全 文 ：·244· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
4讨论
HSV—I的基因为双链DNA，易与宿主DNA
发生整合。病毒严格寄生在细胞内，使得药物杀伤病
毒的同时对机体细胞也有损害。现有的抗疱疹病毒
化学药物因为毒性太大或耐药性的产生，其临床难
以取得令人满意的效果。传统中药的多靶点作用机
制、较少不良反应、无耐药性等优点表现出诱人的应
用前景，筛选高效低毒的抗病毒中药是当前抗病毒
研究热点之一。对清热解毒类中药的现代研究发现
其中不少中药具有抗病毒作用，除杀灭病原微生物
外，还具有多种免疫学活性，能非特异性增强免疫系
统功能，改善机体状况，增强对各种感染的抵抗力。
如果能够明确这类药物的抗疯毒作用，其意义是不
言而喻的。
板蓝根是清热解毒类中药的典型代表，应用于
临床多年，其传统清热解毒功效已得到认同，尤其是
对于病毒感染性疾病的治疗。国内外学者对板蓝根
进行了大量的研究，但是板蓝根中究竟何种成分起
主导作用，是作用于单一靶点还是作用于不同部位
协同表现其抗病毒作用尚无定论。本实验初步研究
了板蓝根的抗病毒的活性成分及作用机制，结果显
示，板蓝根不同化学部位的抗病毒作用强度有较大
差异，但其相关活性物质并未集于某一个单一的化
学部位，表明板蓝根是通过多种有效成分，多环节、
多途径地发挥协同作用而表现出抗病毒功效。抑制
HSV—I的生物合成是板蓝根抗病毒的主要作用途
径，其中Ⅱ部位尚能直接杀灭病毒。HSV—I是有包
膜的病毒，最外层的包膜由脂质和糖蛋白组成，其中
任何一种成分改变，即可使包膜变性，从而灭活病
毒，故推测Ⅱ部位中的某些化学成分能使病毒包膜
变性以灭活病毒。本研究结论将指导笔者进一步提
取分离板蓝根中与抗病毒功效相符的活性物质，并
为深入探讨其作用机制提供科学依据。
References：
Eli WangJ，LiYX，ZhangY．Cloning，expressionofHSV—IgG
genefragmentandidentificationofthexpressedproteinEJ]．
JChinBiotechnol(中国生物工程杂志)，2003，23(6)：55—
63．
Ez3YanM，WangYC，XiaDZ．EffectionofFlosLoniceraeCo
solutionagainstherpessimplexvirusI invitro口]．JChin
PractOphthalmol(中国实用眼科杂志)，1998，16(2)：
82—84．
[3]LiaoZM．ClinicalapproachofBanlangenInjectionreating
herpessimplexk ratitisl-J]．JChinPractOphthalmol(中国
实用眼科杂志)，2003，21(3)：232—233．
I-4]LiDH，TianZG，ZhangJ，eta1．TheuseofMTTassayfor
therapidtestingofcytotoxicityofdrugsagainston—solid
tumorcellsI-J]．Cancer(癌症)，1991，10(3)：226．
蟾蜍灵对白血病U937细胞生长抑制和凋亡诱导作用
贾彩云1，呼文亮2，俞小瑞3，于杰3，徐瑞成2
(1．河南大学医学院细胞和分子免疫学研究室，河南开封475001；2．武警医学院生物化学教研室，天津300162；
3．西安交通大学医学院生物化学教研室，陕西西安710061)
蟾蜍灵是蟾蜍毒素的主要成分之一，蟾蜍毒素
具有强心、麻醉、解毒、止痛、开窍、醒神等药理作用，
已被广泛应用于临床。近年来发现，含有蟾蜍毒素的
中药制剂在体外能抑制多种肿瘤细胞生长，诱导白
血病细胞的分化。临床观察提示，含有蟾蜍毒素的中
药制剂对肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、白血病等具有明
显的抑制作用。Numazawa[1]研究表明，蟾蜍毒素的
各种成分以剂量依赖的方式抑制K562细胞生长。
在所有的蟾蜍毒素中，蟾蜍灵是诱导白血病细胞分
