 1、2。取 SD 大鼠 36 只 ,随机
分成 9 组 ,其中正交试验 8 组 ,空白对照 1 组 ,每组
4 只 ,雌雄各半 ,其中肝损伤模型大鼠给药前 24 h ip
CCl4 110 mL/ kg。按文献方法[5 ]制备复方五仁醇胶
囊甲醇提取物的 015 %CMC2Na 混悬液 ,各试验组
每天分两次按照 415 mL/ kg (相当于成人临床等效
剂量的 10 倍)剂量 ig 给药 ,末次给药后用 3 %戊巴
比妥钠 115 mL/ kg ip 麻醉 ,颈总动脉取血 ,含药血
浆组血液立即以 3 000 r/ min 离心 10 min 分离血
浆 ,含药血清组血液置冰箱 4 ℃冷藏过夜 ,分离的血
清即为含药血清。空白对照组每天 015 % CMC2Na
415 mL/ kg 灌胃 ,同法制备空白血清。同组血清、
血浆分别合并混匀 , - 70 ℃冷冻保存。
212 　肝细胞的分离、纯化与培养 :按文献报道[6 ] 方
法分离、纯化大鼠肝细胞 ,悬浮于含 10 %新生小牛
血清的 DM EM 培养基中 ,并用台盼蓝染色法检测
细胞活力达 90 % ,以 1 ×105 / cm2 接种于 96 孔和 48
孔培养板中 , 置 CO2 培养箱 , 5 % CO2 , 37 ℃培
养24 h。
213 　药效学试验 :取培养 24 h 的肝细胞 ,吸弃上清
液 ,随机分成 10 组 (正常对照组 ,模型对照组 ,正交
1～8 组) ,每组设 6 个复孔。除正常对照组加入空
　 表 1 　因素水平
Table 1 　Factors and levels
水平
因素
A B C D
1 正常大鼠 每天上、下午各 1 次 末次给药后 2 h 血清
2 肝损伤模型大鼠 前两天同水平 1 ,第
3 天 2 次间隔 1 h
末次给药后 1 h 血浆
表 2 　L8 ( 27 )正交设计及试验结果
Table 2 　Design and results of L8 ( 27 ) orthogonal test
试验号 A B A ×B C A ×C B ×C D M T T
AL T/
(U ·L - 1)
C/
(μg ·mL - 1)
Y
1 1 1 1 1 1 1 1 0. 736 5. 00 10. 405 8 86. 47
2 1 1 1 2 2 2 2 0. 595 6. 78 7. 923 8 66. 62
3 1 2 2 1 1 2 2 0. 581 7. 00 7. 789 7 64. 98
4 1 2 2 2 2 1 1 0. 451 7. 00 7. 822 9 59. 44
5 2 1 2 1 2 1 2 0. 812 4. 33 12. 789 9 100. 00
6 2 1 2 2 1 2 1 0. 517 12. 00 7. 214 5 51. 84
7 2 2 1 1 2 2 1 0. 514 6. 86 6. 781 3 60. 15
8 2 2 1 2 1 1 2 0. 496 8. 17 7. 216 9 56. 88
Ⅰ 277. 51 304. 93 270. 12 311. 60 260. 17 302. 79 257. 90
Ⅱ 268. 87 241. 45 276. 26 234. 78 286. 21 243. 59 288. 48
R 8. 64 63. 48 6. 14 76. 82 26. 04 59. 20 30. 58
·932·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
白 DM EM 培养基外 , 其余各组加入含 CCl4 10
mmol/ L DM EM 培养基 ;同时各正交组加入含药血
清或血浆 ,正常对照组和模型对照组加入空白血清 ,
终浓度均为 10 %。作用 24 h 后 ,收集 48 孔板中上
清液自动生化分析仪检测 AL T ;96 孔板中每孔加
入 5 mg/ mL M T T 液 20μL ,继续孵育 4 h ,再加入
二甲基亚砜 200μL ,振荡 ,使结晶物充分溶解 ,用酶
标仪于检测波长 570 nm、参比波长 655 nm 测定各
孔吸光度 ( A) 。
213 　含药血清、血浆中五味子乙素的测定 :按文献
方法[ 7 ]制备对照品、供试品溶液 ,注入液相色谱仪 ,
测定五味子乙素峰面积 ,外标法计算。
214 　统计学分析 :使用 Wstata710 统计软件包进行
数据处理。数据以 x ±s 表示 ,用方差分析处理数
据 ,以 P < 0105 为显著性判断界值。
215 　结果与分析 :药效学试验表明 ,正常对照组、模
型对照组 M T T 分别为 (11358 ±01014) 、(01378 ±
01073) ,AL T 分别为 (3183 ±0141) 、(22100 ±1167)
U/ L 。模型对照组 M T T 较正常对照组明显下降
( P < 0101) 、AL T 显著升高 ( P < 0101) ,说明造模成
功 ;正交试验 1、2、3、5 组 M T T 值较模型对照组明
显升高 ( P < 0101) ,所有正交组 AL T 均明显下降
( P < 0101) ,说明一定条件下制备的含药血清或血
浆对肝细胞损伤具有保护作用。
正交试验结果见表 2 ,将各试验组 3 个指标的
测定结果分别转换成分数 ,综合加权评分后进行统
