全 文 ：量标准提供了依据。
31 5 由于回心草主要在民间作民族草药使用,人们
对其的关注和研究不及其他广泛使用的中药, 因而
对回心草化学成分的文献报道不是很多。王波等 [ 3]
报道回心草 11 kg , 95%乙醇提取物依次用石油醚、
醋酸乙酯、正丁醇进行充分萃取, 用硅胶柱色谱、葡
聚糖凝胶柱色谱反复对醋酸乙酯部位进行成分分
离、纯化, 共分离鉴定了 8个化合物。根据化合物波
谱数据与文献报道比较, 这些化合物分别被鉴定为
胡椒碱( 11 mg)、咖啡酸甲酯( 10 mg )、尿嘧啶苷( 17
mg)、熊果酸( 13 mg )、3B-羟基-5A, 8A-氧桥-6, 22-二
烯( 41 mg )、3B-羟基-5A, 8A-氧桥-6, 9( 11) , 22-三烯
( 7 mg)、B-谷甾醇( 34 mg )、胡萝卜苷( 22 mg )。戴
畅[ 4]将回心草全草 91 8 kg 95%的乙醇提取物分为
石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水 4个部位, 进行充分
萃取,对活性筛选中活性较好的醋酸乙酯部位进行
成分分离纯化,共分离得到 26 个化合物, 鉴定了其
中 23个化合物。本实验用胡椒碱、熊果酸、齐墩果
酸、咖啡酸、原儿茶酸、槲皮素、芹菜素为对照品,指
纹谱色谱峰中未发现相应的对照品峰, 可能由于在
药材中量极低所致, 有些文献报道把胡椒碱、槲皮
素、芹菜素作为回心草的有效成分值得进一步研究,
所以,对回心草有效成分的探索显得尤为必要。
参考文献:
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三唑酮及其代谢产物在人参中的残留分析方法研究
戴 博1 ,金红宇2 , 田金改2 , 孙 鹏3 ,林瑞超2¹
( 11 空军总医院药学部, 北京 100036; 21 中国药品生物制品检定所, 北京 100050;
31 延边大学附属医院 药剂科, 吉林 延吉 133000)
摘 要:目的 建立凝胶渗透色谱( GPC)和活性炭固相萃取柱( ENVI-Ca rb-SPE)结合的方法对样品进行净化处
理,采用气相色谱-负化学电离源质谱联用( GC-NCIMS)的方法分析人参根及茎叶中三唑酮及其代谢产物三唑醇
A、三唑醇 B 残留量的方法。方法 样品以丙酮为提取溶剂超声提取, 并采用凝胶渗透色谱( GPC)和活性炭固相萃
取柱( ENVI-Carb-SPE)结合的方法进行样品的净化, DB-5MS 毛细管柱程序升温分离, 采用气质联用负化学电离源
( NCI) SIM 方式检测,以空白样品提取液配制对照品溶液, 以克服基质效应, 外标法测定。结果 3 种农药在 10
min 内完全分离,根及茎叶样品在 3个水平添加回收率在 90% ~ 105% , 均小于 6% ( n= 6)。三唑酮和三唑醇的检
测限分别为 01 1 和 10 Lg/ L, 仪器进样精密度均小于 2% ( n= 6 )。结论 本方法简便、快速、灵敏度高, 适用于人参
中三唑酮和三唑醇农药残留量测定与安全监控。
关键词:人参; 三唑酮;三唑醇 A; 三唑醇 B; GC-MS
中图分类号: R2821 6 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 01-0127-04
Investigation on residue of triadimefon and its metablites in ginseng
DAI Bo
1
, JIN Hong-yu
2
, T IAN Jin-gai
2
, SUN Peng
3
, LIN Ru-i chao
2
( 11 Air Fo rce General Hospitol, Beijing 100036, China; 21 National Institute fo r the Contro l o f Pharma ceutical
and Bio log ical Product, Beijing 100050, China; 31 Department of Pharmacy, Hospilal Affiliated
to Yanbian Univer sity, Yanji 133000, China)
Abstract: Objective T o set up a clean-up method using gel permeat ion chromato graphy ( GPC) and
