全 文 ：·1858· 中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
黄芪在《神农本草经》中被列为上品，为补药之
长，具有“益气补虚，扶正固本”之功效，其主要成分
为黄芪多糖和黄芪皂苷[5]。注射用黄芪多糖是通过
专利技术获得纯化的阿拉伯半乳聚糖组合物，质量
分数达到98．5％，临床前研究资料表明该药可以增
加动物脾质量，增加小鼠巨噬细胞的吞噬功能；促进
人外周血淋巴细胞的增殖功能；增强NK细胞和
LAK细胞活性，显著增强某些细胞因子的分泌；促
进骨髓造血干细胞的增殖和向红细胞系和粒细胞系
的分化，并对放化疗后所致骨髓造血功能的破坏有
明显的保护作用[6]。本临床研究结果表明，注射用黄
芪多糖可增强机体免疫功能，提高患者生活质量[7]，
延长患者的生存时间，且无毒性作用，体现了中药治
疗肿瘤对机体的多层次、多环节、多靶点的整体调
节，值得临床应用及推广，并且今后应进一步发展临
床研究，深入探讨中药治疗原发性肝癌的作用机制。
参考文献：
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大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用
笪红远1”，曾 文3，江振洲1，程安春3，张陆勇1，刘国卿1．
(1．中国药科大学药学院，江苏南京210009；2．国家药品审评中心，北京100038；
3．四川农业大学实验动物工程技术中心，四川雅安 625014)
摘要：目的评价大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用。方法小鼠淋巴瘤细胞在代谢活
化或非代谢活化条件下暴露于50、200、350、500ptg／mL大黄酸3h，处理后第2天将细胞接种于含有突变选择剂三
氟胸苷的96孔板中，计数各剂量组的突变细胞集落数。通过计算第0天的相对存活率(relativesurvival，RS)、相
对悬浮增长率(relativesuspensiongr wth，RSG)和相对总增长率(relativetotagrowth，RTG)确定细胞毒性。
用MUTANT软件包计算各种细胞毒性参数和突变率，并对突变率数据进行统计分析。结果在非代谢活化条件
下，50、200、350、500pg／mL的大黄酸均未见诱导L5178Y细胞的突变率增加，阳性对照组诱导的突变率显著增
加；在代谢活化条件下，大黄酸350pg／mL剂量组诱导L5178Y细胞的突变率增加，阳性对照组诱导的突变率显著
增加。结论在非代谢活化条件下大黄酸各剂量组对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因无致突变作用；在肝微粒
体酶系S。代谢活化条件下，出现了弱致突变性。
关键词：大黄酸；L5178Y细胞fTK基因
中图分类号：R285．53 文献标识码：A 文章缩号：0253—2670(2008)12—1858一03
TK基因突变试验是一种国外已广泛使用的体
外短期致突变实验，具有很高的灵敏度，可检出包括
点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大
范围基因组改变在内的多种遗传改变。TK基因突
变试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞
L5178Y以及人类淋巴母细胞TK6和WTKl等，
其基因型均为tk“一。使用L5178Y细胞的试验(即
小鼠淋巴瘤细胞试验)发展较早，已形成一套比较
完善的方法[1】。而TK6和WTKl等人类来源的细
胞在TK基因突变分析中的应用时间还不长，但因
为来源于人类，在评价受试物对人体的损伤方面意
义可能更大。大黄酸高剂量有抑菌作用[2]，限制了
Ames实验对供试品有无致突变作用的评价。本实
验评价大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因
是否有致突变作用，为其安全性评价提供依据。
1材料
·收稿日期：2008—07—09
基金项目；国家中医药管理局中医药科学技术研究专项资助项目(国中医药科2004ZX05)，科技部“十五”重大专项(863计划)资助项
目(2002AA223113)
作者简介：笪红远，男，于国家药品审评中心工作。
*通讯作者刘国卿Tel：(025)83271500E—maillyzhang@cpu．edu．cn
万方数据
中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月·1859·
1．1 药品与试剂：大黄酸(质量分数92％)，中国
药科大学植物化学教研室提供，批号0403A；二甲
基亚砜(DMSO)，Sigma公司提供，批号31K34；甲
基甲烷磺酸乙酯(MMS)，KyowA生产，批号
