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Antagonizing effect of paeonol on peroxynitrite-induced rat osteoblast apoptosis

丹皮酚拮抗过氧亚硝基阴离子致大鼠成骨细胞凋亡的作用



全 文 :中草芮 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·731·
丹皮酚拮抗过氧亚硝基阴离子致大鼠成骨细胞凋亡的作用
齐锦生1,王辉1,牛涛2,张秉山2,张晓琳1
(1.河北医科大学生物化学与分子生物学教研室,河北石家庄050017;2.石家庄市第二医院外科,河北石家庄050051)
摘要:目的探讨丹皮酚拮抗过氧亚硝基阴离子(ONOO一)对体外培养大鼠成骨细胞凋亡的作用。方法用改
良的组织块法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,采用淬灭流动反应方法体外制备ONOO~,以1mmol/L终浓度加
入成骨细胞培养体系,作用30rain后弃去,继续常规培养12h,用Hoechst33258染色法及TUNEL法检测成骨细
胞的凋亡,并以0.1mmol/L丹皮酚消除ON00(1mmol/L)对大鼠成骨细胞凋亡的影响。结果1mmol/L的
ON00一可导致大鼠成骨细胞凋亡;0.1mmol/L丹皮酚能拮抗ONOO一(1mmol/L)所引起的大鼠成骨细胞凋亡。
结论 丹皮酚0.1mmol/L在体外具有拮抗ONOO一(1mmol/L)致大鼠成骨细胞凋亡的作用。
关键词:丹皮酚;过氧亚硝基阴离子;成骨细胞;细胞凋亡
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2006)05—0731—04
Antagonizingeffectofpaeonolonperoxynitrite—inducedratosteoblastapoptosis
QIJin—shen91,WANGHuil,NIUTa02,ZHANGBing—shan2,ZHANGXiao—linl
(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;
2.DepartmentofSurgery。TheSecondHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050051,China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheffectofpaeonolantagonizingperoxynitrite(ONOO一)0nos—
teoblastapoptosisfratinvitro.MethodsOsteoblastsofnewlybornrat’Sskullwereseparatedndcul—
turedbytissuemassmethod.ONOO—wasproducedbychemicalsynthesiswithaquenchedflowreactor.
ONOO—at1 mmol/Lconcentrationw saddedtoculturedosteoblastsy eminvitro.Afterincubatedfor
30min,osteoblastswerecontinuedtobeculturedfor12hwithroutinemethod.Hoechst33258staina d
TUNELmethodwereusedtodetecttheosteoblastapoptosisand0.1mmol/Lconcentrationofpaeonol
wasusedtoeliminatetheffectofONOO一(1mmol/L)onosteoblastapoptosisfrat.ResultsONOO一
(1mmol/L)couldleadtoratosteohlastapoptosis.Paeonolof0.1mm /Lconcentrationcouldantagonize
ratosteoblastapoptosisinducedbyON00一(1mmol/L).ConclusionPaeon l(0.1mmol/L)hasthesig—
nificanta agonizingeffectonONOO—ofratosteoblastapoptosisinvitro.
Keywords:paeonol;peroxynitrite;osteoblast;apoptosis
牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeoniasuffruticosa
Andr.的粗皮。具有清热凉血、活血行瘀之功效。丹
皮酚是牡丹皮及萝摩科植物徐长卿Cynanchum
paniculatum(Bunge)Kitag.的主要活性成分,具
有多方面的药理作用。有研究表明丹皮酚具有较强
