全 文 ：正交设计优选卷柏中总黄酮的提取工艺研究
冯卫生1 ,赵献敏1 ,王彦志1 ,魏 　悦1 ,郑晓珂2 3
(11 河南中医学院药学院 ,河南 郑州 450008 ; 21 河南中医学院基础医学院 ,河南 郑州 450008)
摘　要 :目的 　优选卷柏中总黄酮的提取工艺。方法 　采用紫外分光光度法和高效液相色谱法分别测定总黄酮和
阿曼托双黄酮。以提取量为考察指标 ,用正交设计方法优选最佳提取工艺。结果 　以总黄酮提取量为考察指标 ,
其优选工艺为 A1B2 C2 D2 ;以阿曼托双黄酮提取量为考察指标 ,其优选工艺为 A1～3 B1～3 C2 D2 。综合考察采用
A1B2 C2 D2 为最佳提取工艺 ,即药材加 10 倍量的 95 %乙醇 ,回流提取 2 次 ,每次 2h。结论 　优选得到的工艺稳定
可行 ,可作为卷柏的提取工艺。
关键词 :卷柏 ;总黄酮 ;正交设计
中图分类号 :R28412 ;R286106 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :0253 2670 (2009) 06 0893 04
Optimization of extracting technology for flavonoids in Sela ginella t ama riscina
with orthogonal design
FEN G Wei2sheng1 , ZHAO Xian2min1 , WAN G Yan2zhi1 ,WEI Yue1 , ZH EN G Xiao2ke2
(11 School of Pharmacy , Henan College of Traditional Chinese Medicine , Zhengzhou 450008 , China ; 21 Basic Medical
College , Henan College of Traditional Chinese Medicine , Zhengzhou 450008 , China)
Abstract : Objective 　To optimize the ext raction technology for total flavonoids in S el a gi nel l a t am ar2
isci na1 Methods 　To determine t he content of total flavonoids by UV and t he content of index constit uent
of amentoflavone by H PL C1 The optimum ext raction condition was investigated by ort hogonal design and
t he ext raction quantity was regarded as the investigated index1 Results 　The optimum ext racting condition
was A1B2 C2 D2 with the ext raction quantity of total flavonoids as t he investigated index1 The optimum ex2
t racting condition was A1～3B1～3 C2 D2 wit h t he ext raction quantity of amentoflavone as t he investigated in2
dex1 The optimum ext racting condition was A1B2 C2 D21 That is adding ten times amount of 95 % alcohol
and refluxing twice , 2 h once1 Conclusion 　The optimum technology is stable and feasible for the ext rac2
tion of S1 t am arisci na1
Key words : S el agi nel l a am arisci na (Beauv1 ) Sping ; total flavonoids ; ort hogonal design