计分析。具体权重为 :M T T 占 35 % ,AL T 占 35 % ,
五味子乙素的质量浓度 (C) 占 30 %。M T T、五味子
乙素以最大值为 100 分 ,AL T 先作倒数处理 ,也以
最大值为 100 分。综合因素得分计算公式为 : Y i =
M T Ti / M T Tmax ×35 % + (1/ AL T) i / (1/ AL T) max ×
35 % + Ci / Cmax ×30 %( i 为试验号) 。
从表 2 中极差直观分析 ,设计的 4 个因素对结
果影响的大小次序依次为 :采血时间、给药间隔时
间、取血成分、动物是否造模。从方差分析结果 (表
3)看 ,采血时间对结果有极显著影响 ( P < 0101) ,给
药间隔时间有显著影响 ( P < 0105) ,且两者之间存
在交互作用 (B ×C 的 P < 0105) ,血浆的影响优于血
清 ,但无统计学意义 ( P > 0105) ,而动物是否造模几
乎没有影响。因此 ,较优的含药血清制备方法组合
为 A1B1 C1 D2 ,即给正常大鼠连续 ig 给药 3 d ,上午、
下午各 1 次 ,末次给药后 2 h 采血分离血浆。
对 B、C 因素的交互作用作进一步分析 ,见表 4 ,
其最佳组合为 B1 C1 ,与以上确定的方法一致。
表 3 　方差分析结果
Table 3 　Results of variance analysis
方差来源 离均差平方和 自由度 方差 F值 显著性
B 503. 71 1 503. 71 71. 74 P < 0. 05
C 737. 66 1 737. 66 105. 05 P < 0. 01
D 116. 89 1 116. 89 16. 65
A ×C 84. 76 1 84. 76 12. 07
B ×C 438. 08 1 438. 08 62. 39 P < 0. 05
误差 (A + A ×B) 14. 04 2 7. 02
　　F0. 05 (2 ,2) = 19100 　F0. 01 (2 ,2) = 99100
表 4 　B、C因素交互作用分析结果
Table 4 　Reciprocal action analysis of factors B and C
项目 C1 C2
B1 93. 24 59. 23
B2 62. 57 58. 16
216 　验证试验 :对于最佳组合的实验验证 ,测定了
按该组合条件制备的血浆中五味子乙素的量 ,平均
值为 121590 8 μg/ mL , 与 正 交 试 验 最 大 值
的121789 9μg/ mL 接近。
3 　讨论
目前含药血清制备方法研究一般采用药效指标
考察 ,较少考虑不同制备条件对药物成分变化的影
响 ,且逐一进行单因素考察 ,不能反映各因素的相互
影响。本实验采用药理和化学指标相结合加权评分
的正交设计进行试验 ,并发现存在交互作用 ,在思路
和方法方面具有一定的创新性。
五味子乙素为五味子主要有效成分之一 ,具有
降转氨酶效果[8 ] ,故将其作为化学考察指标。
近年来有人提出血浆药理学比血清药理学更为
合理[9 ] ,因此本实验中将“取血成分”纳入考察因素 ,
结果虽然显示血浆与血清对结果的影响没有统计学
差异 ,但从极差直观分析 ,血浆确优于血清。
理论上讲 ,宜采用病理状态下的动物制备含药
血清[10 ] ,但本研究结果显示 ,动物是否造模几乎对
结果没有影响 ,与文献报道[11 ]结果一致。
关于给药方案 ,最好视药物的 t1/ 2等药动学指标
而定 ,每隔 1 个半衰期给药 1 次 ,连续给 4～6 次 ,即
可达到最大血药浓度 ,连续 5～7 个半衰期可达到稳
态血药浓度[2 ] 。但由于中药成分复杂 ,半衰期很难
·042· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
测定 ,李仪奎[12 ]在对 412 种药物的药动学指标分析
的基础上提出了“通法”方案 :每日给药 2 次 ,连续给
药 3 d。本实验给药方案水平 1 采用了“通法”,水平
2 在此基础上调整为最后一天间隔 1 h 给药 ,旨在
稳定平均稳态血药浓度 ,结果表明“通法”比较科学。
理想的采血时间应落在血药浓度的高峰期 ,这
样能够避免由于有效物质尚未吸收或代谢殆尽而造
成的假阴性结果。由于中药复方给药后 ,不同药物
达峰时间不同 ,故对于采血时间很难有一个统一标
准。蒙一纯等[13 ]认为 ,根据实验动物消化生理特点
和中药吸收转化特点确定取血时间范围是合理的 ,
如大鼠一般 1～2 h 可达血药浓度峰值 ,此时血清即
为含药血清 ;时间延长将有部分药物组分发生转化 ,
成为药物代谢血清。所以采血集时间分别设定为大
鼠末次给药后 1、2 h。
预试验中分别比较了相当于成人临床等效剂量
5、10、20 倍的给药剂量和体系中添加 5 %、10 %、
20 %、40 %的含药血清对 M T T、AL T 的影响 ,结果
表明临床等效剂量 10 的给药剂量和体系中添加
10 %的含药血清为最佳方案 , 故在本实验中直
接采用。
参考文献 :
[ 1 ] 　潘卫松 ,刘美凤 ,石　钱 ,等. 血清药理学、血清化学和中药药
代动力学[J ] . 世界科学技术 :中药现代化 ,2002 ,4 (3) :51255.
