全 文 ：中革蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月·575·
金丝桃苷对原代培养的大鼠心肌细胞缺氧一再给氧损伤的影响
李庆林”，陈志武2，马传庚2
(1安徽中医学院药学院安徽省现代中药重点实验室，安徽台肥230038
2．安徽医科大学药理学研究室，安徽台肥230032)
摘 要：目的探讨金丝桃苷对原代培养的大鼠心肌细胞缺氧一再给氧损伤的保护作用。方法 采用显微镜和
MTT法观察缺氧冉给氧导致培养的大鼠原代心肌细胞的损伤和金丝桃苷的保护作用；流式细胞术观察金丝桃昔
对心肌细胞凋亡的影响；并观察乳酸脱氯酶(I．DH)水平的变化和细胞内ca“裱度的变化。结果金丝桃苷对缺
氧再给氧导致的心肌细胞损伤有一定的保护作用，可以抑制心肌细胞凋亡的发生；0．s～50I-m(d／l。金始桃苷可以
剂量依赖性地抑制心肌细胞中1．DH的形成和细胞内(：a卜超载。结论金丝桃苷具有对抗缺氧一再给氧导致心肌
细胞损伤的作用，其机制可能与抑制心肌细胞凋亡、钙超载和抗自由基形成有关。
关键词：金丝桃苷；心肌细胞；细胞凋亡；缺氧再给氧
中囤分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(8006)04 057503
Effectsofhyperinonmyocardialcellinjuredbyhypoxia—reoxygenation
inprimaryculturedrat
LIQing—linl．CHENZhi—WU2．MAChuan—geng2
(IAnhuiKeyLaboratoryofModernChineseMateriaMedica．SchoolofPharmacy，AnhuiCollegeofTraditionalChinese
Medicine，He(el230038，China；2．DepartmentofPh macology．AnhuiMedicalUniversity，Hefei230032，China)
Keywords：hyperin；myocardialeell； poptosis；hypoxiareoxygen tion
在缺氧和再灌注过程中，由于心肌的局部缺血、
缺氧和血液再灌注，大量的自由基产生和细胞内钙
超载，造成心肌细胞的损伤i这些损伤包括心肌细胞
的坏死和凋亡。通过干预抑制心肌细胞损伤的发生
可以有效地保护心肌对抗缺血再灌注导致的损
伤1l。金丝桃苷为黄酮醇苷类化合物，含有多个酚羟
基结构。研究报道金丝桃苷有多种药理活性，可以抗
心肌脂质过氧化、抑制钙超载o’⋯。本实验进一步研
究金丝桃苷对心肌细胞凋亡的保护作用和机制。
1材料
1．1药品：金丝桃苷(hyperin)由安徽省医学科学
研究所制备，质量分数≥96．0％，临用前以DMSO
溶解，PBS稀释至所需浓度。
1．2主要试剂：硝苯地平(Nifedipine)购自中国药
品生物制品检定所；Fura一2／AM、四甲基偶氮唑蓝
(MTT)购自Sigma公司；Hank
7
s培养基、胰蛋白
酶、DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；碘
化丙啶(PI)、DNA凋亡试剂盒(Annexin／PI)购自
BeckmanCoulter公司；乳酸脱氢酶(I。DH)测试盒
购自南京建成生物工程研究所；连二亚硫酸钠
(Na：S：O。)购自宜兴市化学制剂三厂；其他试剂均
为市售分析纯。
1，3动物：SD乳鼠，2～3d，由安徽医科大学实验
动物中心提供(皖实动准01号)。
1．4仪器：MCO--15ACO。培养箱为三洋公司产
品；DG3022A酶标仪为南京分析仪器厂产品；日本
Olympus荧光倒置显微镜；Coulter公司FAcs
420型流式细胞仪；650—60荧光分光光度汁为日
本Hitachi公司产品。
2方法
2．1乳鼠心肌细胞的培养：无菌条件下取2～3d
SD乳鼠心室，用pH7．2～7．4的Hank’S液洗涤3
次，剪碎，0．125％胰酶37c消化10min，弃消化
液，再用0．25％胰酶37c消化30rain，Hank7 S
