全 文 ：山莨菪碱及其大鼠肠内菌体外代谢物的液相色谱2质谱法分析
陈怀侠1 ,2 ,杜 　鹏1 ,韩凤梅1 ,陈 　勇1 3　
(1. 湖北大学 中药生物技术省重点实验室 ,湖北 武汉 　430062 ;2. 湖北大学化学化工学院 ,湖北 武汉 　430062)
摘 　要 :目的 　用液相色谱2电喷雾离子阱串联质谱联用法研究山莨菪碱在大鼠肠内菌中的代谢。方法 　以山莨
菪碱优化色谱及质谱条件 ,总结其色谱及质谱行为规律。将山莨菪碱与大鼠肠内菌体外厌氧温孵培养 ,并与空白
样品及山莨菪碱对照品进行比较 ,依据被测物的多级质谱数据 ,鉴定代谢物并阐述其结构。结果 　在温孵液中发
现了山莨菪碱的脱水及水解代谢产物 ,即脱水山莨菪碱、6β2羟基托品和托品酸。结论 　该方法灵敏、快速、简单 ,适
合于药物代谢分析。
关键词 :山莨菪碱 ;液相色谱串联质谱法 ;代谢物
中图分类号 :R286. 1 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0420563203
Analysis of anisodamine and its in vit ro metabolites in rat intestinal flora by LC2MSn
CH EN Huai2xia1 ,2 , DU Peng1 , HAN Feng2mei1 , CH EN Yong1
(1. Hubei Province Key Laboratory of Bio2Technology of Chinese Materia Medica , Hubei University , Wuhan 430062 ,
China ; 2. College of Chemist ry and Chemical Engineering , Hubei University , Wuhan 430062 , China)
Abstract : Objective 　Anisodamine and it s metabolites in rat intestinal flora were analysed by liquid
chromatograp hy2tandem mass spect romet ry (L C2MSn ) . Methods 　The chromatograp hic and mass spect ro2
met ric conditions were optimized using anisodamine standard , The chromatograp hic and mass spect rome2
t ric behavior pat terns of anisodamine were summarized. Anisodamine was incubated together with rat in2
testinal flora i n v i t ro under lack of oxygen condition. Analysis and st ruct ural identification of t he metabo2
lites were performed by comparing t heir changes in molecular masses , retention2time , and f ull scan MSn
spect ra with those of t he parent drug and blank plasma. Results 　The result s revealed t hat the parent drug
and it s dehydrolyzed and hydrolyzed metabolites (apoanisodamine , 6β2hydroxyt ropine , and t ropic acid)
were found in the incubation solution. Conclusion 　This method is sensitive , rapid , and simple , and suit2
able for t he analyses of drugs metabolites.
Key words : anisodamine ; liquid chromatograp hy2tandem mass spect romet ry (L C2MSn ) ; metabolites
　　传统中药多以汤剂为主 ,研究中药活性成分的
