全 文 ：HPLC法测定华山参滴丸中消旋山莨菪碱 、
东莨菪碱及阿托品的含量
周军 1 ,苗淑森 2 ,胡永峰 3 ,曲佳1 ,吕曙华1
(1.天津市药品检验所 ,天津 300070;2.天津中新药业集团研究中心 ,天津 300457;
3.天津中新药业集团有限公司第六中药厂 , 天津 300401)
摘要　目的:建立 HPLC法同时测定华山参滴丸中消旋山莨菪碱 、东莨菪碱及阿托品的含量。方法:采用资生堂 Capcell-Pak
C18(4.6mm×250mm, 5 μm)色谱柱 ,以乙腈 -醋酸盐缓冲液 (5∶95)为流动相 A, 乙腈 -醋酸盐缓冲液 (15∶85)为流动相 B,
进行梯度洗脱(0 ～ 30 min, 60% A※ 35% A;30 ～ 40 min, 35% A※30% A;40 ～ 44 min, 30% A※ 20% A;44 ～ 45 min, 20% A※
60% A;45 ～ 60 min, 60% A),流速 1.0 mL· min-1 , 检测波长 210 nm;柱温 30 ℃。结果:消旋山莨菪碱 、东莨菪碱及阿托品的
线性范围分别为 0.08 ～ 1.82, 0.07 ～ 1.65, 0.04 ～ 1.03 μg(r=0.9999);平均回收率分别为 99.1%(RSD=1.8%), 97.0%
(RSD=1.6%), 104.0%(RSD=0.84%)。结论:所建立的 HPLC法可同时测定华山参滴丸中消旋山莨菪碱 、东莨菪碱及阿托
品的含量。
关键词:高效液相色谱法;华山参滴丸;消旋山莨菪碱;东莨菪碱;阿托品
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2010)05-0838-04
　第一作者　Tel:13820329907;E-mail:happy76dragon@yahoo.com.cn
HPLCanalysisofraceanisodamine, scopolamineandatropine
inHuashanshendrippingpils
ZHOUJun1 , MIAOShu-sen2 , HUYong-feng3 , QUJia1 , L Shu-hua1
(1.TianjinInstituteofDrugControl, Tianjin300070, China;
2.TianjinZhongxinPharmaceuticalGroupCorporationLTD.R＆DCenter, Tianjin300457, China;
3.TianjinZhongxinPharmaceuticalGroupCorporationLTD, No.6TraditionalChineseMedicineFactory, Tianjin300401, China)
Abstract　Objective:TodevelopanHPLCmethodfordeterminationofraceanisodamine, scopolamineandatropine
inHuashanshendrippingpils.Methods:TheanalysiswascarriedoutonaCapcel-PakC18(4.6mm×250mm,
5 μm)column;Themobilephasewascomposedofacetonitrile-acetatebufersolution(5∶95)(A)andacetonitrile
-acetatebufersolution(15∶85)(B)withgradientelution(0-30 min, 60% A※35% A;30-40 min, 35% A※
30% A;40-44min, 30% A※20%A;44-45min, 20% A※60% A;45-60 min, 60%A)andtheflowratewas
1.0mL·min-1;Thedetectionwavelengthwas210nm, andthecolumntemperaturewas30℃.Results:Theline-
arrangesofraceanisodamine, scopolamineandatropinewere0.08 -1.82, 0.07 -1.65 , 0.04 -1.03 μg(r=
0.9999), respectively;Theaveragerecoveries(n=6)were99.1%(RSD=1.8%), 97.0%(RSD=1.6%),
104.0%(RSD=0.84%), respectively.Conclusion:Thismethodissimpleandcanbeusedtodeterminetheabove
threecomponentswithsatisfactoryaccuracyandrepeatability.
