全 文 ：·748· 中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月
药材与资源
不同居群美花石斛种质资源的RAPD分析
白 音1’2，包英华1，王文全2
(1．韶关学院英东生物工程学院，广东韶关512005；
，朱必风1，阎玉凝2
2．北京中医药大学中药学院，北京100102)
摘 要：目的 分析不同居群美花石斛种质资源的遗传多样性、濒危现状以及亲缘关系。方法利用RAPD分子标
记技术和方法对不同居群美花石斛进行检测；通过计算遗传相似系数建立其聚类分析图。结果从117个随机引
物中，共筛选出8个有效引物，对8个美花石斛居群进行RAPDPCR扩增，共扩增出287个条带，平均每个引物的
扩增条带为35．88个；287个条带共占据78个位点，其中11个位点是8个居群的共有位点，67个为多态位点，多态
性比率达85．95％；8个居群的相似性系数在0．149～0．517。结论美花石斛遗传多样性水平低于铁皮石斛种内遗
传多样性水平；美花石斛的濒危原因与人为过度采收、种子自然萌发力弱和遗传多样性水平较低有一定的关系；美
花石斛8个居群比较自然地向3个方向演化发展，并形成3个分支；美花石斛系统演化规律与其地理分布的相关
性有待于进一步研究。
关键词：美花石斛；种质资源；遗传多样性；RAPD
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)05—0748—04
RAPDAnalysisongermplasmresourcesindifferentpopulationsofDendrobiumloddigesii
BAIYinl一，BAOYing—hual，WANGWen—quan2，ZHUBi—fen91，YANYu-nin92
(1．YingdongCollegeofBioengineering，ShaoguanUniversity，Shaoguan512005，China{2·CollegeofChineseMat ria
Mediea，BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Beijing100102，China)
Abstract：ObjectiveToanalysethgeneticd versity，endangeredsituation，andphylogenetic
relationshipofgermplasmresourcesindifferentpopulationsofDendrobiumloddigesiibyRAPD·Methods
Geneticd versity，phylogeneticrelationship，andmolecularauthenticationindifferentpopulationsofD·
loddigesiiwerenvestigatedbythemethodsfRAPDmarkersandendrogramofclusteranalysiswa
establishedbycalculatingthegenetics milarcoefficient．ResultsAtotalof287bandswithanaverageof
35．88perprimerwereamplifiedromeightpopulationsbyeighteffectiveprimers，whichsele tedfrom117
primers．The287amplifiedbandstookup78locinallgelatinboards，amongwhich11lociwere
monomorphicand67werepolymorphic，correspondingtO85．95％geneticpolymorphism·Thesimilarity
coefficientsw refrom0．149tO0．517intheseeightpopulationsofD．10ddigesii．ConclusionCompared
withD．officinale，thelevelofgeneticd versityofD．10ddigesiiisdistinctlylower．ThereasonsforD．
10ddigesiibe ngonthebrinkofextinctionarereleventtotheartificialdestroyedph nomenon，infirmly
reproductiveabilityandlowergeneticd versityofthisspecies．Theeig tpopulationsofD·loddigesiican
bedevelopedtothreedirectionsnaturallyccordingtOtheirclusterd ndrogram．Itisnecessarytofurther