　　卷柏为卷柏科植物卷柏 S el agi nel l a tam arisci2
na ( Beauv1 ) Sping 或 垫 状 卷 柏 S1 p ul vi nat a
( Hook1 et Grev1 ) Maxim 的干燥全草 ,性辛平 ,具
有活血通经功效 ,主要用于经闭痛经 ,跌扑损伤 ,吐
血 ,崩漏 ,便血 ,脱肛等[ 1 ] 。卷柏含有阿曼托双黄酮、
扁柏双黄酮、新柳杉双黄酮等化合物[2～4 ] ,属天然多
酚类抗氧化剂 ,具有抗脂质过氧化和清除自由基的
作用[ 5 ,6 ] ,能明显降低鼠耗氧速度和耗氧量 ,提高耐
氧能力 ,扩张冠状动脉 ;改善血液流变学各项指标 ,对
溶血性磷脂酰胆碱诱导的血管内皮细胞损伤有保护
作用[7 ] 。为探索卷柏总黄酮提取工艺 ,本实验采用正
交设计法 ,以总黄酮提取量和阿曼托双黄酮提取量为
考察指标 ,对卷柏总黄酮提取工艺进行了研究。
1 　仪器与试药
　　岛津 UV —2201 紫外分光光度计 ; Shimadzu
L C —10A T 高效液相色谱仪 ; AB204 —N 万分之一
电子天平 ;A E240 十万分之一电子天平 ;DZKW —4
电子恒温水浴锅 (北京中兴伟业仪器有限公司) ;旋
转蒸发器 SB —1000 (上海爱朗仪器有限公司) 。
　　药材卷柏购自本草国药堂 ,经过河南中医院药
学院生药学科陈随清教授鉴定为卷柏科卷柏属卷柏
·398·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 收稿日期 :2008210209　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :河南省高校新世纪优秀人才支持计划 (2006 HANCET208) ;河南省重大公益性科研计划项目 (08110091800)
作者简介 :冯卫生 (1960 —) ,男 ,河南林州人 ,教授 ,中药学博士 ,享受国务院特殊津贴专家、中国药学会理事、中华中医药学会中药化学
分会常委、河南省药学会常务理事 ,主要从事中草药活性成分研究及新药开发。
Tel : (0371) 65575963 　Fax : (0371) 65680011 　E2mail :fwsh @hactcm1edu1cn3 通讯作者　郑晓珂　Tel : (0371) 65575963 　E2mail :zhengxk1 2006 @yahoo1com1cn
S1 t am arisci na (Beauv1 ) Sping 的全草。阿曼托双
黄酮为本实验室自制 ,质量分数达到 98 %以上。
　　乙腈为色谱纯 (天津市四友精细化学品有限公
司) ;乙醇等其他试剂均为分析纯 ,水为超纯水。
2 　方法与结果
211 　提取工艺操作 :精密称取药材 18 份 (分为 9
组 ,每组 2 份) ,每份 40 g ,按 L9 (34 ) 正交试验表中
规定的条件用乙醇进行回流提取 , 提取液滤过 ,合
并 ,减压回收乙醇 ,浓缩成稠膏状 ,置真空干燥箱中
干燥至恒重 ,得相应提取物。
212 　因素和水平的确定 :精密称取卷柏药材 40 g ,
用乙醇提取 , 根据单因素初筛试验结果 ,分别确定
乙醇体积分数 (A) 、提取次数 (B) 、提取时间 ( C) 和
乙醇倍量 (D)为因素 ,每个因素各取 3 个水平 ,因素
水平见表 1。
表 1 　因素与水平
Table 1 　Factors and levels
水平
因　素
A/ % B/ 次 C/ h D/ 倍量
1 95 1 1 8
2 70 2 2 10
3 50 3 3 12
213 　卷柏提取物中总黄酮的测定
21311 　供试品溶液的制备 :精密称取干燥恒重的提
取物约 3100 mg ,置 100 mL 量瓶中 ,加 95 %乙醇至
刻度 ,摇匀 ,即得。
21312 　标准曲线的绘制 :精密称取干燥恒重的阿曼
托双黄酮对照品 2100 mg ,置 25 mL 量瓶中 ,加
95 %乙醇超声溶解 ,定容至刻度 ,摇匀。分别取 0、
1、2、3、4、5、6 mL 置 25 mL 量瓶中 ,加 95 %乙醇至
刻度 ,摇匀。在 337 nm 处测定其吸光度。以吸光