Keywords:HPLC;Huashanshendrippingpils;raceanisodamine;scopolamine;atropine
华山参滴丸是由华山参药材 [ 1] 制成的止咳平
喘药 ,临床用于慢性支气管炎 、喘息性气管炎 ,其质
量标准收载于中国药典 1995年版 1997年增补本 ,
本品为华山参浸膏制成的滴丸 ,有效成分主要为托
烷类生物碱 ,原标准采用酸性染料比色法测定总生
物碱含量 ,但提取方法烦琐 ,结果重现性较差 。消旋
山莨菪碱 、东莨菪碱及阿托品是华山参滴丸生物碱
类物质中的主要成分 ,即是其有效成分 ,同时又是有
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毒成分 ,为了提高该品种的质量标准 , 本文建立
HPLC法同时测定上述 3种成分的含量 ,该方法简
单 、快速准确 ,对控制和提高华山参滴丸的质量有
重要意义。
1　仪器与试药
Agilent1200高效液相色谱仪 ,配有在线脱气
机 、四元泵 、VWD检测器 、自动进样器 、ChemStations
色谱工作站 。SIBATA超声波清洗器。
乙腈 、四氢呋喃(天津市康科德科技有限公司)
为色谱纯 ,水为去离子水 ,醋酸钠 、冰醋酸 、三乙胺
(天津市康科德科技有限公司)为分析纯。对照品
消旋山莨菪碱(批号 100249-199501)、氢溴酸东莨
菪碱(批号 100049 -200308)、硫酸阿托品 (批号
100040-200510)均购自中国药品生物制品检定所 ,
含量测定用 。华山参滴丸样品 ,天津中新药业集团
股份有限公司第六中药厂 ,规格为每丸 0.017 g,批
号为 07001 , 07002 , 07003。
2　溶液的制备
2.1　对照品溶液 取对照品消旋山莨菪碱 、氢溴酸
东莨菪碱(60℃干燥 1 h后在 105℃干燥 3 h)及硫
酸阿托品(120℃干燥 3 h)适量 ,精密称定 ,加甲醇
制成每 1 mL分别含 0.15, 0.04, 0.1 mg的混合溶
液 ,即得。
2.2　供试品溶液 取样品适量 ,研细 ,精密称取细
粉 0.3 g, 置 10 mL量瓶中 , 加甲醇约 8 mL, 超声
(500 W, 40 kHz)30 min使溶解 ,放冷 ,加甲醇至刻
度 ,摇匀。将上述甲醇溶液置具塞离心管中 ,于冰箱
(-4℃)中冷冻 30 min(样品中的基质为聚乙二醇 ,
冷冻后析出), 取上清液 ,过 0.45 μm微孔滤膜 ,
即得。
3　色谱条件
色谱柱:资生堂 Capcel-PakC18(4.6 mm×
250 mm, 5 μm);流动相:以乙腈 -醋酸盐缓冲液
(5∶95)为流动相 A,乙腈 -醋酸盐缓冲液(15∶85)
为流动相 B,进行梯度洗脱(0 ～ 30 min, 60% A※
35% A;30 ～ 40 min, 35% A※ 30% A;40 ～ 44
min, 30% A※ 20% A;44 ～ 45 min, 20% A※60%
A;45 ～ 60 min, 60% A),醋酸盐缓冲液含 30 mmoL
· L-1醋酸钠 , 0.02%三乙胺 , 0.3%四氢呋喃 ,用冰
醋酸调 pH6.0;流速 1.0 mL· min-1;检测波长 210
nm;柱温 30℃。进样量 5 μL。在此色谱条件下 ,精
密吸取对照品溶液 、供试品溶液进样 ,结果消旋山
莨菪碱 、东莨菪碱 、阿托品的保留时间分别为
15.1, 19.8, 23.1, 33.3 min;分离度均大于 1.5;理
论板数按阿托品峰计算应不低于 10000;样品中其
他成分对消旋山莨菪碱 、东莨菪碱 、阿托品的测定
无干扰 。见图 1。
图 1 对照品(A)、样品(B)、空白溶剂(C)色谱图
Fig1 HPLCchromatogramsofreferencesubstances(A), sample(B)
andnegativesolvent(C)
1, 2.消旋山莨菪碱(raceanisodamine) 3.东莨菪碱(scopolamine)
4.阿托品(atropine)
4　方法学考察
4.1　线性关系的考察 取对照品消旋山莨菪碱 、氢
溴酸东莨菪碱 、硫酸阿托品适量 ,精密称定 ,加甲醇
制成消旋山莨菪碱 、氢溴酸东莨菪碱 、硫酸阿托品浓
度为 0.38, 0.44, 0.25 mg· mL-1的混合对照品溶
液 ,精密吸取上述混合溶液 0.5, 2, 5, 10, 12 mL,分