液洗涤3次，滴管吹打至细胞分散。用DMEM生长
液(含20％胎牛血清)调整细胞浓度为2×108／
mI．，加入细胞培养瓶中，37C、5％co!温箱中培养
4h后，弃贴壁细胞，台盼蓝染色观察细胞成活率，
达95％以上后再将细胞悬液加至96孔细胞培养
板，每孔100pL，置37C、5％CO。温箱中培养7d。
2．2金丝桃苷对心肌细胞缺氧一再给氧损伤的影
响：培养7d的心肌细胞改用5mmol／L连二亚硫
收稿日期：2005—06—20
*通讯作者李庆林Tel：(055I)5169237Fax：<0551)5169044Email：Qingtinlee@hotmailom
万方数据
·576· 中草嚆ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月
酸钠配制的无糖Hank7S液培养24h后，再换成
DMEM培养基，于37C、5％C02温箱中继续培养
24h，造成心肌细胞的缺氧再给氧损伤模型口]。给
药组用不同的培养液稀释药物，金丝桃苷的终浓度
分别为0．5、5．0、50．0Pmol／L，硝苯地平的终浓度
为5．0pmol／l。；正常对照组加入等量的培养基，不
采用缺氧一再给氧损伤模型；其他各组造模后再分别
于37c孵育6、9h，用显微镜观察培养的心肌细胞
的形态变化，然后每孔取上清液10“L测定LDH
的活性；剩余的液体按照MTT法测定细胞活力，在
酶标仪上，选择490nm波长测定吸光度(^)值。
分别收集同样培养处理各组细胞，用PBS洗涤
2次后，制成1×106／mL的心肌细胞悬液，70％乙
醇固定，然后加入DNA反应试剂和PI染色液，
4 C避光保存30min，用流式细胞仪在激发波长为
488nm处测定，根据计数10000个细胞的各期
DNA的量，计算细胞凋亡率。
2．3金丝桃苷对心肌细胞内Ca。+浓度([Ca2+]．)
的影响：培养的心肌细胞按文献报道方法01测定心
肌细胞静息状态下[Ca2+]。的变化：培养1周已贴壁
的心肌细胞，去除培养基，加入终浓度为5tumol／L
的Fura一2／AM，37C恒温振荡孵育45min，离心，
用Hank7S液冲洗两次，置于Hank7S液中备用。取
金丝桃苷(o．5、5．o、50．opm l／I。)与心肌细胞悬
液，在37C、50％CO。培养箱中培养20min。KCI
(50mmol／L)、CaCI2(2retool／L)、NE(10timol／L)
测定前加入，然后立即采用激发渡长为340nm
(k。)，发射波长500nm(^。。)测定不同条件下的细
胞悬液的荧光强度(F)，然后根据仪器所测定的最
大荧光值(F。；)和最小荧光值(F～)，由以下公式
计算[Ca’]，，并对细胞的自发荧光的影响进行
校正。
[ca抖]．--Ka×(F—F。。)／(F妇。F)
Kd为Fura一2与ca抖反应的解离常数，为224nmol／L
2．4数据处理：实验数据均用z±s表示，采用
SPSS软件进行t检验分析。
3结果
3．1心肌细胞形态学改变：在倒置显微镜下观察发
现，心肌细胞培养至第7天，胞体呈圆形、梭形、三角
形、多边形等，在细胞团周围呈放射状伸展，形成致
密的单层。在缺氧再给氧损伤后，心肌细胞先变得
肿胀，随后呈拉网状，细胞搏动逐渐减弱、减慢至停
止，最终细胞圆缩，脱落。而受药物保护的细胞，形态
无明显改变，或细胞损伤程度减轻，仅见部分细胞肿
胀或轻度拉网。结果见图1。
3．2金丝桃苷对缺氧再给氧损伤心肌细胞的影
响：缺氧再给氧可以引起心肌细胞的损伤和LDH
的释放，金丝桃苷可以剂量依赖性抑制LDH的释
放(P
3．3 金丝桃苷对心肌细胞[Ca2一]．的影响：心肌细
胞在正常的培养条件下，测得细胞外Ca2|的浓度为
1．3mmol／L时，[Ca2+]．为(78．6土9．4)nmol／L；
金丝桃苷(0．5、5．0、50．0pmol／L)对心肌细胞静
息状态下[Ca2+]。无明显影响，其值分别为(76．2士
8．O)、(78．4±11．1)、(80．8土10．5)nmol／L；心肌
细胞培养液中加入2mmol／LCaCl。后，细胞
[ca”]．升高，而加入药物后，心肌细胞[Ca“]。也随
之上升，但组间比较无明显差异。结果见表2。