度对质量浓度进行线性回归 , 得回归方程 Y =
521147 X + 01028 ( r = 01999 9) 。
21313 　精密度试验 :精密吸取同一供试品溶液 015
mL ,重复测定 6 次吸光度 ,计算总黄酮的提取量 ,结
果总黄酮提取量的 RSD 为 0188 %。
21314 　稳定性试验 :精密称取同一批样品 10 份 ,配制
供试品溶液 ,分别于 0、2、4、6、8、10、12、18、24、48 h 测定
吸光度 ,计算总黄酮的提取量 ,结果总黄酮提取量的
RSD 为 0121 % ,说明供试品溶液在 48 h 内稳定。
21315 　回收率试验 :精密称取卷柏乙醇提取物 6
份 ,加入阿曼托双黄酮对照品适量 ,制备供试品溶
液 ,测定吸光度 ,计算回收率 ,结果平均回收率为
99190 %。
21316 　样品测定 :精密称取干燥恒重的各卷柏正交
试验所得的乙醇提取物约 3100 mg ,置 100 mL 量瓶
中加 95 %乙醇至刻度 ,摇匀 ,在 337 nm 处测定其吸
光度 ,由回归方程计算总黄酮质量分数 ,计算总黄酮
提取量 (总黄酮提取量 = 总黄酮的质量分数 ×提取
物的质量) 。
214 　卷柏提取物中阿曼托双黄酮的测定
21411 　色谱条件 :色谱柱为 Agilent Zorbox SB2C18
(250 mm ×416 mm ,5μm) ;流动相 :乙腈2012 %磷
酸 (40 ∶60) ;体积流量 :018 mL/ min ;检测波长 :337
nm ;柱温 : 30 ℃;进样量 : 10μL 。阿曼托双黄酮与
相邻杂质峰的分离度大于 2 ,理论塔板数按阿曼托
双黄酮峰计算大于 3 000。
21412 　供试品溶液的制备 :精密称取干燥恒重的乙
醇提取物约 3100 mg ,置 100 mL 量瓶中 ,加 95 %乙
醇至刻度 ,摇匀 ,用 0145μm 的微孔滤膜滤过 ,作为
供试品溶液。
21413 　标准曲线的绘制 :精密称取干燥恒重的阿曼
托双黄酮 2150 mg ,置 50 mL 量瓶中 ,加 95 %乙醇
超声溶解 ,定容至刻度 ,摇匀 ,用 0145μm 的微孔滤
膜滤过 ,分别进样 0、2、4、6、8、10、12μL ,测定峰面
积。以峰面积对质量浓度进行线性回归 ,得回归方
程Y = 2 346 639 X + 6 4111314 ( r = 01999 8) 。
21414 　精密度试验 :精密吸取同一批供试品溶液
10μL ,注入高效液相色谱仪 ,重复测定 6 次 ,记录阿
曼托双黄酮峰面积 ,计算得其 RSD 值为 0192 %。
21415 　稳定性试验 :精密称取同一供试品溶液 ,分
别于 0、2、4、6、8、12、24、48 h 进样 10μL ,记录色谱
图 ,结果阿曼托双黄酮的峰面积无显著变化 , RSD
为 0135 %。结果表明供试品溶液在 48 h 内较稳定。
21416 　回收率试验 :精密称取卷柏乙醇提取物样品
9 份 ,每份约 3100 mg ,分为 3 组 ,分别加入阿曼托
双黄酮对照品 0110、0120、0130 mg ,制备供试品溶
液 ,进样测定 ,计算加样回收率 ,结果每组平均加样
回收率分别为 98163 %、99118 %、99128 %。
21417 　样品测定 :精密称取干燥恒重各卷柏正交试
验所得的乙醇提取物约 15100 mg ,置 50 mL 量瓶
中 ,加 95 %乙醇定容至刻度 ,摇匀 ,用 0145μm 微孔
滤膜滤过 ,进样 10μL ,记录峰面积值 ,由回归方程
计算阿曼托双黄酮的质量分数 ,计算阿曼托双黄酮
的提取量 (阿曼托双黄酮提取量 = 阿曼托双黄酮的
质量分数 ×提取物的质量) 。
215 　正交试验及其结果 :按照 L 9 (34 ) 正交设计安
排试验 ,结果见表 2 ,方差分析见表 3。
·498· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
表 2 　正交试验结果
Table 2 　Results of orthogonal test
试验号 A B C D 总黄酮提取量/ mg 阿曼托双黄酮提取量/ mg
1 1 1 1 1 2891 53 1601 49
2 1 2 2 2 4461 68 2461 66