的抗氧化能力[1],而过氧亚硝基阴离子(ONOO一)
是已知的氧化作用最强的一类物质[2],参与多种严
重疾病基本病理过程[3]。已有文献报道,ON00一能
导致成骨细胞凋亡[4]。目前已寻找到ebselen、guani—
dinoethyldisulfide(GED)、urate等几种ONOO一清
除剂,用于ON00一介导的多种疾病的防治研
究[5~7]。但丹皮酚是否能够作为ON00一清除剂,拮
抗ONOO一所致成骨细胞凋亡的作用未见报道。本
实验从细胞水平探讨丹皮酚拮抗0NOO一致大鼠成
骨细胞凋亡的作用,对深入研究丹皮酚的药理作用
具有重 意义。
1材料与方法
1.1 实验动物:出生24h内新生SD乳鼠,由同济
医科大学实验动物学部提供(动物合格证书:动物
字第19—020号)。
1.2药物与试剂:丹皮酚(中国药品生物制品检定
所,批号0708—9704),ONOO一(本室合成),DMEM
培养基(Gibco),胰蛋白酶(Gibco),胶原酶Ⅱ
(Gibco),Hoechst33258(Sigma),TUNEL试剂盒
收稿日期:2005—09—20
基金项目:河北省卫生厅医学科学重点资助项目(04062);河北省教育厅博士基金资助项目(B2004122);石家庄市科技攻关项目
(04146173A)}河北医科大学博士基金资助项目(040028)
作者简介:齐锦生(1960一),男,河北医科大学生物化学与分子生物学教研室副主任,中西医结合研究所糖尿病室主任,教授,博士,硕士
生导师,中国中西医结合学会青年工作委员会委员,中华教育艺术研究会理事,主要从事糖尿病及其并发症的中医药防治。
Tel:(0311)86265639E—mail:qijinshen9777@163.corn
万方数据
·732· 中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月
(华美生物技术有限公司),DAB(中山生物技术有
限公司),其余试剂均为国产分析纯。
1.3 ONOO一的合成:ONOO一采用淬灭流动反应
方法合成[8]。合成的ON00一用日本岛津公司产
UV一2201型紫外分光光度计检测,可见在302nm
处有典型的吸收峰,煮沸10min后302nm处吸收
峰消失,符合文献报道的ONOo一吸收光谱特征凹]。
1.4成骨细胞的培养:无菌条件下,取24h内新生
SD乳、鼠颅盖骨,用平衡盐溶液冲洗数次后,在
0.25%胰蛋白酶溶液中消化15min,剔除骨表面被
膜及软组织。用D—Hank’S液冲洗数次,剪成1~3
mm3大小的骨片。将骨片移到0。1%胶原酶Ⅱ中,室
温振荡消化45min后,弃去消化液,用D—Hank’S
液冲洗数次。将消化后骨片移入100mL培养瓶中,
按组织块法进行培养口0|。
1.5 Hoechst33258染色法检测丹皮酚拮抗
ON00一致成骨细胞凋亡的作用:细胞传至5~7代
时,用胰蛋白酶消化后,用含10%FBS的DMEM
培养基调细胞浓度为3×104/mL,在6孑L板(每孑L
内加一盖玻片,以备细胞攀爬)中分别加入3mL
培养,待成骨细胞70%融合后,弃去原培养液,然
后在6孔板中,从左至右每竖排两孔为一组,分别
加入1mmol/LONOO一液、丹皮酚(0.1mmol/
L)+0N00一(1mmol/L)混合液、10%FBS—
DMEM液(丹皮酚和ONOO一的溶液浓度根据前
期工作[1h123和预试验结果确定,可较好观察
ONOo一致成骨细胞凋亡及丹皮酚的拮抗效果,且
单加丹皮酚对成骨细胞无明显影响),每孔3mL,作
用30min后弃去,再于每孔中分别加入含10%
FBS的DMEM液3mL,作用12h后,按
Hoechst33258染色法常规操作,进行Hoechst荧光
染色,观察ON00一致成骨细胞凋亡作用及丹皮酚
的保护作用,并与正常组比较。每个培养成骨细胞的
盖玻片上,任选10个视野计数固缩核和细胞核总数
来计算细胞凋亡率。实验采用双复孑L,共3批次。
细胞凋亡率一固缩核数/细胞核总数×100%
1.6 TUNEL法检测丹皮酚拮抗ON00一致成骨
细胞凋亡的作用:细胞培养及影响因素同1.5项。取
出培养成骨细胞的盖玻片,PBS洗两次,4%多聚甲
醛固定30min,其余步骤按照TUNEL试剂盒说明
书进行操作,每一样品均设立阴性对照,即不加关键
的TdT酶,DAB显色,细胞核内出现棕黄色颗粒为
染色阳性细胞即凋亡阳性细胞。每张片随机选取10
个高倍视野(×400),计数凋亡细胞数,最后取10
个视野的平均数。记录凋亡细胞数和末凋亡细胞数,
并计算细胞凋亡率,观察ONOO一对成骨细胞凋亡
的影响及丹皮酚的保护作用,并与正常组比较。实验
采用双复孑L,共3批次。
1.7统计学处理:计量资料均以至±s比较,组间比
较均采用两样本均数t检验。所有数据均通过
SAS6.12统计分析软件进行分析。
2 结果
2.1 Hoechst33258染色法检测结果:在荧光显微
镜下(激发光波长340nm),活细胞核呈弥散均匀
荧光,细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密