肠道代谢对于了解药物体内作用过程 ,指导临床合
理用药具有重要的理论意义。液相色谱2电喷雾离
子阱串联质谱 (Liquid chromatograp hy2elect ro sp ray
ionization ion t rap tandem mass spect romet ry , L C2
ESIITMSn ) 联用技术是现今对药物代谢研究最有
力的工具之一[ 1～3 ] 。该方法具有灵敏度高 ,专属性
好 ,样品处理简单、快速等特点 ,特别是多级质谱能
够提供化合物丰富的结构信息 ,因此 ,该联用技术已
经成为代谢物研究的首选方法之一。山莨菪碱是从
茄科植物唐古特山莨菪 A nisod us t ang uticus (Max2
im. ) Pascher 根中分离提取的一种托品烷类生物
碱。山莨菪碱有着广泛的药理活性 ,如解痉、抗休克、
改善微循环、对细胞的保护作用等 ,主要用于治疗
心、脑、肝、肾、神经系统疾病等[ 4 ] 。本实验采用离体
实验的代谢研究方法 ,用富含肠内菌的大鼠肠内容
物与山莨菪碱在厌氧条件下温孵 ,以 L C2MSn 技术 ,
在温孵液中鉴定出了原药及其脱水和水解代谢物。
1 　仪器与试剂
L CQDuo 型液相色谱2电喷雾离子阱质谱联用仪
(U SA , San Jose) ,配有 TSP AS3000 自动进样器和
L CQ Xcalibur 112 软件处理系统 ; T GL —16C 高速
离心机 (上海安亭科学仪器厂) ; Anaero Pouch TM2
Anaero 08 G05A223 厌氧培养袋和厌氧培养发生袋
(日本三菱瓦斯化学株式会社) ;BF2000 氮气吹干仪
(北京八方世纪科技有限公司) 。
·365·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
3 收稿日期 :2008206209　　　
基金项目 :湖北省中药生物技术重点实验室开放基金 (2004CTM001) ;湖北大学人才专项经费资助 (ky2006004)
作者简介 :陈怀侠 (1966 —) ,女 ,安徽人 ,博士 ,副教授 ,分析化学研究室主任 ,1985 年毕业于武汉大学化学系 ,1988 年获武汉大学化学系
硕士学位 ,2005 年获武汉大学化学与分子科学学院博士学位 ,研究方向为药物代谢分析。
Tel/ Fax : (027) 62056293 　E2mail :hxch @hubu. edu. cn
氢溴酸山莨菪碱 (中国药品生物制品检定所 ,批
号 05129404) 。甲醇为色谱纯 ,水为超纯水 ,其他试
剂均为分析纯。Wistar 大鼠 200 g ,购于湖北省实
验动物研究中心 ,合格证 :SCXK(鄂) 200322005。
2 　方法与结果
211 　厌氧培养液的配制[5 ,6 ] :3715 mL A 液 (0178 %
KH2 PO4 ) ,3715 mL B 液 (0147 % KH2 PO4 ,1118 %
NaCl , 112 % ( N H4 ) 2 SO4 , 0112 % CaCl2 , 0125 %
MgSO4 ·H2 O) ,50 mL C 液 (8 % Na2 CO3 ) ,015 g
L2半胱氨酸 ,2 mL 25 %的 L2抗坏血酸 ,牛肉膏 1 g ,
蛋白胨 1 g ,营养琼脂 1 g。将以上各种溶液和试剂
混合后 ,加蒸馏水至 1 L ,用盐酸调节溶液的 p H 值
为 715～810。
212 　肠内菌培养液的制备[7 ] :取大鼠肠内容物 ,按
015 g ∶115 mL 的比例加入厌氧培养液 ,用玻璃棒
快速搅拌均匀 ,用医用纱布滤过得到含菌培养液。
213 　山莨菪碱的代谢 :于装有上述肠内菌培养液的
培养皿中加入山莨菪碱 ,使培养液中山莨菪碱的质
量浓度为 50μg/ mL ,并同时做空白对照实验。将培
养皿放入厌氧培养袋中 ,打开厌氧发生袋外袋 ,迅速
将其内袋置于厌氧培养袋中 ,密封 ,恒温 37 ℃培养。
分别于 4、24 h 取样 1 mL ,以醋酸乙酯萃取 2 次 ,合
并有机相 ,37 ℃时氮气挥干 ,残留物用流动相溶解
后 ,以 13 000 r/ min 离心 10 min ,取上清液进行 L C2
MSn 分析。
214 　色谱条件 : Agilent 公司 A ICHROM TM ReliA2
sil C18柱 (150 mm ×2 mm , 5μm) ,并配有 Agilent
公司相同柱填料的保护柱 (1215 mm ×416 mm , 5
μm) ;流动相为甲醇/ 0101 %三乙胺溶液 (用甲酸调
