全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·735·
表4地龙提取物中游离氨基酸成分分析
Table4 Analysisoffreeaminoacidcontent
inP^eretimaextracts
氨基酸 质量分数／％ 氨基酸 质量分数／％
牛磺酸0．48 异亮氨酸 2．31
天冬氨酸0．173 亮氨酸 5．92
苏氨酸 1．10 酪氨酸0．354
丝氨酸0．832 苯丙氨酸 2．95
谷氨酸0．572 赖氨酸 1．31
甘氨酸0．635 组氨酸0．332
丙氨酸 3．2 色氨酸0．295
7一氨基丁酸0．194 精氨酸0．922
缬氨酸 2．50 脯氨酸 1．17
蛋氨酸0．746 总氨基酸 26
3讨论
实验结果表明，地龙提取物可明显延长小鼠凝
血、出血时间及家兔离体血浆复钙时间，提示地龙提
取物能抑制内源性凝血系统，具有抗凝血作用。
地龙提取物含有19种游离氨基酸，总量达
26％以上。游离的谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、
和组氨酸或是神经递质或是递质的前体物质，且质
量分数最高的几种氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨
酸为脑内的能源物质，上述物质易通过血脑屏障，具
有促进神经细胞更新、调节神经递质代谢、维护神经
功能及抗脑组织缺氧等作用。另外量较高的苯丙氨
酸、赖氨酸和精氨酸在心血管方面也有重要的作
用[5]，赖氨酸是优良的血栓预防剂，与蛋氨酸合用能
抑制重高血压病[63；苯丙氨酸能预防某些有高血压
病家族史“易感者”发病，降低心血管疾病的发病率；
还可对抗自由基，防治缺血一再灌注损伤[73；精氨酸
是人体半必需氨基酸，可通过L—Agr—NO途径扩张
血管、抑制血小板聚集、减少氧自由基损伤，用于治
疗缺血性心脏病、高血压、肺动脉高压症、动脉粥样
硬化等疾病[83。综上所述，推测地龙提取物中所含有
的游离氨基酸可能是地龙抗凝血作用的主要有效
成分。
以往的多数研究认为地龙纤溶酶是抗血栓活性
的有效成分，但临床上用的多为口服制剂，而口服的
酶制剂在消化系统易被水解为氨基酸进入血液，因
而推测地龙纤溶酶口服时实际发挥疗效的物质可能
是其水解产物。本实验所用的不含活性纤溶酶的提
取物具有抗凝血活性，且主要含有丰富的游离氨基
酸，所以推断其氨基酸可能是临床上实际发挥抗凝
血疗效的物质。
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虎杖提取物对0(一葡萄糖苷酶的抑制作用
郑晓媛，杜俊蓉+，杨芳，彭海燕，陈雏，喻冬柯
(四川大学华西药学院药理教研室，四川成都610041)
摘 要：目的 研究虎杖水溶性提取物对a一葡萄糖苷酶的作用。方法 采用大孔吸附树脂柱色谱法进行虎杖水溶
性总提取物初步分离，研究其总提取物和不同组分对a一葡萄糖苷酶活性的影响及其抑制反应的类型一结果 虎杖
总提取物(RRPC)与300A醇洗脱物(RRPCⅡ)对a一葡萄糖苷酶的IC；。分别为74、15t-tg／mL，而蒸馏水(RRPC
收稿日期：2006一10—13
基金项目：四川大学辐射物理及技术教育部重点实验室开放基金资助(LF04004)
*通讯作者杜俊蓉Tel：(028)85503938E—mail：dujr07@gmail．corn
万方数据
·736· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·
I)、50％乙醇(RRPCⅢ)、70％乙醇(RRPCⅣ)、95％乙醇(RRPCV)洗脱物的IC5。均大于200pg／mL。结论
RRPC及RRPCI能显著抑制a一葡萄糖苷酶活性，RRPCⅡ的抑制机制为可逆性的非竞争性抑制。
关键词：虎杖提取物fa一葡萄糖苷酶；非竞争性抑制
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)05—0735—04
InhibitionofextractsfromRhizomaetR dixPolygoniCuspidationoc—glucosidase
ZHENGXiao—yuan，DUJun—rong，YANGFang，PENGHai—yan，CHENChu，YUDong—ke
(DepartmentofPharmacology，WestChinaSchoolofPharmacy，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)