3 1 3 3 3 5741 31 2451 67
4 2 1 2 3 5341 85 2231 79
5 2 2 3 1 6571 40 2861 18
6 2 3 1 2 5671 18 2401 13
7 3 1 3 2 5751 18 2451 53
8 3 2 1 3 6741 32 2161 06
9 3 3 2 1 6191 66 2541 34
1 1 1 1 1 3581 77 1841 44
2 1 2 2 2 4901 13 2761 16
3 1 3 3 3 6311 68 2581 96
4 2 1 2 3 5571 83 2461 77
5 2 2 3 1 7161 39 2801 76
6 2 3 1 2 4571 68 1901 69
7 3 1 3 2 5671 21 2121 75
8 3 2 1 3 6791 43 2311 43
9 3 3 2 1 6931 78 2601 75
总黄酮提取量
Ⅰ 2 791110 2 8831 37 3 026191 3 835153
Ⅱ 3 491133 3 6641 35 3 842193 3 104106
Ⅲ 4 309158 4 0441 29 3 722117 3 652142
R 1 518148 1 1601 92 　8161 02 　731147
阿曼托双黄酮提取量
Ⅰ 1 372138 1 2731 77 1 423124 1 426196
Ⅱ 1 277163 1 7371 25 1 508147 1 411192
Ⅲ 1 620186 1 4501 54 1 529185 1 622168
R 　343123 　4631 48 　501 64 　210176
表 3 　方差分析
Table 3 　Analysis of variance
误差来源 　离均差平方和 自由度 　　方　差 F值 显著性　　
总黄酮 A 95 4761 932 2 47 7381 466 321145 P < 01 01
B 58 2021 596 2 29 1011 298 191596 P < 01 01
C 160 3771 140 2 80 1881 570 531996 P < 01 001
D 108 2121 593 2 54 1061 297 361433 P < 01 001
Se 2 13 3651 741 9 1 4851 082
阿曼托双黄酮 A 1 9781 200 2 9891 110 31580
B 4 1281 150 2 2 0641 070 191600
C 13 7181 280 2 6 8591 140 541000 P < 01 01
D 12 0871 350 2 6 0431 674 361430 P < 01 001
Se 2 2 4891 780 9 2761 641
　　F0105 (2 ,2) = 191 00 　　F0101 (2 ,2) = 99100
　　以总黄酮提取量为考察指标 ,极差值显示 ,各因
素作用主次为 A > B > C > D ;方差分析结果表明 :
A、B、C、D 因素的影响均有显著性意义 ( P < 0105) ,
以 A1B2 C2 D2 为佳。以阿曼托双黄酮提取量为考察
指标 ,极差值显示 ,各因素作用主次为 B > A > D >
C ;方差分析结果表明 :A、B 因素的影响无显著性意
义 ( P > 0105) ,C、D 因素的影响有显著性意义 ( P <
0105) ,优选的工艺条件为 A1～3 B1～3 C2 D2 为佳。综 合上 述 两 项 考 察 指 标 , 优 化 水 平 组 合 应 为A1B2 C2 D2 ,即药材加 10 倍量的 95 %乙醇 ,回流提取2 次 ,每次 2 h。216 　最佳提取工艺的验证试验 :精密称取 6 批干燥的卷柏药材各 40 g ,按最佳工艺条件平行操作 ,测定吸光度 , 分别计算总黄酮和阿曼托双黄酮的质量分数和提取量 ,结果见表 4。　　结果表明 :用最佳工艺条件提取 ,提取物中总黄
·598·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
表 4 　最佳工艺的验证
Table 4 　Results of optimum technology