EN VI-Carb-SPE1 The residues of t riadimefon and its metablites, t riadimenol A and triadimenol B in gin-
seng w ere detected by GC-M S w ith negative chemical ionizat ion ( NCI)1 Methods The sample w as ex trac-
ted w ith acetone and the ext ract w as cleaned using GPC and ENVI-Carb- SPE1 Based on GC-MS ( NCI) the
#127#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
¹ 收稿日期: 2008-04-10基金项目: / 十一五0国家科技支撑项目/ 中药材资源与生产标准规范0 (项目号: 2006BAI21B07)
pest icides w ere separated on a DB-5M S co lumn using a temperature pro gram and w er e detected w ith a mass
select ive detecto r in selective ion monitoring ( SIM ) mode1 T he reference solution w as prepared by the
blank sample ex tr act to o ver come the matrix ef fect, the external reference method w as used to detect1 Re-
sults T hree pest icides w ere separated w ithin 10 min1 T he average spiked recoveries in three levels w ere
90% ) 105% w ith relat ive standard deviations ( RSD) below 6% ( n= 6 ) in roo ts and stems1 The limits of
detection ( LOD) of t riadimefon and triadimenols w ere 01 1 and 10 Lg / L1 T he pr ecision w as below 2% ( n=
6 )1 Conclusion T he method is sensit ive for the residue analysis of three pest icides and could be used to
the t riadimefon and triadimenols detect ion and security contro l in g inseng1
Key words: g inseng; t riadimefon; t riadimeno l A; t riadimeno l B; GC-M S
中药来源于天然,植物药占绝大部分。以农药残
留为代表的外源性有害残留物污染已成为影响中药
品质和安全的重要因素。有害残留物问题同样严重
影响中药的国际形象,越来越受到各国政府和公众的
关注,重金属、黄曲霉毒素及农药残留检测与限量标
准已成为影响中药国际贸易的最重要技术壁垒之一,
成为制约中药走向国际化、现代化的/瓶颈0。人参作
为我国传统中药材,目前多为种植, 检测及控制其农
药残留对中药现代化和国际化具有重要意义。
三唑酮又称粉锈宁, 是一种高效、低毒、持效期
长、内吸性强的三唑类杀菌剂,喷施三唑酮后, 它由
茎叶吸收后可分布到全植株, 一般认为其代谢产物
三唑醇起主要的灭菌作用[ 1]。现栽培人参 Panax
ginseng C1 A1 Meyer 等药材为防治锈腐病普遍均
施三唑酮农药, 为控制中药材中农药安全使用,建立
中药中三唑酮农药残留量测定方法很有必要。国外
对三唑酮残留限量有较严格的规定, 如在5欧洲药
典6中规定植物药中最大允许残留限量( MRL) 为
01 1 mg/ kg[ 1]。联合国粮农组织( FAO)规定鸡蛋、
牛奶、肉类的 MRL 为 01 05 mg/ kg , 规定小麦、黑
麦、燕麦以及果实类蔬菜和胡椒的 MRL 为01 1 mg/
kg ,蕃茄的 MRL 为 01 2 mg / kg, 葡萄和梨的 MRL
为 01 5 mg/ kg, 粗小麦、粗大麦、粗燕麦 MRL 为 2
mg/ kg ,在国内对三唑酮的控制也日益引起有关部
门的重视,在 2005年发布的5中华人民共和国国家
