全 文 ：在第一类中 ,所有白芷样品的聚类没有表现出明显
规律性 ,即不同产地栽培白芷间遗传差异较小 ,这与
前人研究认为四大栽培白芷不应做类的区分相一
致[ 1 ～ 3] 。
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黄连遗传多样性的 ISSR分析
张春平1 ,何　平1 ＊ ,胡世俊2 ,王瑞波1 ,张益锋1 ,刘长坤1 ,高　姗1
(1.西南大学生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点实验室 , 重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室 ,
重庆　400715;2.中国科学院昆明植物研究所 , 云南 昆明　650204)
摘　要:目的　对野生黄连进行遗传多样性研究。方法　通过 ISSR 技术对 7 个野生黄连居群共 78 个个体进行遗
传多样性分析。结果　用 12 个随机引物共扩增出 106 条清晰条带 , 其中 72 条具多态性 , 平均多态性位点比率为
67.92%, Nei′s 基因多样性指数 H=0.180 3 , Shannon 多样性指数 I=0.283 2 ,遗传分化指数 Gst=0.681 5 ,遗传距
离和遗传一致度分别为:0.089 4～ 0.184 6和 0.832 1 ～ 0.912 7。结论　黄连种水平上具有较高的遗传多样性 ,遗
传变异主要存在于居群间 , 遗传多样性与地理关系表现出明显的相关性 , ISS R可以作为研究遗传多样性及遗传分
化的有效标记。
关键词:黄连;遗传多样性;ISSR;聚类分析;遗传分化
中图分类号:R282.7　　　文献标识码:A　　　文章编号:0253-2670(2009)10-1630-05
ISSR Analysis for genetic diversity of Coptis chinensis
ZHANG Chun-ping1 , HE Ping 1 , HU Shi-jun2 , WANG Rui-bo1 , ZHANG Yi-feng 1 ,
LIU Chang-kun1 , GAO Shan1
(1.Key Labo rator y(Ministry of Education)of Eco-environments o f Three Go rges Reser voir Reg ion , Chongqing Key Labor a-
to ry o f Plant Ecolog y and Resources Resea rch fo r Three Go rges Reser voir Region , School of Life Sciences , Southwest Univer-
sity , Chongqing 400715 , China;2.Kunming Institute o f Bo tany , Chinese Academy of Sciences , Kunming 650204 , China)
Abstract:Objective　To discuss the gene tic diversity of Copt is chinensis.Methods　The genetic diver-
sity o f 78 individuals from seven populations w as analy zed by inte r-simple sequence repeat (ISS R).Results
Twelve prime rs w ere selected to produce highly reproducible ISSR bands.Among 106 amplified bands , 72
showed polymorphism , the percentage of po lymo rphic bands reached to 67.92%.Nei′s gene dive rsity in-
dex (H)was 0.180 3 , Shannon info rmation index (I)was 0.283 2 , Gst was 0.681 5.The genet ic distance
coefficient and genet ic similarity w ere 0.089 4—0.184 6 and 0.832 1—0.912 7 , respect ively. Conclusion
C.chinensis holds high genetic dive rsity and the majo ri ty of gene tic variation occurs among the popula-
·1630· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 10 期 2009年 10 月
＊ 收稿日期:2008-11-08　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070080)作者简介:张春平(1982—),男 ,山东潍坊人 ,博士 ,主要从事植物资源学与植物分子生物学方面的研究。
Tel:13667652727　E-m ail:chunpingzhang520@163.com＊通讯作者　何　平　Tel:(023)68254122　E-mail:h eping196373@126.com
tions.By cluster analy sis , the geog raphical dist ribution is very obvious.The ISSR marker could be used
for the analy sis of the genetic diver sity and genetic varia tion of C.chinensis.