Keywords：RhizomaetRadixPolygoniCuspidati(RRPC)；a—glucosidase；noncompetitivenhibiti n
虎杖为蓼科蓼属植物虎杖Pdygonum
cuspidatumSieb．etZucc．的干燥根与根茎，其具
有活血镇痛、清热利湿、解毒、化痰止咳等功效。近期
实验研究显示，虎杖鞣质具有显著降低正常小鼠及
四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖的作用口]，其机制与
其抑制体外a一葡萄糖苷酶活性作用有关[2]。虎杖化
学成分复杂，除虎杖鞣质外，还含有白藜芦醇、槲皮
素等多酚类化合物。近年来文献报道多酚类化合物
具有多种药理活性，例如对a一葡萄糖苷酶活性有抑
制作用口~5]。本实验通过建立a一葡萄糖苷酶体外筛
选模型，结合虎杖水溶性提取物的柱色谱分离法，进
一步探讨虎杖调节血糖的主要有效组分及其机制。
1材料
虎杖药材RhizomaetR dixPolygoniCuspi-
dati(RRPC)购于北京同仁堂成都分店，由华西药
学院陈雏鉴定；a一葡萄糖苷酶(EC3．2．1．20)，猪胰
淀粉酶(EC3．2．1．1，typeⅥ一B)和4一硝基酚一a—D一
呋喃葡萄糖苷(pNP—G)均购于美国Sigma公司。
虎杖苷对照品，批号111575—200301，中国药品生物
制品检定所；D101型大孔吸附树脂，天津市海光化
工有限公司；阿卡波糖(拜糖平)，批号107212，德
国拜耳公司；其余试剂均为国产分析纯。透析袋(德
国Serua公司，清除限相对分子质量8000～
15000)。旋转蒸发仪(R一201型，上海申顺生物科
技有限公司)，冷冻干燥机(ModulyD型，Thermo
Savant公司)，台式离心机(LD4—2A型，北京医用
离心机厂)，紫外可见分光光度计(UV--2102C型，
美国UNIC公司)，电热恒温水槽(DK--600型，上
海精宏实验设备有限公司)。高效液相色谱仪(10
ATVP，日本岛津)，紫外可见光检测器(SPK一10
AVP，日本岛津)。
2实验方法
2．1 树脂的预处理及活化：D101型大孔吸附树脂
经蒸馏水冲洗、95％乙醇浸泡过夜后，装入玻璃柱
中，再用蒸馏水冲洗至流出液无醇味。继续依次用2
倍柱体积的3％氢氧化钠溶液、4倍柱体积的蒸馏
水、2倍柱体积的0．1tool／L盐酸冲洗，最后用蒸馏
水冲洗至pH中性。
2．2样品的制备及主成分测定：将干燥的药材粉
碎，用5倍体积的蒸馏水保持微沸状态1h，用纱布
滤出药液。重复煎煮1次，合并两次药液。将药液于
4000×g离心3rain，收集上清液，其中1／5总提取
物(RRPC)留样，另外4／5总提取物用于上柱。将
药液上柱后，依次用4倍体积的蒸馏水、30％乙醇、
50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇洗脱。蒸馏水洗
脱液(RRPCI)、30％乙醇洗脱液(RRPCⅡ)、
50％乙醇洗脱液(RRPCⅢ)、70％乙醇洗脱液
(RRPCⅣ)、95％乙醇洗脱液(RRPCV)与 RPC
分别用旋转蒸发仪减压浓缩、冷冻干燥成冻干粉。样
品低温干燥保存备用。根据《中国药典》2005年版中
虎杖中虎杖苷的测定方法，对各虎杖提取物进行测
定(HPLC法)。RRPC、RRPCI、R PCⅡ、RRPC
Ⅲ、RRPCTV和RRPCV的虎杖苷质量分数为
0．005％、0．009％、9．87％、39．19％、20．83％和
0．31％。
2．3 d一葡萄糖苷酶抑制试验：参照Matsui等方
法口1略作改进，以pNP—G为底物测定a一葡萄糖苷
酶的活性。将a一葡萄糖苷酶(O．01U，0．01mL)与
虎杖提取物溶液(o．5mg／mL，0．2mL)或阿卡波
糖(100mg／mL，0～mL)混合，在37℃水浴中孵
育5min后加入底物pNG—G以启动反应。37℃反
应30min后，加入0．．mol／LNa2C031mL终止反
应。于405nm处测定在酶作用下从pNP—G中释放
出的对硝基苯(pNP)的吸光度值。酶活力单位定义
为：在37℃，pH6．8的条件下，1min内水解pNP—
G释放1肛m01pNP所需的酶量，计算抑制率。酶抑
制试验重复3次，每次3个复管。
抑制率一(1一A样品／A对照)×100％
为测定RRPC和RRPCⅡ的用量对酶活性的