批　次
药材中总黄酮
/ %
药材中阿曼
托双黄酮/ %
提取物中总
黄酮/ %
总黄酮的提
取量/ mg
提取物中阿曼
托双黄酮/ %
阿曼托双黄酮的
提取量/ mg
20061010 41 90 11 58 24100 8431 92 11120 2981 25
20061207 51 54 11 64 23154 8001 14 12194 3351 42
20070120 41 39 11 60 21139 7911 74 10128 2911 68
20070506 61 15 11 52 25115 9211 15 13126 3431 79
20070823 41 76 11 49 21176 7091 21 81 87 2861 30
20071102 51 37 11 55 22137 8321 17 91 49 2881 56
酮和阿曼托双黄酮的质量分数均较高。提取物中总
黄酮和阿曼托双黄酮的提取量均高于其他各正交试
验值 ,故本最佳工艺条件合理 , 同时也表明此工艺
具有较好的稳定性。
3 　讨论
　　在制备样品溶液时 ,比较水煮、超声、回流等不
同提取方法 ,发现回流提取方法得到的总黄酮量较
高 ,故采用回流提取的方法对样品进行处理。
　　本实验采用紫外分光光度法测定总黄酮与高效
液相色谱法测定指标性成分阿曼托双黄酮相结合 ,
增加了因素选择的准确性和可靠性。
参考文献 :
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究[J ]1 中国现代医学杂志 ,2004 ,14 (14) :8821001
正交试验优选石杉碱甲脂质体的制备研究
张彦青1 ,2 ,解军波3 ,陈文倩1 ,2 ,邓晨辉1 ,2 ,酒向飞1 ,2 ,周田彦1 ,2 ,卢 　炜1 ,2 3
(11 北京大学 天然药物及仿生药物国家重点实验室 ,北京 　100083 ; 21 北京大学药学院 药剂系 ,北京 　100083 ;
31 天津商业大学 制药工程系 ,天津 　300134)
摘　要 :目的 　优化石杉碱甲脂质体的制备工艺和处方。方法 　采用薄膜分散结合硫酸铵梯度法制备石杉碱甲脂
质体 ,以包封率为评价指标采用正交试验优化石杉碱甲脂质体的最优处方和工艺条件。结果 　石杉碱甲脂质体的
最优处方工艺条件为 :孵化温度为 60 ℃,药脂比为 1 ∶40 ,孵化时间为 30 min。所得脂质体的包封率为 87102 %以
上。结论 　由最佳处方工艺条件制备的石杉碱甲脂质体包封率较高 ,包封率和体外释放稳定 ,重现性好。
关键词 :石杉碱甲脂质体 ;制备 ;正交试验 ;高效液相色谱
中图分类号 :R28412 ;R286106 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :0253 2670 (2009) 06 0896 03
　　石杉碱甲是从蛇足石杉中分离得到的一种新型
石松类生物碱有效单体 ,是我国首创的强效可逆性
乙酰胆碱酯酶抑制剂 ,通过抑制脑内乙酰胆碱酯酶
活性 ,提高脑内乙酰胆碱水平而发挥作用 ,是目前治
疗老年痴呆最有效的药物之一[ 1 ,2 ] 。现有石杉碱甲
制剂缺乏脑选择性 ,由于抑制外周胆碱酯酶活性导
致用药者产生较大不良反应 ,如肌肉震颤 ,呼吸抑制
等。研究新型石杉碱甲制剂以提高其脑内浓度增强
治疗效果并降低不良反应 ,对临床治疗老年痴呆将
有重要意义。本实验研究制备石杉碱甲脂质体以增
加石杉碱甲脑内浓度 ,增强治疗效果并降低外周不
良反应。
1 　材料和仪器
　　石杉碱甲 (上海同田生化有限公司 ,质量分数为
·698· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 收稿日期 :2008210220　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :张彦青 ,女 ,山东汶上人 ,讲师 ,北京大学药学院药剂学博士 ,研究方向 :药物新剂型与药物动力学药效动力学研究。
Tel :13752524378 　E2mail :zhyanqing @yahoo. com. cn3 通讯作者　卢　炜　E2mail : luwei_pk @bjmu1 edu1cn