researchwhetherthephylogeneticr lationshipofD．10ddigesiiwillberelatedtoitsgeological
dist“bution．
Keywords：DendrobiumloddigesiiRolfe；germplasmresources；geneticdiv rsity；RAPD
美花石斛DendrobiumloddigesiiRolfe为兰科
(Orchidaceae)石斛属多年生草本植物，又称环草石
斛、粉花石斛或耳环石斛等，主要分布于贵州、广西、
云南和广东等省区。美花石斛是我国常用名贵中药
材，具有滋阴清热、益胃生津和润肺止咳等功效，主
要含有多糖、生物碱和蘸类等化学成分‘1~3。。由于在
收稿日期：2006—08—10
基金项目；科技部国家科技基础条件平台项目(2004DKA30410)I韶关市科技计划项目(韶科2005—10)
作者简介：白音(1973一)，在读博士，主要从事中药材品种整理及资源评价研究。
Tel：(0751)8121376E—mail：baiyin271@sohu．com
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·749·
自然环境中，美花石斛的种子萌发率很低，再加上长
期过度采收，导致野生美花石斛种质资源急剧减少，
甚至难以找到较为完整的野生居群。于1987年出台
的《国家重点保护野生药材物种名录》中，美花石斛
(环革石斛)被列为国家三级珍稀濒危保护植物之
一。笔者对云南、贵州、广西和广东等省区的美花石
斛种质资源进行考察时发现不同产地美花石斛的外
部形态特征具有一定的差异，说明种内可能存在较
大变异。那么美花石斛种内遗传物质多态性水平到
底如何，目前却尚未见到相关研究报道。本文采用
RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛种质资
源进行遗传多样性和亲缘关系分析，为美花石斛种
质资源的可持续利用和保护提供理论依据。
1材料与方法
1．1材料：实验材料采自贵州、云南和广西等地区
的野生美花石斛DendrobiumloddigesiiRolfe，由北
京中医药大学阎玉凝教授鉴定。共收集8个居群的
样品(表1)，取幼嫩叶片8～10个，用变色硅胶快速
干燥，存放于一70℃SIM型超低温冰箱(美国西蒙
公司)，备用。
表1用于RAPD分析的不同居群美花石斛
Table1 AnalysisofD．10ddigesiiindifferent
populationsbyRAPD
1．2基因组DNA的提取和检测：采用改进的4×
CTAB法，制备模板DNA。称取低温保存的不同居
群美花石斛鲜叶0．20g，研磨后放入5mL离心管
中，加1mL4×CTAB溶液，混匀，冷却10min，室
温溶解，4℃、8000r／min离心5min，弃上清液。在
沉淀中加1．5mL4×CTAB溶液，65℃水浴30
min，加入等体积的氯仿一异戊醇(24：1)，混匀5
min，4℃、5000r／rain离心5min，吸取上清液，加2
倍体积的无水乙醇，4℃、1000r／min离心10
min，沉淀放在离心管中，用70％乙醇清洗2次，室
温，10000r／min离心2min，DNA沉淀，干燥后用
0．1×TE溶解，4℃保存，备用。
精密吸取10弘L，稀释至1mL，用Ultrospc
2000紫外／可见分光光度计，测定样品DNA吸光
度，计算其质量浓度和质量分数。DNA质量浓度
(ng／mL)一A260×50x稀释倍数／1000；以A260与
4：∞的比值计算样品DNA质量分数，检测结果显
示，A260／A280均在1．7～1．9。
1．3引物筛选：本实验所用引物共117条(购自上
海生工，分别从$80～$200、S1001～S1020、S1341～
S1360和$2101～S2160引物中选用)。以贵州兴义
居群为模板，对引物进行筛选，获得50个具有扩增
条带的引物，在此基础上，进一步筛选出扩增条带多
而清晰的8个引物，用于分析美花石斛种质资源的
RAPD分析。
1．4 PCR反应体系及产物检测：总体积为25弘L，
其中10×Buffer2．5弘L，M92+1．2mmol／L，
dNTPs160mmol／L，模板DNA用量40ng／mL，
Taq聚合酶1．2U，随机引物0．3mmol／L，ddH20
16．2肛L。扩增程序为94℃预变性3min、94℃变性
50S、40℃复性1min、72℃延伸2min，循环40次，
最后72℃延伸5min。反应产物以100～300bp
ladder为相对分子质量标记，1．8％琼脂糖凝胶电
泳，EB染色20min。采用ImageMasterVDS凝胶
成像系统(瑞士AmeishamP armaciaBiotech)观察
记录。每个随机引物重复扩增2次PCR，选取重复
性和稳定性好的扩增结果用于统计分析。
1．5数据的统计分析：根据PCR扩增条带在琼脂