别置 25mL量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,分别
精密吸取 10μL,注入液相色谱仪 ,按上述色谱条件
分析 ,分别测定各自峰面积 , 以对照品进样量 X
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(μg)为横坐标 ,峰面积 Y为纵坐标 ,求得消旋山莨
菪碱 、东莨菪碱 、阿托品回归方程分别为:
Y=17.14+1.107×103X r=0.9999
Y=0.2142+1.134×103X r=0.9999
Y=1.167+1.194×103X r=0.9999
结果表明消旋山莨菪碱进样量在 0.08 ～ 1.82 μg,
东莨菪碱在 0.07 ～ 1.65 μg,阿托品在 0.04 ～ 1.03
μg(氢溴酸东莨菪碱折合成东莨菪碱系数为
0.7894;硫酸阿托品折合成阿托品系数为 0.8551)
范围内与峰面积具有良好的线性关系 。
4.2　进样精密度试验 取供试品溶液连续进样 6
次 ,记录峰面积 ,计算消旋山莨菪碱 、东莨菪碱 、阿托
品峰面积的 RSD(n=6)分别为 1.0%, 1.4%,
1.3%。
4.3　重复性试验 取同一批号(07003)样品适量 ,
研细 ,取 0.3g,共 6份 ,精密称定 ,按照 “2.2”项下方
法制备供试品溶液 ,在上述色谱条件下分别进样测
定 。结果样品中消旋山莨菪碱 、东莨菪碱 、阿托品平
均含量 (n=6)分别为 5.31, 1.07, 3.55 mg· g-1;
RSD分别为 0.63%, 0.97%, 0.51%。
4.4　稳定性试验 取同一供试品溶液分别在 0, 2,
4, 8, 12, 18, 24 h进样测定 ,结果消旋山莨菪碱 、东莨
菪碱 、阿托品峰面积的 RSD(n=7)分别为 1.2%,
1.3%, 1.3%。表明供试品溶液中消旋山莨菪碱 、东
莨菪碱 、阿托品在 24h内均稳定。
4.5　回收率试验 取同一批号(07003)已测知含
量的样品适量 ,研细 ,取 0.15 g,共 6份 ,精密称定 ,
置 10 mL量瓶中 ,分别精密加入含消旋山莨菪碱
0.15mg· mL-1 、东莨菪碱 0.042mg· mL-1、阿托品
0.10mg· mL-1的甲醇溶液 5 mL,加甲醇约 3 mL,
按照 “ 2.2”项下方法制备溶液 ,在上述色谱条件下
进样测定 ,计算回收率 。结果消旋山莨菪碱 、东莨菪
碱 、阿托品平均回收率 (n=6)分别为 99.1%,
97.0%, 104.0%;RSD分 别 为 1.8%, 1.6%,
0.84%。
5　样品的测定
取 3个批号的样品 ,按照 “ 2.2”项下方法制备
供试品溶液 ,精密吸取供试品溶液及 “ 2.1”项下的
对照品溶液各 5 μL,注入液相色谱仪 ,在上述色谱
条件下进样测定 ,记录峰面积 ,按外标法计算含量 。
结果见表 1。
6　耐用性试验
采用 Agilent-1200高效液相色谱仪 ,按本文色
谱条件 ,分别以资生堂 Capcel-PakC18(4.6 mm×
表 1 华山参滴丸样品含量测定结果(mg·丸 -1)
Tab1 Contentsofraceanisodamine, scopolamineand
atropineinHuashanshendrippingpils(mgperpil)
批号
(LotNo.)
消旋山莨菪碱
(raceaniso-
damine)
东莨菪碱
(scopola-
mine)
阿托品
(atropine)
总生物碱
(totalalkaloids)
07001 0.090 0.018 0.059 0.167
07002 0.091 0.018 0.058 0.167
07003 0.090 0.018 0.060 0.167
250 mm, 5 μm)色谱柱 、PhenomenexC18(4.6 mm×
250 mm, 5 μm)色谱柱 、Dikma-KromasilC18(4.6
mm×250mm, 5 μm)色谱柱对 “5”项下 3个批号样
品的供试品溶液进行测定 ,计算样品中消旋山莨菪
碱 、东莨菪碱及阿托品的总量 。结果 ,不同色谱柱对
样品的含量测定结果无明显影响 。
7　讨论
7.1　提取方法的确定与考察 因生物碱及聚乙二
醇在甲醇中均易溶解 ,因此采用甲醇作为提取溶剂;
加入甲醇 8 mL分别超声 20, 30, 40 min,结果超声
30 min样品可完全溶解 ,因此超声提取时间定为 30
min。供试品溶液中聚乙二醇在重复多次进样后对
供试品溶液中色谱峰的分离有影响 ,因此采用甲醇