化最有效的成分，蟾蜍灵在较低浓度(1×10_8～
1×10_9tool／L)能够在较宽的范围内(有较宽的白
血病细胞谱)引起人白血病细胞分化[2’3]。在较高的
浓度(≥1×10-7mol／L)诱导人白血病细胞凋
亡[4]。本实验以蟾蜍灵单体作用U937细胞株，研究
其抑制自血病细胞生长和诱导凋亡作用。
1材料与方法
1．1药品、试剂和仪器：蟾蜍灵由天津药物研究院
制备，纯度大于99．5％，用无水乙醇配制成母液，用
D—Hanks液稀释，乙醇控制在体积分数小于0．1％
(预试验表明该体积分数的乙醇对细胞没有影响)。
收稿日期：2004—05—18
基金项目：天津市自然科学基金资助项目(013804311)
作者简介：贾彩云(1973一)，女，河南洛阳人，理学硕士，讲师，主要从事药物诱导肿瘤细胞凋亡及分子机制研究。Tel：(0378)5654398
E—mail：jlacy602@sina．eom，caiyunjia@henu．edu．cn
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月·245·
Hoechst33342、碘化丙啶(PI)、噻唑蓝(MTT)、二
甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品；TUNEL
试剂盒(InSituCellDetectionKit，AP)德国
Roche公司产品；Model550酶标免疫测定仪，美国
BioRAD；尼康E800荧光显微镜，日本。
1．2细胞培养：人髓性白血病细胞株U937细胞购
自中国医学科学院基础医学研究所。培养基为内含
20％灭活胎牛血清、80U／mL庆大霉素、0．01％
L一谷氨酰胺和0．304％NaHCO。的IMDM培养基。
于细胞处于对数生长期时加药。
1．3倒置光学显微镜观察原位培养细胞的形态学
改变：设空白对照组和蟾蜍灵(O．10、1．00、10．oo
pmol／L)组，每组设3个复孔。培养24h后加药，48
h后，在倒置光学相差显微镜下观察并拍摄记录。
1．4 MTT试验：将U937细胞调整至1×105／
mL，按每孑L1×104于100肚L接种96孔板，37℃、
5％CO。过夜，加入不同浓度的蟾蜍灵，分别以未经
药物作用的U937细胞和单纯的培养液作为阴性对
照和空白对照，每组设8个复孔。继续培养24h。每
孔加MTT(5g／L)20肚L，继续培养4～5h，离心，
弃上清液，每孔加DMSO200肛L，避光震荡约10
min。酶标仪检测570nm波长处的吸光度(A。，。)
值。按文献方法计算平均抑制率口]。
抑制率一(以阴性对照一A实验)／(A阴性对照一A空白对照)×100％
1．5 Hoechst33342一PI荧光染色：分别收集对照组
和蟾蜍灵(0．10、1．oo、10．00#mol／L)组处理24h
细胞各2×105个，PBS重悬，加入Hoechst33342一
PI(1：1)染液40肚L，使得Hoeehst33342终质量
浓度为10pg／pL，PI终质量浓度为50ug／uL，于
37℃孵育箱中染色8min，离心，弃上清液。加入
PBS50ttL，吹打，混匀，吸一点混和液滴于洁净玻
片上，盖片封片。于暗室中荧光显微镜下观察并记
录。质量控制：正常细胞、凋亡细胞着色(蓝色)，死亡
细胞着色(红色)。细胞记数依据上述特点，取连续4
个视野，每个视野细胞记数不少于80个计算细胞
的凋亡率。
1．6 DNA琼脂糖凝胶电泳：分别收集对照组和蟾
蜍灵(0．10、1．oo、10．00#mol／L)处理24h的细
胞，用PBS洗1遍，于1．5mL离心管中，离心沉淀
至2×106个细胞，去除上清液，加入50肛L细胞裂
解液E10mmol／LTris，C1(pH8．0)、10mmol／L
NaCl、10mmol／LEDTA、100mg／L蛋白酶K、1％
sDs]。吹打混匀，于37℃水浴保温使混合物变得
清亮，离心，去细胞碎片，以等体积的苯酚一氯仿
(1：1)抽提2次，以等体积氯仿抽提1次，吸上清
液于另一1．5mL离心管中。加入1／10体积的醋酸