糖凝胶上的迁移程度，确定各居群RAPD—PCR条
带的位置和相对分子质量大小。在某一个位点上，有
带的样品记为“1”，无带记为“0”，所得的位点按相对
分子质量从大到小排列。用SPSSll．5统计软件，计
算Jaecard相似系数，用hierarchicalclustering
analysis方法进行聚类分析，构建不同居群美花石
斛分子系统树。
2结果
2．1 美花石斛种质资源的RAPD扩增结果：经多
次重复筛选，在117个随机引物中，只有8个引物能
够扩增出重复性较好、条带清晰，而且多态性丰富的
条带。用这些引物，对美花石斛8个居群进行PCR
扩增，并对扩增片段进行统计分析。结果显示，8个
引物共扩增出78个位点，67个多态位点，约占总数
的85．95％，平均每个引物所扩增位点为9．75，多态
性位点数在6～11，平均8．38个位点(表2)。
2．2美花石斛种质资源的多态性分析：利用筛选出
的8个随机引物，对美花石斛8个居群进行PCR
扩增，结果共扩增出287个条带，多态性条带有199
万方数据
·750· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月
表2 8个不同居群美花石斛随机引物的扩增结果
Table2 Amplificationresultsforprimersineight
populationsofD．10ddigesii
表3美花石斛8个居群多态性分析结果
Table3 Polymorphismfore ghtpopulations
ofD．10ddigesii
个，约占69．34％。平均每个所扩增出的总条带和多划分为3个分支(分支A、分支B和分支C)，分支A
态性条带数量分别是35．88和24．88。在8个居群包括贵州清水河居群(Dlod03)、贵州贞丰居群
中，贵州安龙居群(Dlod05)多态性比率最高，为(Dlod04)、广西靖西居群(Dlod02)、云南文山居群
78．43％，而贵州则戎居群(Dlod06)多态性比率最(Dlod08)；分支B包括贵州兴义居群(Dlod01)和
低，为57．69％(表3)，说明不同居群美花石斛种质贵州则戎居群(Dlod06)；分支C由贵州安龙居群
资源的遗传变异显著。(Dlod05)和广西玉林居群(Dlod07)组成。另外，从
2．3美花石斛种质资源的聚类分析：以Jaccard相图1和表4，还可以看到贵州清水河居群(Dlod03)
似性系数为依据，对美花石斛8个居群的基因组 和贵州贞丰居群(Dlod04)聚在一起，遗传距离很
DNA的扩增条带的编码数据进行编码矩阵(表4)近，相似系数为0．517；遗传距离最远的两个居群是
和聚类分析，构建8个居群的聚类图(图1)。从聚类贵州贞丰居群(Dlod04)和广西玉林居群(Dlod07)，
图的拓扑结构可见，美花石斛8个居群比较自然地 相似系数为0．149。
表4美花石斛8个居群相似性系数分析结果
Table4 SimilaritycoefficientforightpopulationsofD．10ddigesii
居群编号Dlod01Dlod02Dlod03 Dlod04Dlod05 Dlod06Dlod07 Dlod08
Dlod01
Dlod02
D10d03
Dlod04
Dlod05
Dlod06
Dlod07
Dlod08
Dlod03
Dlod04
Dlod02
Dlod08
Dlodol
Dlod06
Dlod05
Dlod07
1．000
0．444、
0．343
0．216
0．383
O．333
0．239
O．237
00
00
41
38
75
56
78
1．OO
O．51
0．36
0．39
0．24
O．35
图1美花石斛8个居群的RAPD聚类分析图
Fig．1DendrogramofRAPDclusteranalysis
foreightpopulationsofD．10ddigesii
3讨论
3．1 美花石斛种质资源遗传多样性保护：关于石斛
属植物遗传多样性研究报道较多，而且多数研究报
1．000
O．216
0．233
O．149
0．333
1．000
0．295
0．423
0．333
1．000
0．225
0．300
1．000
0．273 1．000
道都选用S序列随机引物对石斛属植物进行分析。
张铭等[43利用RAPD技术分析了26种石斛属植物
和1个金石斛植物的基因组DNA多态性分析，结
果发现多态性条带占91．2％；丁颌等[5]对铁皮石斛
种内遗传多样性进行RAPD分析，结果显示铁皮石
斛种内多态性比率能够达到91．35％。由此看来，石
斛属植物种间和种内遗传多样性水平比较高，这个
在很多濒危物种中比较少见。本文分析结果显示，美
花石斛8个居群的多态比率为85．95％，低于铁皮
石斛种内多样性水平和石斛属总体遗传多样性水
平。笔者认为，美花石斛的濒危原因可能与其遗传多
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·751·