提取后冷冻的方式除去样品中的聚乙二醇 ,该提取
方法简单 、方便 ,试验重复性好。
7.2　流动相的选择 试验中参考文献比较 3种流
动相体系:①以乙腈 -0.01 mol· L-1十二烷基硫酸
钠水溶液(33∶67)为流动相 ,结果样品色谱中消旋
山莨菪碱色谱峰与杂质峰分离较差。②以甲醇 -醋
酸盐缓冲液(15∶85)为流动相(醋酸盐缓冲液含 30
mmol· L-1醋酸钠 , 0.02%三乙胺 , 0.3%四氢呋喃 ,
用冰醋酸调 pH6.0),试验中发现样品色谱中消旋
山莨菪碱第 1个峰包有其他杂质峰 [ 2] 。 ③以乙腈 -
醋酸盐缓冲液(5∶95)为流动相 A,乙腈 -醋酸盐缓
冲液(15∶85)为流动相 B(醋酸盐缓冲液含 30mmoL
·L-1醋酸钠 , 0.02%三乙胺 , 0.3%四氢呋喃 ,用冰
醋酸调 pH6.0),进行梯度洗脱 ,结果样品色谱中消
旋山莨菪碱 、东莨菪碱 、阿托品色谱峰与杂质峰分离
较好 ,分离度均大于 1.5;不同品牌色谱柱耐用性
好。
7.3　流动相的缓冲液中醋酸钠浓度及 pH的选
择 流动相中采用不同醋酸钠浓度(10, 20 , 30, 40
mmol· L-1)的醋酸盐缓冲液体系 ,均用冰醋酸调节
pH为 6.0,进行试验 ,结果以醋酸钠浓度为 30 mmol
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· L-1时上述 4个色谱峰分离效果较好。取醋酸钠
浓度为 30mmol·L-1的醋酸盐缓冲液 ,分别用冰醋
酸调节 pH为 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0,进行试验 ,结
果以 pH为 6.0时上述 4个色谱峰分离效果较好 。
因此确定缓冲液中醋酸钠的浓度为 30 mmol· L-1 ,
pH为 6.0。
7.4　检测波长的确定 取对照品溶液和供试品溶
液 ,使用二极管阵列检测器 ,在上述 “3”项的色谱条
件下进样测定。结果消旋山莨菪碱 、东莨菪碱 、阿托
品色谱峰的最大吸收波长分别为 210 nm、215 nm、
218nm。取同一供试品溶液分别采用上述 3个波长
进行测定 ,结果在 210nm波长下样品色谱图中阿托
品等色谱峰分离度最好 ,峰面积最大 ,故检测波长定
为 210nm。
7.5　柱温的选择 比较不同柱温(30, 35, 40℃)条
件下样品的分离情况 ,结果以柱温为 30℃时样品分
离较好 。
7.6　对照品系数的确定 氢溴酸东莨菪碱折算成
东莨菪碱系数为 0.7894。硫酸阿托品折算成阿托
品系数为 0.8551(中国药品生物制品检定所提供的
硫酸阿托品对照品含有结晶水 ,对其进行热重热差
分析验证 , 120 ℃恒重后的硫酸阿托品对照品分子
内没有结晶水 ,因此按无水物计算转换系数)。
7.7　峰纯度检查 取对照品溶液和供试品溶液 ,使
用二极管阵列检测器 ,在上述 “3”项的色谱条件下
进样测定 ,计算色谱峰纯度。结果样品色谱中消旋
山莨菪碱 、东莨菪碱 、阿托品色谱峰均为纯色谱峰 ,
纯度系数均大于 0.9998。
7.8　阿托品与莨菪碱的关系 阿托品在华山参药
材中存在的原型为莨菪碱 ,莨菪碱不稳定 ,经提取制
成滴丸后转化为性质稳定的外消旋体 —阿托品 ,因
此本文采用阿托品作为测定指标 。
7.9　小结 ①本文采用 HPLC法同时测定华山参
滴丸中消旋山莨菪碱 、东莨菪碱 、阿托品的含量 ,基
本可全面反映制剂质量 ,方法简便 ,结果准确 。②因
本实验采用梯度洗脱 ,在 210 nm低波长处检测 ,存
在色谱图基线向下漂移的缺点;同时 ,在本文色谱条
件下 ,部分品牌的色谱柱对消旋山莨菪碱色谱峰的
分离度较差 ,因此有待对色谱条件作进一步的优化
调整 。
参考文献
1 ChP(中国药典).2005.VolⅠ (一部):94
2 WUShao-ping(吴少平), LIUXiao-qin(柳小秦).Studyon
qualityspecificationsofhyoscyamusextracttablets(莨菪浸膏片质
量标准研究).ChinJPharmAnal(药物分析杂志), 2008, 28
(8):1319
(本文于 2009年 6月 2日收到)
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—841—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(5)