Key words:Coptis chinensis Franch.;genet ic diversity;ISS R;cluster analy sis;genetic v ariat ion
　　黄连 Coptis chinensis Franch.又名味连 、川黄
连 、鸡爪连 ,为毛茛科黄连属多年生草本植物 ,三级
濒危种[ 1] 。野生黄连大多分布于四川 、重庆 、湖南 、
湖北 、陕西 、贵州等省市海拔 1 200 ～ 1 700 m 的山
谷密林之中。黄连性寒 、味苦 ,根茎入药 ,具有清热
燥湿 、泻火解毒等作用[ 2 , 3] ,临床上还用于细菌性痢
疾 、局部化脓性感染 、心律失常 、胃炎及十二指肠溃
疡等病的治疗[ 4] 。由于黄连根茎中有效成分小檗碱
的独特药效 ,使得黄连极具有资源保护与利用价值 ,
但是现在野生黄连居群数及个体数濒危稀少 ,野生
资源相当匮乏 。
目前 ,对黄连的研究主要集中在化学成分 、药理
作用和临床应用等方面[ 5] ,陈大霞等[ 6] 运用 RAPD
技术分析了 15份人工种植黄连的遗传关系 ,但对于
野生黄连的遗传多样性研究未见报道 。ISSR(inte r-
simple sequence repeat)是一种由 Zietkiew iez等于
1994年创建[ 7] ,建立在 PCR反应基础上的 DNA 分
子标记 。近年来 , ISSR-PCR 已成功用于植物遗传
多样性分析 、基因图谱绘制 、分子生态学研究[ 8 ～ 10] 、
品种鉴定和种质资源的遗传多样性研究等领域[ 11] 。
该技术无需预知受试基因组序列 ,具有成本低 、操作
简单 、灵敏性高且重复性好等优点 ,被认为是非常理
想的分子标记 。本实验首次运用 ISSR-PCR技术对
7个野生黄连居群的 78个个体进行分析 ,旨在揭示
黄连的遗传多样性及其遗传结构 ,了解其种内变异 ,
为黄连这一重要药用资源的保护和育种奠定理论基
础 。
1　材料和方法
1.1　材料:实验所用材料采自重庆野生黄连的主要
分布区:城口厚坪 、龙田 ,巫溪白果 ,巫山当阳 ,南川
金佛山 ,石柱黄水和黔江五里共 7个居群 。各居群
随机选取 10 ～ 12个样本 ,收集当年生嫩叶 ,低温条
件下带回实验室洗净 、晾干 ,冻于-80 ℃的超低温
冰箱中备用。居群的产地 、样本数 、编号及居群生长
状况见表 1。
1.2　仪器与试剂:扩增仪 、核酸蛋白分析仪 、电泳
仪 、凝胶成像系统均为 Bio-Rad公司 ,引物(上海生
工生物工程有限公司), dN TP(Promega公司), Taq
DNA 聚合酶(Promega 公司), Mg2+(上海生工
生物工程有限公司), Buf fer(上海生工生物工程有
表 1　用 ISSR分析的不同居群的黄连
Table 1　Analysis of C. chinensis in different
populations by ISSR
编号 产地 样本数 居群状况
CK HP 城口厚坪　 10 野生
CK LT 城口龙田　 12 野生
WXBG 巫溪白果　 10 野生
WXDY 巫山当阳　 12 野生
NC JF 南川金佛山 12 野生
SZH S 石柱黄水　 10 野生
QJWL 黔江五里　 12 野生
总计 78
限公司), DNA M arker(TakaRa), PVP 、β-巯基乙
醇 、CTAB(Sigma),其余为国产分析纯试剂 。
1.3　基因组 DNA 的提取:本实验中采用改良后的
CTAB法[ 12] 提取黄连的基因组 DNA ,所提 DNA 先
用 1.0%琼脂糖凝胶进行电泳 ,染色后拍照 ,选择带
型清晰 、无拖尾的作为备用 ,然后再在核酸蛋白分析
仪上测其原始浓度 ,最后统一稀释至 40 ng/μL ,供
ISS R-PCR实验所用。
1.4　ISSR 引物的筛选:ISSR-PCR 反应所用的引
物由上海生工生物工程有限公司合成 。共从 58 个
随机引物(17 ～ 18 bp)中筛选出 12个(表 2)扩增条