392ABI；环磷酰胺(CP)，上海华联制药有限公司提
供，批号040626。 ／／
1．2 细胞和细胞培养：小鼠淋巴瘤L5178Y一
3．7．2c／TKw一细胞，日本国立卫生研究所提供；细
胞培养液为含10％热灭活马血清的RPMI1640培
养液(RIO)，补充200,ug／mL丙酮酸钠，在37℃、
5％CO：饱和湿度下常规悬浮培养。培养基为RPMI
1640，Gibcobrl，批号1071044；马血清(CMHSH)；
R0为不含马血清的RPMI1640培养基；R10为含
10％马血清的RPMI1640培养基；R20为含20％
马血清的RPMI1640培养基。
1．3动物：雄性SD大鼠5只，四川1大学实验动物
中心提供，合格证号：SCXK(046)。
2方法
2．1 Aroclorl254诱导的大鼠肝微粒体酶系S。的制
备[3]：取200g左右的雄性SD大鼠5只，单次ip
500mg／kgAroclor1254，5d后处死。取出肝脏，称
质量，每克肝组织加3mL冰冷的0．15mol／LKCl，
将肝组织制成匀浆，9000×g离心lOmin。取上清
液，分装于小瓶中，液氮中贮存。S。混合液配制比例：
180mg／mL6一磷酸葡萄糖(G一6一P)2mL，25mg／
mLNADP2mL，150mmol／LKCl2mL，大鼠肝微
粒体酶S。4mL，使用时S。的终体积分数为2％。
2．2剂量的确定：进行剂量范围确定试验，以阴性
对照组相对存活率10％～20％的剂量作为正式实
验的最高剂量，并向下设置3个剂量，同时设置阴性
对照和阳性对照。
2．3致突变性试验：取处于指数生长期的细胞，用
R10培养液调整浓度为1×106／mL的细胞悬液。实
验分组为大黄酸500、350、200、50pg／mL组，阳性
对照分别为MMS5肛g／mL(非代谢活化)和CP2
pg／mL(代谢活化)，阴性对照为DMSO。以2％体
积分数分别加入受试药物或对照品，总反应体积为
10mL，在37℃下振荡处理3h。处理结束后，将含
有供试品的细胞悬液离心，然后用R0培养液清洗
细胞1次，离心后将细胞重悬于10mLR10培养液
中。计数细胞，调整细胞密度至2×105个／mL。然后
取少许用R20培养液配制成8个／ml。的细胞悬
液，于96孔板中每孑L}Jn入0．2mL不同浓度的供试
品溶液，置于37℃、5％C0。饱和湿度下培养12～
14d，计数含有细胞集落的孔数，计算平板效率
PE0。其余细胞在37C5％CO：条件下表达培养2
d，记录第2天的平板效率PE2。在表达期结束时，
计数细胞后用R20培养液将细胞配制成1×104个／
mI。的细胞悬液，取适量细胞用R20培养液配制成
8个／mL的细胞悬液，并接种于96孑L板中，每孔
0．2mL(复孔)，12～14d后观察长出集落的孑L数，
用于检测细胞活力。剩余细胞(1×104个／mL)中加
入终质量浓度为3弘g／mL的TFT，接种于96孔板
中，每孔0．2mL(复孔)。12～14d后肉眼观察孔中
是否存在TFT抗性细胞集落，并分别记录大集落
和小集落数。出现污染的孔不作为观察对象，将其从
总孔数(TW)中减去。
2．4计算方法
2．4．1 平板效率(platingefficiencyPE)：按下式
计算。
PE：：—--ln(EW—／TW)
九
EW为不含集落的孔数，TW为总孔数，行为每孔的平均细胞
数，在此实验中九一1．6
2．4．2相对存活率(relativesurvival，RS)：按下
试计算。
RS0=PE0(处理组)／PEO(阴性对照组)X100％
RS2一PE2(处理组)／PE2(阴性对照组)X100％
2．4．3 相对总增长率(relativeotalgrowth，
RTG)：RTG=RSG×RS2
2．4．4突变率(mutationfrequency，MF)：
MF一—--—ln—(E1W开百／T—W一)／n
EW为不含任何集落的孑L数．Tw为总孔数，此处为192(2
块板的总孔数，”为每孑L的平均细胞数，此处为2000
2．5统计分析：数据用MUTANT软件统计分析。
2．6试验结果的判定
2．6．1 阳性结果的判断标准：符合下列标准，判断
为致突变试验阳性。与溶剂对照组相比，处理组1个
或多个剂量组的突变率显著升高，并具有统计学显
著性差异(P
结果，通常阳性对照的突变率至少为阴性对照的2
倍以上。
3结果
3．1 剂量：根据剂量范围确定试验的结果，选择
500、350、200、5099／mL4个剂量进行正式实验。
3．2非代谢活化条件下结果：见表1。在非代谢活
化试验中，500、350、200、50／』g／mL大黄酸的RTG
分别为溶剂对照组的23％、26．3％、52．8％、
万方数据
·1860· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
60．1％。大黄酸各剂量组的突变率未见增加。500
弘g／mL剂量组的RTG达到了23％，处理结束后有