钠和2倍体积的冷无水乙醇，过夜，离心10min，加
入TE(O．1mol／LTrisC1，pH8．0；10．00mmol／L
EDTA)和RNAase(10mg／mL) 肛L，37。C孵育
1h，溶解DNA，加上样缓冲液，在0．1％琼脂糖凝
胶上电泳，室温恒流75mA，3～4h，结果在紫外投
射仪上观察。
1．7 原位缺口标记(TUNEL)检测方法：分别于
6、12和24h收集1．00#mol／L蟾蜍灵处理组细胞
和对照组细胞各1×106个，PBS洗3次，进行细胞
涂片，用新鲜配制的多聚甲醛(4％于0．10mol／L
的PBS配制，pH7．4)于15～25℃固定1h，PBS
洗3次，置2～8℃预冷穿透液0．1％的TritonX一
0(0．1％TritonX一100、0．1％枸橼酸钠)2min。
PBS洗2次，以后操作按试剂盒说明书进行。加显
色缓冲液(100mol／LTrisC1pH9．5、100mol／L
NaCl、50mol／LMgCl2、1％体积的BCIP／NBT)
50～100肛L，于15～25oC孵育10min，PBS洗涤，
水封片，镜下观察并记录。质量控制：选取连续的6
个视野，每个视野细胞记数不少于80个，细胞核或
细胞浆(DNA逸出)蓝紫色为阳性细胞，细胞核及
细胞浆不着色细胞为阴性细胞，计算细胞的凋亡率。
1．8 统计分析：数据输入Excel进行管理，采用
SPSSl0．0软件进行统计学分析。MTT试验各组问
的差异采用方差分析(Post—HocLSD法)，组间凋
亡率的差异采用X2检验。
2结果
2．1倒置光学显微镜下细胞的形态学变化：倒置显
微镜下，对照组U937细胞呈悬浮性生长，圆形，透
明，折光性好，大小均一，形态一致。蟾蜍灵组U937
细胞皱缩变小，细胞膜完整，出现发泡现象，并有膜
包裹的凋亡小体出现。
2．2蟾蜍灵抑制白血病细胞的生长：结果见表I。
蟾蜍灵可抑制白血病U937细胞的生长，与对照组
相比，各浓度组均能显著抑制白血病U937细胞的
生长(P
长抑制作用呈时间和剂量依赖性[除0．0500、
0．100#mol／L组外，其余各组间两两比较差异非
常显著(P<0．01)]。本实验结果显示，在
0．0010～1．000／lmol／L蟾蜍灵均能抑制U937
细胞生长。
2．3 Heochst33342一PI染色结果：对照组U937细
万方数据
·246· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
表1蟾蜍灵对U937细胞的生长抑制作用(；±s，弹一6)
Table1 Inhibitionofbufalinongrowth
ofU937cells(；±F，露一6)
与对照组比较：一P
理组U937细胞出现典型的凋亡形态学改变，细胞
体积变小、胞浆浓缩、核固缩、核碎裂、凝集染色质荧
光强度增强，并有膜包裹的凋亡小体形成。计算各处
理的凋亡率，结果显示0．10、1．00和10．00／Mmol／L
蟾蜍灵作用U937细胞24h，细胞凋亡率分别为
18．85％、80．87％和92．08％，随着浓度的升高，凋
亡率升高，统计分析结果显示各组间差异显著(P<
0．01)。可见0．10～10．00Fmol／L蟾蜍灵可在较短
的时间内引起U937细胞明显凋亡。
2．4 DNA琼脂糖凝胶电泳结果：DNA在核小体
之间按180bp及180bp整数倍的片段断裂是细胞
凋亡的早期事件，DNA电泳时出现特征性DNA梯
状带。0．10、1．00和10．00tlmol／L蟾蜍灵作用
U937细胞24h，电泳结果显示，对照组没有出现梯
状带，0．10tLmol／L组出现较淡梯状带，10．00
Fmol／L组出现的梯状带带形较多，带的亮度较强，
1．00ttmol／L组相对于10．00,umol／L组带形相对
较少，显示蟾蜍灵对U937细胞凋亡的诱导作用呈
剂量依赖性。结果见图l。
2．5原位缺口标记(TUNEL)法检测结果：1．00
Fmol／L蟾蜍灵诱导U937细胞凋亡呈时间依赖性。
蟾蜍灵分别作用6、12、24h，U937细胞凋亡率分别
为30．52％、51．32％、65．67％。统计学分析结果显