带清晰 、多态性明显 、反应稳定的引物用于 7个居群
的 78个个体的扩增 ,每个选定的引物至少重复扩增
2次 。每条引物退火温度都进行单独摸索 ,实际退
火温度一般在其 Tm 值 1 ～ 3 ℃附近变动。
表 2　实验中所用 12个引物的序列
Table 2　Sequence of 12 primers in experiment
编　号 　序列 实际退火温度/ ℃
UBC810 (GA)8 T 54.0
UBC811 (GA)8C 53.5
UBC823 (TG)8C 54.5
UBC824 (TC)8G 54.5
UBC826 (AC)8C 54.0
UBC834 (AG)8YT 55.0
UBC835 (AG)8YC 54.5
UBC840 (GA)8YT 53.5
UBC842 (GA)8YG 56.0
UBC847 (CA)8RC 57.5
UBC855 (CA)8YT 57.0
UBC857 (AC)8YG 58.5
1.5 　PCR 扩增及产物检测:ISS R-PCR 反应在
25 μL的 PCR 反应体系中进行 , 内含 1 ×PCR
Buffer ,1.5 mmol/L M g2+ , 200 μmol/ L dN TP ,0.3
·1631·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 10 期 2009年 10 月
μmo l/L引物 ,40 ng 模板 , 1.0 U Tag DNA 聚合酶。
扩增程序为 94 ℃预变性 5 min ,然后进行 35个循
环:94 ℃变性 30 s ,(据不同引物退火温度)复性 60
s ,72 ℃延伸 90 s循环结束后 72 ℃延伸 7 min , 4 ℃
保存。扩增产物在含 goldview(1%)的 1.5%的琼
脂糖凝胶中电泳分离 1.5 h ,电压 5 V/cm 。用 DL
2 000的 DNA marker(100 ～ 2 000 bp)作为标记 ,电
泳结束后在 Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像系统下
观察并拍照记录。
1.6　统计分析与数据处理:每个引物经过重复扩
增 、电泳两次 ,选取稳定清晰的条带进行统计分析。
电泳图谱的每条带(DNA 片段)均为一个分子标记 ,
代表一个引物的结合位点。根据分子标记的迁移率
及有无来统计所有的二元数据 ,有带(显性)记为 1 ,
无带(隐性)记为 0 ,强带和弱带的赋值均为 1。采用
POPG EN32 软件 ,计算各居群的多态位点百分率
(PPL),Nei′s基因多样性指数(H),Shannon′s多态
性信息指数(I),基因分化系数(Gst),居群总基因多
样性(Ht),居群内基因多样性(Hs),Nei′s遗传一致
度(I)和遗传距离(D),并根据 Nei′s遗传距离进行
UPGMA 聚类分析 ,构建系统树状图。
2　结果与分析
2.1　黄连的遗传多样性:通过 12 个引物对黄连 7
个居群的 78 个个体进行了 ISSR 分析 ,共检测到
106个位点 ,相对分子质量均在 100 ～ 2 000 bp(图
1), 其中多态性位点 72 个 , 多态性位点比率为
67.92%。平均每条引物扩出条带 8.8条 ,多态性带
为 6.0条 。Nei′s 基因多样性指数 H =0.180 3 ,
Shannon′s多态性信息指数 I=0.283 2。黄连不同
群体的多态位点百分率在 42.35%～ 52.21%,其中
最高的是石柱黄水居群(SZHS),为 52.21%,南川
金佛山居群(NCJF)次之 ,为 50.65%, 最低的是黔
江五里居群(QJWL),为 42.35%,Nei′s基因多样性
指数(H)范围为0.161 9 ～ 0.248 6 , Shannon′s多态
性信息指数范围(I)为 0.264 7 ～ 0.302 1(表 3)。
Nei′s基因多样性指数和 Shannon′s多态性指数的
大小与各居群多态位点百分率的高低趋势基本一