受试物析出，在此较高的细胞毒性下，细胞存活较
少，所以该剂量组的突变平板长出的集落数很少，在
这样的条件下，计算出的突变频率值是无意义。
3．3 代谢活化条件下结果：见表2。在代谢活化试
验中，500、350、200、50弘g／mL大黄酸的RTG分别
为溶剂对照组的3．0％、12．8％、49．1％、43．5％。大
黄酸350pg／mL剂量组的突变率较阴性对照组显
著增加。与不加S。的最高剂量组相似，加S。的500
弘g／mL剂量组细胞存活率更低，析出较多，RTG高
达3．0％，其突变平板上没有突变集落生长，该剂量
组突变频率结果无意义。350pg／mL剂量组的细胞
毒性也较强，达到了12．8％，仅在此剂量组出现阳
性结果，提示该受试物在小鼠淋巴瘤细胞TK突变
试验中有弱诱变性。
表1大黄酸致小鼠淋巴瘤LSl78Y细胞TK基因
突变性试验结果(不加S，)
Table1 ResultsofmutagenicityofrheinTKgene
ofL5178Ymouselymphomacells(withoutSO
组 别P／(pg·mL一1)RS0／％ RTG／％MF(×10—6)
溶剂对照0 100．0 100．0 54．2
大黄酸 50 74．4 60．2 82．6
200 64．5 52．8 54．4
350 61．0 26．3 87．2
500 68．3 23．0 7．2
MMS 5 72．3 28．8 243．2‘
与溶剂对照组比较：。P
突变性试验结果(加S。)
Table2 ResultsofmutagenicityofrheinTKgene
ofL5178Ymouselymphomacells(withS·)
组别P／(pg·mL1)RS0／％RTG／％MF(×10—6)
与浴刑对照组比较：。尸
4讨论
哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验常
用的测试系统有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞、中国仓
鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的3个基因位点的
突变，即次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、胸苷
激酶(TK)及Na+／K+一ATP酶(oUA)位点H]。
HGRPT和TK位点突变可用于上述3种细胞，
oUA位点突变仅适用于CHo细胞，HGRPT和
TK可分别使6一硫代鸟嘌呤(6一TG)转移上磷酸核
糖及使5一溴脱氧尿苷磷酰化，它们的代谢产物可掺
入DNA引起细胞死亡，因此正常细胞在含有这些
碱基类似物的培养基中不能生长，在致突变物作用
下此两个位点发生突变的细胞对这些碱基类似物具
有抗药性，可以增殖成为克隆(细胞集落)。
正式实验前大黄酸以DMSo溶解配制成为
700、500、250、125、62．5、31．25pg／mL进行剂量范
围确定试验，计算各剂量组的相对存活率，以阴性对
照组相对存活率的10％～20％的剂量作为正式试
验的最高剂量，结果显示700肛g／mL剂量组出现严
重析出，影响结果判断；500pg／mL剂量组出现少
许析出，相对存活率不低于正式实验要求，故选择为
最高剂量。
本研究的结果表明在非代谢活化条件下，500、
350、200、50pg／mL大黄酸未见诱导小鼠淋巴瘤
L5178Y细胞TK基因的突变率增加；在代谢活化
条件下，大黄酸350弘g／mI。剂量组诱导小鼠淋巴瘤
L5178Y细胞TK基因的突变率增加，提示该受试
物在小鼠淋巴瘤细胞TK突变试验中有弱诱变性。
但体外研究并不完全代表体内过程，即使对大黄素
而言，虽然文献报道其有诱导突变作用[5’6]，但是动
物实验亦未证实其有明确的致癌作用。因此，对于大
黄及其衍生物致突变作用有待于更进一步的研究。
大黄的种类较多，成分复杂，在实际应用中应注意选
择大黄的品种，选用《中国药典》规定的正品大黄。
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万方数据
大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用
作者： 笪红远， 曾文， 江振洲， 程安春， 张陆勇， 刘国卿
作者单位： 笪红远(中国药科大学药学院,江苏,南京,210009;国家药品审评中心,北京,100038)， 曾文
,程安春(四川农业大学实验动物工程技术中心,四川,雅安,625014)， 江振洲,张陆勇,刘国
卿(中国药科大学药学院,江苏,南京,210009)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(12)
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200812035.aspx