样性水平相对较低有一定关系，因为美花石斛通常
生长在悬崖峭壁或森林高大乔木之上，分布区域分
散，居群间基因交流较少，自然有性繁殖率低；当然，
长期以来过度采收野生美花石斛，致使其资源储量
急剧减少；严重缩小分布区域，是美花石斛濒危程度
加剧的另一个主要原因。今后有必要进一步加大野
生美花种质资源的就地保护和迁地保护力度，建立
美花石斛核心种质库，以防治美花石斛遗传基础的
流失和降低。同时，要开展优质美花石斛品种的人工
培育研究工作，建立规范化生产基地，为加快野生美
花石斛种质资源的恢复能力，解决日益增加的社会
需求。
3．2美花石斛居群间亲缘关系的初探：通常认为，
不同种或种内居群的相似度大小一定程度上反映这
些类群的亲缘关系远近。从聚类图和相似性系数分
析结果来看，亲缘关系最近的居群是清水河居群
(Dlod03)和贞丰居群(Dlod04)，亲缘关系最远的两
个居群是贵州贞丰居群(Dlod04)和广西玉林居群。
从清水河居群和贞丰居群地理分布看，美花石斛的
亲缘关系与其地理分布似乎有一定的关系。然而，实
际上，兴义居群、安龙居群和贞丰居群的地理位置很
近，而它们的相似性系数却很低。由此看来，美花石
斛系统演化规律与其地理环境的相关性程度有待进
一步研究。
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山西芮城引种白菊花中主要有效成分的E匕较研究
薛黎明1，秦雪梅¨，郭吉刚2
(1．山西大学化学化工学院，山西太原030006；2．山西生物应用职业技术学院，山西太原030031)
摘 要：目的 以白菊花内总氨基酸、总黄酮、绿原酸和挥发油等有效成分为指标，探索山西芮城自菊花质量与采
收期、加工方法的关系并与原产地白菊花比较质量。方法运用水蒸气蒸馏法测定挥发油的量，采用分光光度法测
定总黄酮和总氨基酸的量以及HPLC法测定绿原酸的量。，结果胎菊除绿原酸外各指标显著高于各花期，可作为
高等茶饮，普通茶饮品以半开菊和盛开菊适合，产量较高，指标适合。加工方法以机械加工更快、更适宜大生产。结
论 白菊花质量与采收期和加工方法有很大的关系。山西引种自菊花主要有效成分的量与原产地相当；挥发油量
受采收期和加工方法的影响大于产地环境影响。
关键词：白菊花；总氨基酸；绿原酸；总黄酮
中图分类号：R282．6 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)05—0751一04
Comparatives udyonmaincomponentsofChrysanthemummorifoliumintroduced
inRuichenginShanxiProvince
XUELi—min91，QINXue—meil，GUOJi—gan92
(1．CollegeofChemistryandChemicalEngineering，ShanxiUnivers ty，Taiyuan030006，China；
2．ShanxiCollegeofBio—applicationVocationalTechnology，Taiyuan030031，China)
Abstract：ObjectiveTakingthetotalmino—acid，totalflavones，chlorogenicacid，a dvolatileoiin
Chrysanthemummorifoliumas ndextoinvestigatetheinternalqualitywhichrelatesocollectionperiods
andprocessingmethvodsinordertocomparethequalityofspeciesfromoringinalhabitats．MethodsThe
收稿日期：2006—07—12
*通讯作者秦雪梅教授Tel：(0351)7011202E—mail：qinxm@SXU．edu．cn
万方数据
不同居群美花石斛种质资源的RAPD分析
作者： 白音， 包英华， 王文全， 朱必风， 阎玉凝， BAI Yin， BAO Ying-hua， WANG Wen-
quan， ZHU Bi-feng， YAN Yu-ning
作者单位： 白音,BAI Yin(韶关学院英东生物工程学院,广东,韶关,512005;北京中医药大学中药学院,北
京,100102)， 包英华,朱必风,BAO Ying-hua,ZHU Bi-feng(韶关学院英东生物工程学院,广
东,韶关,512005)， 王文全,阎玉凝,WANG Wen-quan,YAN Yu-ning(北京中医药大学中药学院
,北京,100102)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(5)
被引用次数： 6次

参考文献(5条)
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