的颗粒块状荧光,呈现出细胞凋亡的典型变化,见到
3个或3个以上的DNA荧光碎片。ONOO一(1
mmol/L)组和丹皮酚(0.1mmol/L)+ONOO一(1
mmol/L)组均可见3个或3个以上的DNA荧光碎
片,表明成骨细胞发生凋亡,但丹皮酚(o.1mmol/
L)+ON00一(1mmol/L)组发生的凋亡细胞数显
著少于ONOO一(1mmol/L)组,正常组偶见DNA
荧光碎片。提示ON00一(1mmol/L)可致细胞凋
亡,丹皮酚(o.1mmol/L)对其致细胞凋亡有较强
的抑制作用,见表1。
2.2 TUNEL法分析结果表明,ONOo一(1mmol/
I。)组细胞着染率明显高于正常对照组,丹皮酚
(0.1mmol/L)+ONOO一(1mmol/L)组介于两组
之间,提示ONOO一(1mmol/L)可致细胞凋亡,丹
皮酚(O.1mmol/L)对其有较强的抑制作用,见表
1和图1。
表1各组大鼠成骨细胞凋亡率比较(;士s,n一30)
Table1 Comparisonofosteoblastapoptoticrate
ofratsineverygroups(;士s,n=30)
组别
剂量/ 细胞凋亡率/%
(mmo[·L1)H0echst33258法TUNEL法
与正常组比较:⋯P与ONOO一组比较:AAAp⋯P△△△P<0.001u5ONOO—group
3讨论
糖尿病骨质疏松是继发性骨质疏松发病率最高
的一型。也是糖尿病严重慢性并发症在骨骼上的特
征性病变,其组织学机制主要是由于骨重建负平衡
所致。成骨细胞的过度凋亡导致骨形成减少,可引发
骨质疏松[1引。
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·733·
ONOO(1nnnoltLl组 母皮酚to.1nmaoFL)+ONOO(1tlllTlO忱)组 正需组
图1 TUNEL法对凋亡成骨细胞的分析
Fig.1TUNELAnalysisofapoptoticsteoblast
过氧亚硝基阴离子(ON00一)及其高能态衍
生物是目前已知的氧化作用最强的一类物质,构成
了氧化应激损伤新机制的物质基础。已有相当多的
证据表明:氧化应激在糖尿病慢性并发症发病中起
关键作用[1“。大量的ON00一造成成骨细胞结构破
坏、细胞死亡或功能障碍,可能是导致糖尿病骨质疏
松的重要原因之一。迄今为止,在机体内尚未发现有
清除0NOO一的特异性酶。应用0N00一的清除剂
GED可使糖尿病大鼠的发病率从80%降至17%;
发病时间推迟10周[1⋯。为此从中药中筛选具有强
抗氧化能力的中药,尤其是有拮抗0N00一作用的
中药,对防治糖尿病严重慢性并发症有广阔的应用
前景。
药物对氧化应激的保护作用通常主要通过直接
捕获氧自由基来减轻细胞损伤,或者通过提高应激
情况下细胞内抗氧化酶的活性,对抗氧自由基损
伤[1“。已有资料证明,丹皮酚对Fenton反应生成的
·OH有明显清除作用,其清除活性高于·0H特
异性清除剂甘露醇[171;研究表明丹皮酚对0:7有直
接清除作用[18|。以丹皮酚的化学结构分析,因其含
有酚性羟基,易与氧原子不对称的单电子相互作用
氧化形成醌类物质,使自由基能量下降,因而有效地
保护细胞膜和线粒体膜中不饱和脂肪酸的过氧化,
维持膜完整性和功能。本课题组已对丹皮酚在成骨
细胞增殖与分化方面做过初步探讨Etl,lz]。本实验在
细胞凋亡水平上加以研究,并应用丹皮酚为干预因
素,旨在为中药防治糖尿病严重慢性并发症提供实
验依据。
Hoechst33258是目前最常用的、无毒、水溶性、
特异的DNA荧光染料,与A—T键结合,这种染液
对凋亡细胞核呈强亮的蓝色荧光,坏死细胞不被染
色,正常细胞仅呈微弱荧光。TUNEL是分子生物学
与形态学相结合的研究方法,也是一种对凋亡晚期
检测效果较好方法,能准确地反映细胞凋亡最典型
的生物化学和形态学特征及凋亡在组织中的分布情
况,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度较高。本
实验采用两种方法检测,结果更可靠。
本实验结果显示:oNoo一(1mmol/I.)能导致
成骨细胞凋亡,丹皮酚(0.1mmol/L)能拮抗
ON00一(1mmol/L)所引起的大鼠成骨细胞凋亡。
丹皮酚作为植物药的一种单体成分,具有很强的抗
氧化效果及消除ONOO一作用,在防治糖尿病严重
慢性并发症方面,极具应用价值,其作用机制需进一
步研究。
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萌动激活灵芝孢子促进大鼠受损伤的脊髓运动神经元轴突再生的作用
张 伟1,曾园山r,陈小君2,陈穗君1,钟志强1
(1.中山大学中山医学院组织胚胎学教研室神经科学研究室,广东广州 510080;
2.中山大学肿瘤防治中心肿瘤研究所,广东广州 510089)
摘 要:目的探讨萌动激活灵芝孢子对大鼠坐骨神经切断再吻合后受损伤运动神经元轴突再生的影响。方法
对单侧坐骨神经切断再吻合后的大鼠ig给予萌动激活灵芝孢子,通过电生理、荧光金(FG)逆行标记和组织学等