当心肌细胞培养液中加入50mmol／LKCI、10
umol／LNE后，心肌细胞ECa2+]．分别升高到
(401．8±35．6)、(189．4±20．3)nmol／L；金丝桃苷
可以明显抑制不同刺激引起的Eta“]。升高，结果见
表2。
A一正常组B缺氧再给氧组c金丝桃苷(5．0vmol／L)组
AnormalgroupBhypoxiareoxygenationgroupC—hyperin(5．0umol／1．)group
圈1金丝桃苷对原代培养的大鼠心肌细胞缺氧一再给蕾损伤的保护作用
Fig1 Protectionofhyperinonmyocaradialcellnjuredbyhypoxia—reoxygenationinprimaryculturedrat
万方数据
中革菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月
表1 金丝桃苷对原代培养的缺氲一再给氩损伤心肌细胞的影响(T士s)
Table1 Effectofhyperinonmyocardialcellinjuriedbyhypoxia—reoxygenationinprimaryculturedat(；±s)
与缺氧一再给氧组比较：。P<0．05～P
Table2 EffectofhyperinollEca”lofmyocardialcellinprimaryculturedrat(；±5，一6)
与正常对照组比较；一P
缺血一再灌注可以导致心肌细胞的损伤，研究表
明自由基和细胞内钙超载引起细胞损伤乃至细胞凋
亡的发生。心肌细胞的凋亡是缺血性心肌细胞损伤
病变的重要形式之一，在心肌细胞凋亡的发生过程
中，缺血是细胞凋亡的诱导者，再灌注具有加速心肌
细胞凋亡的作用。而其中氧自由基的形成是再灌注
期间组织损伤的病理机制之一口]。
金丝桃苷是黄酮类成分，研究已表明其有清除
自由基的作用03；金丝桃苷的抗自由基作用是直接
作用的结果，还是通过抑制Ca2+内流，以钙拮抗剂
样作用发挥r保护心肌的作用效果；或者是两种方
式兼而有之未见文献报道。本研究表明在静息状态
下，金丝桃苷对心肌细胞内[Ca2+]．无明显影响，提
示了金丝桃苷对心肌细胞Ca”的被动扩散无影响。
当细胞外液中加入了50mmol／I，KCI时，高钾引起
心肌细胞膜电位的升高(去极化)，进而心肌细胞膜
上的电压依赖性钙通道被激活，细胞外的Ca2+内
流，引起细胞内的Ca2+超载。加入NE可以兴奋心
肌细胞上的a．受体，通过激活G蛋白与磷脂酶C
(PLC)，IP。生成增加，使细胞内Ca24释放；同时也可
以直接通过引起钙通道的改变使细胞外的Ca2+进
入细胞内”j。结果显示金丝桃苷可以浓度依赖性的
抑制高钾去极化引起的心肌细胞[Ca。‘]．增高作用，
对NE引起的[Ca2+]．升高也呈现出一定的抑制作
用。因此认为金丝桃苷对心肌的电压依赖性和受体
操纵性钙通道均有不同程度的抑制作用．从而减少
心肌细胞的[Ca2’]．，表现出抗心肌缺血一再灌注损
伤作用。本实验结果表明金丝桃苷可能通过抗自由
基的生成和抑制钙离子通道发挥保护缺血心肌的作
用。其机制可能首先是其抗自由基形成．再进一步通
过钙拮抗作用发挥保护心肌的作用效果。而其更深
入的作用机制有待于进一步研究。
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万方数据
金丝桃苷对原代培养的大鼠心肌细胞缺氧-再给氧损伤的影响
作者： 李庆林， 陈志武， 马传庚， LI Qing-lin， CHEN Zhi-wu， MA Chuan-geng
作者单位： 李庆林,LI Qing-lin(安徽中医学院药学院,安徽省现代中药重点实验室,安徽,合肥,230038)
， 陈志武,马传庚,CHEN Zhi-wu,MA Chuan-geng(安徽医科大学,药理学研究室,安徽,合肥
,230032)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(4)
被引用次数： 13次
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