影响及二者的IC。。，分别加入质量浓度递增的
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·737·
RRPC及RRPCⅡ到酶活力测定系统中，同上测定
酶活性，采用Bliss法计算ICm
2．4 a一淀粉酶抑制试验：根据Bernfeld等方法[61略
作改进，以淀粉为底物测定a一淀粉酶的活性。a一淀粉
酶(0．01U，0．01mL)与虎杖提取物溶液(0．8
mg／mL，0．2mL)或阿卡波糖(160mg／mL，0．2
mL)混合，在37℃水浴中孵育5min后加入4％
淀粉以启动反应。反应在37℃进行15min，取出
0．2mL反应液加入0．1mLDNS试剂(96mmol／
L3，5一二硝基水杨酸，5．31mol／L酒石酸钠钾，2
mol／LNaOH)中，置于95℃水浴中反应15min，
取出，加入0．9mL蒸馏水稀释后，于540nm处测
定吸光度值。酶活力单位定义为：在37℃，pH6．9
的条件下，3min内水解淀粉释放1．0mg麦芽糖所
需的酶量，计算抑制率。酶抑制试验重复3次，每次
3个复管。
抑制率一(1一A样品／A对照)×100％
2．5透析试验：根据Lee等的方法[5]，取0．5mL
a一葡萄糖苷酶溶液(1U／mL)与1mgRRPCⅡ混
合，在37℃水浴中预处理1h后，在4℃的0．1
mol／L磷酸缓冲液(pH6．8)中透析24h，其间每
8h更换磷酸缓冲液。同时，另取0．5mLa一葡萄糖
苷酶溶液与1mgRRPCⅡ混合，不参与透析，4℃
保存24h作为对照。在透析结束后，将透析袋中溶
液分别稀释10、50、100、500、10 0倍后，同2．3项
方法测定其残留酶活性。
2．6 d一葡萄糖苷酶的抑制动力学：参照Lee等的方
法[5]，以浓度递增的pNP—G(0．125～2mmol／L)
为底物，测定不同质量浓度RRPCⅡ对酶活性的影
响，由Lineweave—Burk双倒数作图法确定受试物
的酶抑制反应的类型。
2．7数据统计方法：由酶抑制试验所测得吸光度值
计算抑制率，结果用z±s表示。
3 结果
3．1酶抑制试验：结果见表1。在a一葡萄糖苷酶抑
制试验中，RRPCI、RRPCⅢ、RRPCIV、RRPCV的
IC5。均大于200弘g／mL，而RRPC与RRPCⅡ的
IC。。分别为74、15弘g／mL，提示RRPCⅡ富集了虎
杖抑制a一葡萄糖苷酶的主要有效组分。不同质量浓
度RRPC及RRPCⅡ对a一葡萄糖苷酶活性的抑制
作用见图1。
此外，在oc一淀粉酶抑制试验中，仅RRPC对a一
淀粉酶有轻度抑制作用。
3．2透析试验：以相同量的酶反应所得的测定值为
表1虎杖各提取物对a一葡萄糖营酶与a一淀粉酶的
抑制作用G+s，n--9)
Table1 InhibitionofRRPCextractsona—glucosidase
anda—amylase(i土s，撑一9)
O 50 100150200250
P／(pg·mL“)
图1 RRPC及RRPCⅡ对a一葡萄糖苷酶的抑制作用
Fig．1InhibitionofRRPCandRRPCⅡona。glueosidase
100％，计算其他透析或放置的酶相对活性。以相对
酶活性为纵坐标，稀释度的对数为横坐标作反应的
可逆性图。图2显示：未加RRPCⅡ的a一葡萄糖苷
酶活性透析前后没有显著改变，而被RRPCⅡ组分
显著抑制的酶活性在透析后能基本恢复，表明
RRPCⅡ对a一葡萄糖苷酶的抑制反应是可逆的。
鋈
趟
烘
‘麓
罂
髓
0．5 l 1．5 2 2．5 3 3．5
稀释度对数值
透析
与透析
图2 RRPCⅡ抑制反应的可逆性
Fig．2ReversibilityofinhibitoryreactionofRRPCⅡ
3．3 a一葡萄糖苷酶的抑制动力学：RRPCⅡ对a一葡
萄糖苷酶抑制反应的类型由Lineweaver—Burk双倒
数作图法确定。图3显示RRPCⅡ对o【一葡萄糖苷酶
的抑制程度与抑制剂浓度成正比，最大反应速率
(y一，纵截距)随抑制剂增加而变小，而米氏常数
(K。值，横载距为一1／K。)不变，提示其竞争类型为
非竞争性抑制，K。值为1．8mmol／L。
∞
如
∞
∞
加
。
口≮瓣器幕
∞
∞
∞
∞
加
o
万方数据
·738· 中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月
鲁
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么笔；≥__■?