示：与对照组相比，随着作用时间延长，U937细胞
凋亡率呈现升高趋势(P<0．01)。
3讨论
本实验采用目前公认的药敏试验中最为推崇的
MTT法进行药敏试验[6]，来判定蟾蜍灵在体外对
髓性白血病U937细胞的抗增殖作用。结果表明蟾
蜍灵在0．001Fmol／L即可明显地抑制髓性白血病
U937细胞的生长(P<0．01)，增加蟾蜍灵浓度抑
制作用更加明显(P
M一标记组A～对照组BuD-塘蜍灵
10．00、1．00、0．10Fmol／L组
M—markergroupA—controlgroupB—D—bufalin10．00．
1．00，0．10tlmol／Lgroups
图1 DNA琼脂糖凝胶电泳结果
Fig·1AgarosegeleIectrophoresisofD刊A
血病U937细胞对蟾蜍灵敏感性良好。
已有研究表明蟾蜍灵能够引起HL一60细胞凋
亡[4]。本研究说明蟾蜍灵诱导人U937细胞凋亡，并
且呈时间和剂量依赖关系。用0．10tlmol／L蟾蜍灵
作用U937细胞24h，在倒置光学相差显微镜下观
察到细胞中出现小泡，随后降解消失，荧光双染显示
染色质凝集、断裂，凋亡小体形成。这些结果说明蟾
蜍灵诱导U937细胞凋亡。原位缺口标记法显示
1．00ttmol／L蟾蜍灵作用U937细胞6h，即可出现
30．52％的阳性细胞，并且随着时间延长及浓度的
升高凋亡率明显升高(P
型的核酸断裂的梯状带，被认为是程序性细胞死亡
的早期事件，表明蟾蜍灵能够以剂量和时间依赖的
关系诱导人白血病U937细胞凋亡。此结论与以前
的报道相一致，即蟾蜍灵能够抑制各种肿瘤的生长
而不影响正常细胞口]。
蟾蜍灵最可能的膜受体为Na+，K+-ATPase，
因为在各种肿瘤细胞胞浆膜上该酶的活性可被蟾蜍
灵抑制。蟾蜍灵对人肿瘤细胞的特异性作用可能归
因于人细胞膜上Na+，K+-ATPase特异结构[8]。从
Na+，K+-ATPase到Ras的信号传导途径还不清
楚。蟾蜍灵诱导凋亡信号传导途径及分子机制还需
进一步研究。
References：
11]NumazawaS，ShinokiM，ItoH，eta1．InvolvementofNa+，
K+一ATPaseinhibitioninK562celldifferentiationinducedby
bufalinrJ]．JCellPhysiol，1994，160(1)：113—120．
[2]ZhangL，NakayaK，YoshdaT，eta1．Bufalinsapotent
inducerofdifferentiationofhumanmyeloidleukemiacells
[-J-I．BiophysResCommun，1991，178：686．693．
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月·247·
[3]ZhangL，NakayaK，YoshidaT，et1．Inductionbybufalin
ofdifferentiationofhuman1eukemiaeellU937，andMLl
cellstowardmacrophage／monocyte—likecellsanditspot nt
synergisticeffe tonthedifferentiationofhumanleukemia
cellsincombinationwiththerinducers[J]．CancerR目，
1992，52：4634-4641．
[4-1YutakaM，NobukoK，ShigeoN，eta1．Bufalininduces
apoptosisandinfluencesth xpressionofapoptosis—related
genesinhumanleukemiacells[J]．LeukemiaRes，1995，19
(8)：549—557．
[53ChenXY，HuwL，XuRC，eta1．Theeffectofburalinon
growth—relatedgenexpressionofhumanhepatocareinoma