致 ,各项系数是石柱黄水居群(SZHS)最高 ,黔江五
里居群(QJWL)最低。
2.2　黄连不同居群的遗传分化分析:根据总的基因
多样性(Ht)和居群内遗传多样性(Hs)来计算居群
间遗传差异在总遗传变异中所占的比例(Gst)。黄
连各居群的总基因多样度(Ht)为 0.283 2 ,居群内
遗传多样度(Hs)为0.107 4 ,居群间的遗传分化指
图 1　引物 UBC855 对部分个体的扩增结果(图上所标
数字为个体的编号)
Fig.1　ISSR Amplified products generated by UBC855
to different samples of C. chinensis(numerals
in figure are No.of samples)
表 3　黄连的遗传多样性
Table 3　Genetic diversity of C. chinensis
居群 个体数 多态位点数
多态位点
百分率/ %
Nei′s
指数(H)
Shannon′s
指数(I)
CKHP 10 41 48.68 0.186 7 0.278 6
CKLT 12 47 46.06 0.171 5 0.264 3
WXBG 10 42 43.53 0.168 3 0.257 1
WSDY 12 51 45.89 0.173 2 0.272 8
NCJF 12 49 50.65 0.221 8 0.286 4
SZHS 10 52 52.21 0.248 6 0.302 1
QJWL 12 43 42.35 0.161 9 0.264 7
总计 78 72 67.92 0.180 3 0.283 2
数(Gst)为0.681 5。这表明有 68.15%的变异是存在
于居群间的 ,而 31.85%的变异是存在于居群内的 。
居群的遗传分化表明 ,黄连居群内部具有较低的遗
传分化 ,绝大部分的遗传分化存在于居群间。
2.3　黄连居群间的遗传距离和聚类分析:黄连 7个
居群的 Nei′s遗传一致度(I)为 0.832 1 ～ 0.912 7 ,
遗传距离(D)为 0.089 4 ～ 0.184 6(表 4)。其中黔
江五里居群(QJWL)与南川金佛山居群(NCJF)之
间的遗传距离最大 ,为 0.184 6 ,这也表明两者之间
的遗传差异性最大。同样 ,两者的遗传一致度也是
最低的 ,为 0.832 1。城口厚坪(CKHP)和城口龙田
(CKLT)两个居群之间的遗传距离最小 ,为 0.089 4。
同样 ,两者的遗传一致度是最高的 ,为 0.912 7。
表 4　黄连 7 个居群遗传一致度 I(对角线以上)和遗传距离
D(对角线以下)
Table 4　Genetic similarity coefficient I(above diagonal)
and genetic distance D(below diagonal)
in seven populations of C. chinensis
居群 CKHP CK LT WXBG WSDY NCJF SZHS QJWL
CKHP ＊＊＊＊ 0.912 7 0.846 0 0.873 4 0.841 6 0.852 1 0.850 7
CKLT 0.089 4 ＊＊＊＊ 0.832 4 0.862 3 0.839 6 0.853 7 0.851 6
WXBG 0.164 0 0.180 6 ＊＊＊＊0.860 3 0.859 2 0.841 7 0.840 3
WSDY 0.138 6 0.140 7 0.150 3 ＊＊＊＊ 0.851 7 0.842 7 0.841 8
NCJF 0.172 8 0.177 3 0.153 2 0.157 6 ＊＊＊＊ 0.834 6 0.832 1
SZHS 0.156 4 0.152 1 0.172 6 0.168 4 0.179 2 ＊＊＊＊0.914 6
QJWL 0.158 3 0.157 2 0.173 0 0.172 4 0.184 6 0.097 4 ＊＊＊＊