-2．10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
(1／C)／(mmol～·L)
图3 RRPCⅡ对oc一葡萄糖苷酶抑制程度的双倒数动力学
Fig．3Doublereciprocalplotsforkineticanalysis
ofinhibitiononoc—glucosidasebyRRPCⅡ
4讨论
糖尿病是目前严重危害人类健康的主要疾病之
一，可分为胰岛素依赖型(1型，即IDDM)和非胰
岛素依赖型(2型，即NIDDM)，2型糖尿病占糖尿
病患者的95％以上，其治疗是以降低血糖水平及
减轻症状为主要目标。
糖尿病以高血糖为主要特征，高血糖有两种情
况：一为餐后高血糖，指食物消化吸收过程中的血糖
高峰超越正常范围；另一为空腹血糖，指食物消化吸
收完毕后的基础血糖高于正常。一直以来，对糖尿病
的诊断标准及糖尿病治疗需达到的目标，多以空腹
血糖为主。近年来，餐后高血糖在糖尿病的诊断、治
疗目标及慢性并发症发病机制上的重要性受到愈来
愈多的关注。一是由于餐后血糖过高，会通过“葡萄
糖毒性作用”，加重胰岛素的分泌缺陷，机体处理餐
后高血糖的能力进一步下降，基础状态下的血糖亦
升高，即形成或加重2型糖尿病。二是餐后高血糖也
会导致蛋白质的非酶糖化，从而引起进行性的大血
管及微血管的病变，导致糖尿病并发症心脑血管甚
至非糖尿病患者的心脑血管疾病，因此降低餐后高
血糖的药物在治疗2型糖尿病及早期的糖耐量减低
(IGT)状态非常重要[7’8]。
现在临床上使用的治疗糖尿病药物主要有4
类，即作用于胰岛p一细胞、刺激胰岛素分泌的磺酰脲
类；促进糖代谢的胍类；增强胰岛素作用、促进外周
组织中葡萄糖利用的胰岛素增敏剂及a一葡萄糖苷
酶抑制剂，前3类都只能降低空腹血糖，仅有a一葡萄
糖苷酶抑制剂能降低餐后血糖。同时降低餐后高胰
岛素血症，以达到减低葡萄糖毒性，减少并发症的发
生。阿卡波糖作为广泛应用于临床的a一葡萄糖苷酶
抑制剂，在治疗糖耐量减低、减少心脑血管并发症方
面有明显疗效凹J。
传统中药是筛选天然组分新的药理活性的资源
宝库。新近文献报道虎杖同科植物大黄和虎杖鞣质
可显著抑制a一葡萄糖苷酶活性E2,10]。本实验采用大
孔吸附树脂，通过不同体积分数乙醇洗脱剂极性差
异及树脂分子筛作用将虎杖水提取物分离为5个组
分，用a一葡萄糖苷酶抑制试验跟踪有效组分，结果
发现虎杖的a一葡萄糖苷酶抑制成分主要富集在
30％乙醇洗脱组分(RRPCⅡ)，进一步的酶抑制动
力学试验证明RRPCⅡ的抑制作用属于可逆性的
非竞争性类型，而o．2mg／mLRRPCⅡ对酶活性
的抑制率达到90．3％，与40mg／mL的阳性对照药
阿卡波糖87．5％的抑制率相当。此外，在检测酶反
应可逆性的透析试验中，被RRPCⅡ抑制的酶活性
透析后可恢复大约80％，而透析后的RRPCⅡ混
合液颜色仍明显深于未加提取物的对照溶液，提示
RRPCⅡ中的有效成分应包括相对分子质量为
800015000的不能透析出来的化合物。因此，进
一步采用现代分离纯化技术深入研究虎杖抑制d一
葡萄糖苷酶的有效成分，有望发现新型的a一葡萄糖
苷酶的天然强效抑制剂。
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万方数据
虎杖提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
作者： 郑晓媛， 杜俊蓉， 杨芳， 彭海燕， 陈雏， 喻冬柯， ZHENG Xiao-yuan， DU Jun-rong
， YANG Fang， PENG Hai-yan， CHEN Chu， YU Dong-ke
作者单位： 四川大学华西药学院,药理教研室,四川,成都,610041
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(5)

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