标准6中就对其 MRL 做了相应的规定, 三唑酮在稻
谷、玉米、梨果类水果中 MRL 为 01 5 mg/ kg, 在小
麦、黄瓜、甜菜中的 MRL 为 01 1 mg / kg, 在豌豆中
MRL 为 01 05 mg/ kg [ 2]。三唑醇在小麦、玉米、高粱
中规定 MRL 为 01 1 mg/ kg[ 2] 。
关于三唑酮和三唑醇的分析方法有多种报道,
党宏斌等[ 3] 报道了采用高效液相色谱法对三唑醇进
行分析, 田映[ 4] 采用气相色谱法测定三唑酮并进行
方法学研究。三唑酮和三唑醇在食品和水果中的分
析有相关的报道, 周昱等 [ 5]采用气相色谱和气相色
谱-质谱法对水果中的三唑酮进行测定; 张伟国等[ 6]
采用了气相色谱-质谱法测定玉米中三唑酮、三唑醇
A、三唑醇 B 的残留量。中药材中含水量低, 基质复
杂,干扰成分较多, 农药分析又属于痕量分析范畴,
故对样品前处理和分析测定技术有着更高的要求,
在中药材中三唑酮的检测方法等未见文献报道。本
实验采用 GPC和 SPE 结合的方法对人参茎叶和根
分别进行净化处理,建立了采用 NCI离子源的气相
色谱-质谱测定的方法, 该方法灵敏度高, 回收率能
达到定量分析的要求, 可以推广应用于人参药材中
农药残留的测定。
1 实验材料
11 1 仪器与试剂: GCM S-QP2010 气相色谱-质谱
联用仪(日本岛津) ,色谱柱为 DB-5M S( 30 m @ 01 25
mm, 01 25 Lm) ; GPC ) 1122 凝胶渗透色谱仪
( LCT ech, 德国) , Bio-Beads S ) X3( 200~ 400目) ;
N-EVAP
TM
111 氮吹仪 ( Organomat ion Associates
INC,美国) ; ENV I-Car b-SPE柱( Supelco, 美国)。
三唑酮( t riadimefon)对照品购自国家标准物质
中心,三唑醇( t riadimenol)对照品购自 Chem Serv-
ice;所用丙酮、醋酸乙酯、环己烷、石油醚均为重蒸
馏后使用,二氯甲烷为农残级试剂。
11 2 药材来源:本实验所用人参采自吉林省临江市
六道沟镇人参规范化种植园,经中国药品生物制品
检定所标本馆张继老师鉴定为人参 Panax ginseng
C1 A1 Meyer,符合研究要求。
2 方法与结果
21 1 分析条件
21 11 1 色谱条件: 载气为高纯氦气, 柱体积流量
11 40 mL/ min;进样口温度为 250 e , 150 kPa高压
不分流进样模式, 这样时间为 11 0 min, 进样量 1
LL。柱升温程序:初始温度 60 e , 以 35 e / m in升
至 200 e ,以 10 e / m in 升至 250 e , 以 40 e / min
#128# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
升至 270 e ,保持 01 5 min。
21 11 2 质谱条件: 负化学电离源( NCI) ,离子源温
度为 200 e ,接口温度为 250 e 。在 SIM 模式下 3
个组分可达到基线分离, 峰形良好,各成分保留时间
及定性定量离子见表 1。
表 1 3 种农药的保留时间和选择离子
Table 1 Retention times and selected
ions of three pesticides
编
号
农药
名称
特征离子( m/ z)
保留时间/ min 定量离子(相对丰度) 定性离子(相对丰度)
1 三唑酮 7. 540 127( 1. 00) 166( 1. 75)
2 三唑醇 A 8. 136 127( 11 01) 295( 1. 00)
3 三唑醇 B 8. 238 127( 1. 01) 295( 1. 00)
212 农药混合对照品的配制:称取各农药对照品约5
mg,用丙酮溶解并分别定容至 50 mL,制成100 mg/ L
的对照储备液, 4 e 保存。由于样品基质比较复杂,
测定时基质效应显著,为保证测定结果的准确,按21 3
项样品的前处理方法提取空白根及茎叶样品,用此空
白溶液配置标准工作溶液,制备随行标准曲线。
21 3 样品的前处理:取样品粉碎,精密称取 2 g, 精
密加入丙酮 25 mL,超声处理 10 min, 加入氯化钠 1
g ,再精密加入二氯甲烷 15 mL, 超声处理 10 min,
离心,将上清液迅速移入装有 1 g 无水硫酸钠的具
塞锥形瓶中,放置 30 m in。精密量取 20 mL 置蒸发
皿中,于 60 e 恒温水浴上挥至近干。用环己烷-醋