[2 ] 　米永杰 ,李　健. 中药血清药理学研究概述[J ] . 四川解剖学杂
志 ,2006 ,14 (4) :34235.
[ 3 ] 　张军平 ,张伯礼 ,山本清高. 中药药物血清的制作方法探讨
[J ] . 天津中医药 ,2004 ,21 (4) :2742276.
[4 ] 　窦志华 ,施　忠 ,李伟红 ,等. 复方五仁醇胶囊的研制[J ] . 时珍
国医国药 ,2005 ,16 (10) :953 ,957.
[ 5 ] 　窦志华 ,丁安伟 ,王陆军 ,等. 复方五仁醇胶囊血清药化学研
究[J ] . 中草药 ,2006 ,37 (8) :113721140.
[ 6 ] 　徐淑云. 药理实验方法学 [ M ] . 第 3 版. 北京 :人民卫生出版
社 ,2002 :5812583.
[ 7 ] 　罗 　琳 ,窦志华 ,丁安伟 ,等. 大鼠灌胃复方五仁醇胶囊后血
清和血浆中五味子醇甲和五味子乙素的比较 [ J ] . 中草药 ,
2006 ,37 (10) :148621489.
[ 8 ] 　王胜春 ,胡咏武 ,王俊琴 ,等. 五灵胶囊药效作用的有效成分
[J ] . 第四军医大学学报 ,2004 ,25 (17) :158721591.
[ 9 ] 　贺石林 ,葛金文 ,贺　蓉 ,等. 质疑血清药理学 ,加强多层次半
体内实验研究[J ] . 中国药理学通报 ,2005 ,21 (3) :2772279.
[ 10 ] 　张声鹏 ,施旭光 ,桂蜀华. 关于中药血清药理学中血清供体动
物是否造模的思考 [J ] . 中国中西医结合杂志 ,2001 ,21 (5) :
3882389.
[ 11 ] 　阴赪宏 ,李兰芳 ,金亚宏 ,等. 当归补血汤肝损伤小鼠含药血
清抑制肝组织 L PO 生成的作用 [J ] . 中国实验方剂学杂志 ,
2000 ,6 (5) :32234.
[ 12 ] 　李仪奎. 中药血清药理学实验方法的若干问题[J ] . 中药新药
与临床药理 ,1999 ,10 (2) :95298.
[ 13 ] 　蒙一纯 ,丁 　霞 ,贲长恩 ,等. 中药血清药理学应用研究展望
[J ] . 北京中医药大学学报 ,1999 ,22 (4) :42243.
鸡肝散中总黄酮的提取工艺研究
徐娟华1 3　 ,卢启洪2 ,曾 　苏1 ,高 　峻3 ,缪千状4
(1. 浙江大学药学院 ,浙江 杭州 　310031 ; 2. 绍兴县卫生进修学校 ,浙江 绍兴 　312000 ; 3. 浙江天堂硅谷
创业集团有限公司 ,浙江 杭州 　310012 ; 4. 奉化县第一人民医院 ,浙江 奉化 　315500)
　　鸡肝散为唇形科香薷属四方蒿 Elshol tz i a
bl anda (Bent h. ) Bent h. 的干燥成熟花序 ,主产于
云南、贵州、广西等地 ,多年生灌木状草本植物 ,性
凉 ,味苦、微辛 ,入肝、肺二经 ,具清肝明目、清热解
表、消炎止痛等功效。其叶、花或全草民间均可药
用 ,成熟花序最常用 ,治疗感冒、痢疾、肝炎、夜盲等
症[1～3 ] 。鸡肝散主含挥发油、黄酮类成分等[2～4 ] 。
鸡肝散总黄酮对大鼠急性心肌缺血、实验性心律失
常和冠脉结扎诱发胸痹证等都具有作用[5～7 ] 。初步
试验发现不同的提取方法和条件对药材中总黄酮提
取得率影响较大 ,因此 ,本实验采用多因素正交设
计 ,以总黄酮提取得率为考察指标 ,对鸡肝散水提醇
沉工艺进行优化 ,为生产厂家合理开发利用和提高
生产效益提供参考依据。
1 　仪器和药品、试剂
UV —160A 紫外2可见分光光度仪 (日本岛津) ,
RE52CS 旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂 ) ,
FAl004 电子大平 (上海天平仪器厂) ,L XJ —II 离心
沉淀机 (上海医用分析仪器厂) 。
四方蒿 E. bl anda (Bent h. ) Bent h. 经中国科学
院昆明植物研究所李恒教授鉴定 ,腊叶标本由云南
昆明金殿制药有限公司提供 ,药材经打粉、过 24 目
·142·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008206220　　　
基金项目 :浙江大学与云南省企业合作基金资助项目 (01242000121)