节至 p H 315) (60 ∶40) ,柱温为 40 ℃,体积流量为
012 mL/ min。
215 　质谱条件 :采用电喷雾离子化方式 ,检测离子
为正离子。扫描范围 m/ z 100～1 000 ,自动进样器
进样 ,离子源喷射电压 510 kV ,毛细管电压 45 V ,
毛细管温度 200 ℃,氮气为鞘气 ,其流速为 40 个单
位 ,其他参数均由质谱自动优化程序得到。通过碰
撞诱导解离获得母分子的多级质谱 ,离子阱中的碰
撞气体为氦气 ,优化的多级质谱相对碰撞能量为
30 %。采用全扫描一级质谱、全扫描二级质谱及三
级质谱等方式进行测定。
216 　山莨菪碱的 L C2MS 及 L C2MSn 分析 :山莨菪
碱的一级质谱以分子离子峰 m/ z 306 [ M + H ] + 为
基峰 ,没有聚合及其他加合现象 ,其二级质谱 (相对
碰撞能量为 30 %)及其 L C2MSn 全扫描色谱见图 1。
可见山莨菪碱的分子离子失去一分子水产生碎片
m/ z 288 [ M + H - H2 O ] + ,而分子离子失去一分子
甲醛产生碎片 m/ z 276 [ M + H - HCHO ] + 。其二
级质谱中丰度最高的碎片 m/ z 140 是其母分子离子
失去托品酸产生的。碎片离子 m/ z 122 是母离子
m/ z 306 失去中性碎片 C9 H10 O3 + H2 O 而产生。该
碎片离子 m/ z 122 失去 N H2 CH3 产生碎片离子
m/ z 91。显然 ,碎片 m/ z 140、122、91 是山莨菪碱
分子离子的特征子离子 ,而 C9 H10 O3 、C9 H12 O4 是其
特征中性碎片丢失。这些特征分子离子和特征中性
碎片丢失是山莨菪碱生物体内代谢物鉴定的依据。
m/ z
图 1 　山莨菪碱的二级质谱( A)和 LC2MS2 色谱图( B)
Fig. 1 　Full scan MS2 spectra ( A) and LC2MS2
chromatogram ( B) of anisodamine
217 　培养液中阿托品及其代谢物分析 :按实验方法
获得山莨菪碱大鼠肠内菌培养液 ,样品经预处理后 ,
进行 L C2MS2 分析。将分析结果与空白实验、山莨
菪碱对照品相比较 ,确定药物的肠内菌代谢产物。
如此 ,在培养液中发现了原药及其代谢物 ,其质子化
的分子离子分别是 m/ z 158、288、306 ,以及负离子
扫描中的去质子分子离子 m/ z 165。这些组分的
L C2MS2 色谱及质谱图见图 2、3。其中质子化的分
子离子 m/ z 306 的色谱保留时间、MS2 质谱和原药
完全相同 ,即 m/ z 306 对应于原药。
质子化的分子离子 m/ z 158 的 MS2 质谱中出
现原形药的特征碎片离子 m/ z 140、122 ,而且该二
级质谱和原药的 m/ z 306 →158 MS3 质谱完全相
同 ,因此 ,该分子离子对应于山莨菪碱大鼠肠内菌作
用的水解产物 ,即 6β2羟基托品 ,在负离子测试中 ,
m/ z 165 的 MS2 质谱中存在 m/ z 147 ( [ M2H2
H2 O ] - )和 121 ( [ M2H2CO2 ] - ) ,说明该组分对应于
山莨菪碱水解产物的另一部分 ,即托品酸。
质子化的分子离子 m/ z 288 比原药的分子离子
m/ z 306 少 m/ z 18 ,在其二级质谱中出现了原形药
的特征碎片离子 m/ z 140、122 ,由此推论该组分对
应于山莨菪碱的脱水产物 ,而且脱水位置在托品酸
·465· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
部分 ,即脱水山莨菪碱。
综上所述 ,山莨菪碱大鼠肠内菌的代谢主要是
水解及脱水 ,山莨菪碱大鼠肠内菌代谢途径见图 4。
实验结果显示 ,4 h 及 24 h 温孵溶液的测定没有差
异 ,而且原药的色谱及质谱峰都很强 ,代谢物的峰强
度都非常弱 ,即山莨菪碱在肠内菌中的代谢很弱。
3 　讨论
山莨菪碱是含有醇羟基的内酯型化合物 ,实验
结果显示了该药物在大鼠肠内菌中的主要代谢是水
解和脱水作用 ,符合药物代谢一般规律 ,为该药物的
临床应用和药理研究提供理论依据。
电喷雾离子阱多级质谱能够提供丰富的分子结
构信息 ,依托药物体内代谢规律 ,即药物与其代谢物
分子结构存在相关性 ,能够在没有对照品的情况下 ,
快速、简便、灵敏地鉴定代谢物 ,阐述代谢物分子结
构 ,总结药物代谢规律。
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