方法观察受损伤运动神经元轴突再生情况。结果 坐骨神经切断再吻合6周后,灵芝孢子组坐骨神经再生轴突的
动作电位潜伏期及峰峰值的恢复率以及运动神经元胞体的荧光金逆行标记率均明显高于对照组,灵芝孢子组大鼠
腓肠肌萎缩程度也轻于对照组。结论萌动激活灵芝孢子能够促进大鼠坐骨神经切断再吻合后的脊髓受损伤运动
神经元轴突再生。

关键词:萌动激活灵芝孢子;运动神经元;轴突再生;坐骨神经切断再吻合
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2006)05—0734—04
Effectofgermination-activatedG nodermasporesonaxonalregeneration
ofinjuredmotorneuronsinratspinalcord
ZHANGWeil,ZENGYuan—shanl,CHENXiao—jun2,CHENSui—junl,ZHONGZhi—qian91
(1.DivisionofNeurosciences,DepartmentofHistologyandEmbryology,ZhongshanMedicalCo lege,SunYat—sen
University,Guangzhou510080,China;2.CancerResearchInstitute,Centerof a cPrevention,
SunYat—senU iversity,Guangzhou510089,China)
Abstract:ObjectiveToexploreth ffectsofgermination.-activatedG nodermaspore(GASP)on
axonalregenerationofinjuredmotorneuroninratspinalcordfollowingsciaticnervecutandanastomosis.
MethodsRatwasigadministeredbyGASPafterthesciaticnervewascutandanastomosedunilaterally
andtheaxonalregenerationofinjuredmotorneuronwasobservedby lectrophysiology,Fluorogold(FG)
retrogradelabeling,andhistologictechniques.ResultsAftersixweeksof ciaticnervecutandanastomo—
sis,ther coveryratiooflatencyandamplitudeofactionpotentialofregeneratedaxonatsciaticnerveand
theratioofFG—retrogradelabeledmotorneuronalsomainGASPgroupwereallhigherthanthoseincon—
trolgroup.ThegastrocnemiusatrophydegreeinGASPgroupwasalsolowerthanthatincontrolgroup.
ConclusionGASPcanpromotetheaxonalregenerationofinjuredmotorneuroninratspinalcordfollow—
ingsciaticnervecutandanastomosis.
Keywords:germination--activatedGanodermaspore;motorneuron;axonalregeneration;sciaticerve
CUtandanastomosis
祖国传统中药用于周围神经损伤的研究由来已 久,人参、黄芪和当归等均有促进周围神经再生的作
收稿日期:2005—09—12
*通讯作者曾园山E-·mail{yzeng@‘gzsums.edu.caTel:(020)87331452
万方数据
丹皮酚拮抗过氧亚硝基阴离子致大鼠成骨细胞凋亡的作用
作者: 齐锦生, 王辉, 牛涛, 张秉山, 张晓琳, QI Jin-sheng, WANG Hui, NIU Tao,
ZHANG Bing-shan, ZHANG Xiao-lin
作者单位: 齐锦生,王辉,张晓琳,QI Jin-sheng,WANG Hui,ZHANG Xiao-lin(河北医科大学,生物化学与
分子生物学教研室,河北,石家庄,050017), 牛涛,张秉山,NIU Tao,ZHANG Bing-shan(石家
庄市第二医院外科,河北,石家庄,050051)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2006,37(5)
被引用次数: 5次

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本文链接:http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200605036.aspx