·1632· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 10 期 2009年 10 月
　　黄连的 UPGMA 聚类图(图 2)显示:7个野生
居群中城口的两个居群(CKHP 和 CKLT)首先聚
在一起 ,这也正说明了两个居群之间的遗传距离最
近 ,遗传相似度最大 。随后进行聚类的是石柱黄水
居群(SZHS)和黔江五里居群(QJWL)。巫山当阳
居群(WSDY)又与城口的两个居群进行聚类 ,这说
明巫山居群与当阳居群的遗传距离较近 ,相似性较
高 ,亲缘关系较近。随后巫溪白果(WXBG)居群又
与巫山和城口聚在一起 ,这说明巫山 、巫溪和城口 3
个地区的 4个居群之间的亲缘关系较近。最后进行
聚类的是南川金佛山居群(NCJF),这说明南川金佛
山居群与其他的 6个居群的遗传距离最远 ,亲缘关
系也最远。总的来看 ,地理分布相近的居群都聚在
了一起 ,聚类结果显示出与地理分布较为明显的一
致性。
图 2　黄连 7 个居群的 UPGMA聚类图
Fig.2　Dendrogram of UPGMA cluster analysis
for seven populations of C. chinensis
3　讨论
3.1　黄连的遗传多样性:黄连物种水平的多态位点
为 67.92%,这表明黄连具有较高的遗传多样性 ,并
且各居群间的遗传多样性明显低于种水平的遗传多
样性 ,最低的为 42.53%,最高的为 52.21%。野生
黄连(PPB =67.92%, H =0.180 3)比其他野生的
多年生濒危草本植物如延龄草[ 13](PPB=34.07%,
H =0.033 7)的遗传多样性要高得多 。另外 ,陈大
霞[ 14] 对栽培黄连的 SRAP-PCR进行了研究 ,结果
表明栽培种黄连的 PPB =43.48%,这明显低于本
研究结果 67.92%,其遗传相似性系数为 0.877 0 ～
0.951 9 ,而本研究的遗传相似性系数 0.832 1 ～
0.912 7 ,这说明野生黄连比栽培黄连具有较大的遗
传距离 ,这都符合栽培种在长期的栽培驯化和近亲
繁殖中遗传多样性低于野生种的现象 。从上面的分
析来看黄连具有较高的遗传多样性 。另外 ,遗传多
样性不仅存在于居群内 ,也存在于居群间 ,实验结果
表明黄连居群间的遗传多样性较高 ,而居群内的遗
传多样性则相对较低 。由于黄连喜阴凉湿润的环
境 ,常分布在海拔 1 200 ～ 1 700 m 的高山林下 ,居
群之间有不适生境的阻隔 ,野外所见的黄连居群基
本上都是成岛屿状分布 ,这就使得基因之间的交流
变得困难 ,造成近交程度加深 。此外 ,野外观察黄连
的传粉方式大部分是自花传粉 ,近交或自交都可以
导致杂合度的降低从而影响个体的适合度 ,进而导
致遗传多样性的丧失 ,从而使得居群内的遗传多样
性降低。并且黄连种子自然条件下萌发率特别低 ,
黄连亦会采用营养繁殖的方式生长 ,这都造成了居
群内遗传多样性的降低。
3.2　黄连的遗传分化:根据 Nei′s遗传分化指数估
算的 7个居群间的遗传分化系数0.681 5 ,说明居群
间的遗传变异占总的基因多样性的 68.15%,居群
内只占 31.85%。遗传分化的分析结果显示 ,大量
的变异主要存在于居群之间 ,只有少量的变异存在
于居群内部。居群遗传结构在很大程度上依赖于生
存环境空间上的异质性 ,黄连居群较为严格地按照
空间距离之间的联系聚在了一起 ,这可能与生境有
关。地理距离近的居群生境相似 ,地理距离远的居
群生境差异相对较大 。在环境选择压力的作用下 ,
不同居群之间的分子变异可能与地理位置联系比较
大。金佛山居群的独特的地理生态环境可能是导致
了变异基因型个体的产生 ,从而使得金佛山居群与
其他居群形成很大的差异。城口 、巫溪和巫山 3 个
地区的 4个居群聚在一起 ,所产黄连通常称为北岸
连 ,而石柱和黔江的 2个居群则聚在一起 ,所产黄连
通常称为南岸连 ,这充分反映了黄连品质划分与地
理上的相关性。综合黄连生境片状分布的分析 ,黄