酸乙酯( 1B 1)溶解并定容至 5 mL,移入凝胶渗透色
谱( GPC)进样瓶中。进行 GPC 净化洗脱,进样量 1
mL,以环己烷-醋酸乙酯( 1B 1)为流动相, 体积流量
1 mL/ m in,收集 900~ 1 600 s的洗脱液, 50 e 以下
氮吹浓缩至近干,丙酮定容至 1 mL。茎叶样品因含
大量叶绿素, 所以 GPC 净化后再通过活性炭固相萃
取柱进行净化, 以增强其净化的效力, 用 15 mL 石
油醚-醋酸乙酯( 4B1)洗脱, 收集洗脱液, 50 e 以下
氮吹浓缩至近干, 丙酮定容至 1 mL。
21 4 线性关系考察:将质量浓度为 1 mg / L 的三唑
酮、10 mg/ L 三唑醇农药混合对照品分别用根、茎叶
空白样品的提取液逐级稀释成 01 5~ 3 000 Lg/ L 系
列的 10个浓度, 采用上述色谱条件进行气质分析,
以质量浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标,绘制标准曲
线,结果表明在一定范围内, 标准曲线线性关系良
好,相关系数均\01 999 7,见表 2。
表 2 3种农药的线性范围、回归方程及相关系数
Table 2 Linear ranges, regression equations, and r value of three pesticides
编号 农药 线性范围/ (Lg # L- 1 ) 根回归方程 r
茎叶
回归方程 r
1 三唑酮 01 5~ 500 Y= 0. 791 5 X 2 + 695. 76 X + 9 752. 2 0. 999 9 Y= 0. 369 8 X2 + 764. 78 X - 907. 27 0. 999 9
2 三唑醇A 2~ 2 000 Y= - 0. 013 8 X 2+ 72. 595 X+ 295. 6 0. 999 7 Y= - 0. 008 8 X2 + 81. 938 X - 315. 48 0. 999 9
3 三唑醇 B 3~ 3 000 Y= - 0. 012 6 X 2+ 77. 928 X+ 376. 05 0. 999 9 Y= - 0. 009 9 X2 + 105. 01 X - 606. 04 0. 999 9
21 5 检出限:将对照液逐级稀释,分别以信噪比为
3倍作为指标,考察 3种农药的检测限, 结果表明采
用本法三唑酮、三唑醇 A和三唑醇 B的检测限分别
为 01 1、10、10 Lg / L。
21 6 精密度试验:取三唑酮、三唑醇 A 和三唑醇B分
别为 011、1和 1 Lg/ L 的混合对照品溶液,连续进样 6
次,测定峰面积,RSD分别为 1134%、1182%和 1119%。
21 7 重现性试验:取根和茎叶样品各6份,每份2 g,分
别按 213样品的前处理方法项下方法提取、净化, GC-
MS分析,测得三唑酮、三唑醇 A和三唑醇 B的量,计
算RSD分别为 11 62%、1145%和 2118%,均小于3%。
21 8 稳定性试验:取三唑酮、三唑醇 A 和三唑醇 B
分别为 01 1、1和 1 Lg/ L 的混合对照品溶液, 分别在
1、3、5、10、12、24 h 连续进样 6 次, 测定峰面积, 计
算 RSD分别为 11 79%、21 76%和 21 38%。
21 9 回收率试验: 采用加样回收法,取根和茎叶空
白样品各 2 g, 按低、中、高 3个水平添加对照品, 分
别为三唑酮 01 05、01 5、3 Lg, 三唑醇 A 01 2、2、12
Lg,三唑醇 B 013、3、18 Lg,每个水平平行 2份,分别按
/ 2130样品的前处理方法提取、净化, GC-MS 分析,计算
回收率及RSD( n= 6 ) ,均符合要求,见表 3。
21 10 样品的测定:为保证建立的方法准确可靠,对
人参在其生长期内进行施药, 采集施药后 7 d的人
参,将茎叶与根分开,分别粉碎并包装好, 按照上述
的样品前处理方法和气相色谱-质谱分析条件下进
行检测,计算质量分数, 人参根中三唑酮、三唑醇 A
及三唑醇 B的量分别为 431 61、111 21、81 39 Lg/ kg;
茎叶中三唑酮、三唑醇 A 及三唑醇 B 的量分别为
31 1431 52、54 537. 27、167. 44 Lg/ kg。人参根及茎
叶的总离子流色谱图见图 1。
3 讨论
31 1 离子源的选择: 对 EI源与 NCI源进行比较,两
种离子源均能达到检测目的,考虑到中药基质比较复
杂,杂质干扰比较多, 再将人参供试品溶液加入对照
品进行比较,结果表明, NCI作为检测离子源谱图比