连邻近居群相似的基因频率 ,可能是由于生境选择
压力所致 。
3.3　黄连的保护策略分析:遗传多样性是物种避免
灭绝而长期生存的前提 ,遗传多样性的减少会降低
居群短期和长期两方面适应环境变化的能力[ 15] 。
因此 ,保护黄连遗传多样性对于保护其药用资源具
有重要的意义。黄连由于其独特的药用价值 ,导致
了大量而无节制的采挖和野生黄连生境的人为破
坏 ,这使得野生黄连的遗传多样性大大降低。根据
野外观察的实际情况 ,寻找到野生黄连居群已经比
较困难 ,大规模的黄连居群几乎不可见。为切实保
护好野生黄连优质的种质资源和药用资源 ,实现资
源的可持续利用 ,笔者提出以下保护策略及措施。
首先 ,基于黄连本身的生物学习性 ,可对其实施
就地保护和迁地保护[ 16] 。在就地保护时除了对所
有种群进行必要的保护外 ,应选择遗传多样性程度
高的居群进行重点保护 ,如石柱黄水和南川金佛山
·1633·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 10 期 2009年 10 月
居群。同时由于黄连的遗传多样性主要保持在居群
之间 ,在迁地保护时应尽量在较多的居群中取样 ,而
不是每个居群取很多样品。综合这两方面 ,才能全
面保护黄连的遗传多样性。
其次 ,保护和重建黄连居群的适宜生境 ,黄连本
身对生长环境要求特殊 ,一般生长在海拔 1 200 m
以上的低温潮湿环境 ,要求有林木庇荫的环境 ,要求
肥沃富含氮的土壤。保护好生境 ,就能保证它正常
生长 、繁育 ,从而保护其遗传多样性 ,为其适应自然
选择打下基础 。
再次 ,针对黄连种子具有后熟性 ,需经过长期的
胚后熟和低温休眠才能出土成苗[ 17] ,而且结实率低
等繁殖生物学特性。一方面 ,可提供其种子正常萌
发生长的生境;另一方面 ,可研究人为加速其种子萌
发的措施 ,即在果实成熟期获取种子 ,通过人工处理
缩短种子休眠期[ 18] ,播种于适宜的生长环境 ,以增
加种群中实生苗的数目 。
最后 ,建议在人为活动较强的地区加大宣传力
度 ,有效控制对黄连的采挖 ,并且可以尝试人为创造
居群的基因交流和重组条件 ,更好地维持其遗传多
样性水平。
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北柴胡移植试管植株与种子植株植物学性状分析
李　博 ,郝贵茹 ,常　琦 ,李晨龙 ,王丽荣 ,郝建平＊
(山西大学生命科学与技术学院 , 山西 太原　030006)
摘　要:目的　通过对移植试管植株与种子植株植物学性状的对比分析 , 为优质北柴胡快速繁育方法的建立和推
广提供科学依据。方法　选取有效药用成分高 、遗传稳定性好的北柴胡栽培类型进行快速繁殖 ,比较移植试管植
株与种子植株的植物学性状。结果　北柴胡移植试管植株在分蘖数 、分枝数 、有效花序数以及根质量等方面明显
优于种子植株。结论　通过快速繁殖和试管苗的规模化种植 ,在保持北柴胡优良性状的同时 , 可以收获多于种子
植株的根器官和种子。
关键词:北柴胡;快速繁殖;移植试管植株;种子植株;植物学性状
中图分类号:R282.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:0253-2670(2009)10-1634-04
·1634· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 10 期 2009年 10 月
＊ 收稿日期:2009-01-11　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　基金项目:国家级大学生创新性实验计划项目(081010802);山西省科技攻关项目(051077-2)作者简介:李　博(1987—),男 ,山西省绛县人 ,山西大学 2005级生物科学专业本科生 ,主要从事植物细胞工程方面的研究工作。＊通讯作者　郝建平　E-mail:jp hao@s xu.edu.cn