较简单,干扰较少,故选择 NCI作为检测离子源。
#129#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
表 3 3 种农药的回收率及相对标准偏差
Table 3 Recoveries and RSD of three pesticides
编号 农药
根
回收率/ %
低 中 高 RSD/ %
茎 叶
回收率/ %
低 中 高 RSD/ %
平均回收率/ %
1 三唑酮 91. 28 98. 50 90. 22 4. 41 102. 52 96. 30 102. 36 6. 82 96. 86
2 三唑醇 A 99. 05 92. 42 99. 44 4. 53 94. 38 87. 28 90. 10 4. 35 93. 78
3 三唑醇 B 88. 12 93. 04 95. 95 4. 37 103. 51 102. 76 94. 61 5. 46 96. 33
1-三唑酮 2-三唑醇 A 3-三唑醇 B A-根对照品 B-根样品 C-茎叶对照品 D-茎叶样品
1-t riadim efon 2-t riadimenol A 3-t riadimen ol B A- reference subs tance of roots B-sample of roots
C-r eference substance of s tems and leaves D- sam ple of stems an d leaves
图 1 三唑酮、三唑醇 A及三唑醇 B的总离子流色谱图
Fig. 1 Total ion current chromatograms of triadimefon, triadimenol A, and triadimenol B by GC-MS
31 2 GPC 净化条件: 人参所含成分复杂, 净化不
好,极易污染色谱柱及离子源,严重影响分离效果及
检测灵敏度。三唑醇为强极性的农药, 用传统的柱
色谱方法,净化效果差、回收率低。本实验采用了新
的净化技术凝胶渗透色谱法( GPC)用以去除样品中
的大分子干扰。GPC 净化步骤的切割时间要考虑
渗透排除基体与混合对照品的分离,分别收集样品
与混合对照品从 900~ 1 740 s的 GPC 流动相,每份
60 s,分别用于 GC-MS 的检测。观察柱净化的过程
发现在1 500 s之前可以完全去除叶绿素杂质,而样
品收集液在 960 s时的 GC-M S测定即有响应。为
了保证回收率, 故提前切割时间为 900 s,在 GPC 之
后再选用 SPE 再净化, 能满足分析物回收率
要求[ 7] 。
31 3 SPE 净化条件: 样品中的色素会对质谱检测
器产生污染。本实验采用活性炭-SPE 小柱作为净
化柱, 15 mL 石油醚-醋酸乙酯 ( 4 B 1)为淋洗液, 大
部分色素保持在柱中, 目标化合物被淋洗下来。实
验发现,淋洗速度对净化效果有直接的影响, 淋洗速
度过快,较多的色素会随着农药同时淋洗下来,速度
保持在每秒 1滴时净化效果较为理想。
31 4 空白样品的制备: 为了消除基质影响, 本实验
用空白样品基质溶液配制标液。空白样品来源于空
白地块中采集的新鲜人参,按上述方法先进行定量,
确定没有待测农药后, 将作为空白样品进行试验。
对不同产地、不同年份的人参空白样品进行比较, 结
果不影响测定结果。
31 5 GC-M S中质谱常规扫描模式( SCAN )与选择
离子检测模式( SIM)结合:农药检测为痕量分析过
程, M S检测中的 SCAN 扫描模式在多数情况下由
于灵敏度低, 难以满足检测要求, 因此高灵敏度的
SIM 方式更为常用。由于中药中基质成分复杂, 除
用于定量的特征离子外,必须选择 1~ 3个特征性离
子作为辅助性定性离子, 以保证没有假阳性结果的
产生。
GC-M S在农药残留的定性定量分析方面具有
较强的优越性,尤其是在样品中干扰杂质较多的情
况下,利用质谱检测可准确鉴定化合物结构的特点,
真正实现了中药材中多种类农药的同时测定,
效率高。
31 6 安全使用情况:人参喷施三唑酮后, 根部锈斑
较空白组明显减少, 而以正常剂量喷施, 7 d后采收
时,根中三唑酮及三唑醇已经降解到很低的水平,达
到我国及欧洲各国的限量标准; 在叶中还残留较多
的农药,是因为采集时未进行任何清洗,附着在茎叶
表面的农药也进行最终的测定。
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#130# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月