SMMC7721cellsanditscytotoxiceffectI-J]．ChinJPhar-
macolToMcol(中国药理学与毒理学杂志)，2001，15(4)：
293—296．
[6]ZhangJ，LiuGX，ZhouL，eta1．Primarycultureinvitro
andchemosensititytestofmalignanttumorcell[J]．BullA—
cadMilMedSci(军事医学科学院院刊)，1997，21(4)：280-
282．
[7]YongKJ，HidekazoO，NobukoK，以a1．Selectiveinh bi—
toryeffectofbufalinongrowthof umantumorcellsinvit—
ro：Associationwi htheinductionofapoptosisin1eukemia
HL一60cells[J]．J／,nJCancerRes，1994，85：645—651．
Is]NumazawaS，ShinokiM，hoH，eta1．InvoloementfNa+，
K+一ATPaseinhibitioninK562celldifferentiationinducedby
bufalin[J]．JCellPhysiol，1994，120：113—120．
黑翅土白蚁不同提取物的抗炎镇痛作用
王秀丽，王焕秀，徐彭，薛德钧4
． (江西中医学院，江西南昌330006)
白蚁因腐蚀木材、毁坏河堤而被视为害虫，然而
近年来人们越来越重视白蚁的食用、药用及其他方
面的用途。非洲、东南亚还有我国部分地区的人民喜
以白蚁为食叫；我国武汉将白蚁的提取物用于临床
治疗癌症也取得了较好的效果[1]。白蚁有许多品种，
笔者对品种之一的新药源黑翅土白蚁进行了化学成
分及生物活性研究，发现黑翅土白蚁机体内不仅含
有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖、微量元素、维生素等
营养物质，还含有各种烃类、甾体激素类、肟类、角鲨
烯及含氨、氯、氟有机物、杂环化合物等。这些众多的
化学物质应该是其诸多药理作用的物质基础。本实
验对其抗炎、镇痛作用进行观察。
1材料
1．1 样品：黑翅土白蚁Odontotermesformo anus
Shiraki鲜品产自江西鹰潭，由鹰潭市白蚁研究所熊
小生工程师鉴定。
1．2样品的处理
1．2．1 95％乙醇回流提取，经化学预实验可知，含
有甾体、萜类、皂苷等成分。回收乙醇后所得浸膏
(A)用蒸馏水溶解。
1．2．2利用超临界技术萃取脂溶性成分，所得残渣
按照常规方法用醋酸乙酯回流提取，经预实验可知，
亦含有甾体、萜类、皂苷等成分。所得浸膏(B)用蒸
馏水溶解。
1．2．3将新鲜白蚁用贝克曼高速冷冻离心机离心，
收稿日期：2004—05—22
基金项目：国家自然科学基金资助项目(20062003)
作者简介：王秀丽(1978一)，女，江西中医学院2002级研究生。
*通讯作者
离心条件为8000r／min，共20min，得上清液(C，
为深棕色)。经化学预实验可知，pH为5～6，含有酚
类、鞣质、多糖和苷类等成分，茚三酮反应亦呈阳性。
1．3实验动物：昆明种小鼠，雌雄兼用，由江西医学
院动物室提供，编号为021--9602。
1．4主要试剂：乙酰水杨酸，每片25mg，肠溶片，
由石家庄制药集团有限公司生产，批号为030102。
度冷丁，针剂，每支2mL，青海制药厂，批号为
20000912。
2方法与结果
2．1对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响[2]：取体重
为(20±2)g的小鼠80只，雌雄兼有，随机分为8
组：空白对照组、阳性药(乙酰水杨酸2×10_4
g／kg)对照组、A(6．51、3．25g／kg)组、B(1．2、
0．6g／kg)组、C(60、30g／kg)组。分别ig给药，其
中空白对照组和阳性药对照组给予蒸馏水，正常培
10d。末次给药阳性药对照组ig乙酰水杨酸，其余
各组正常ig给药。各组给药30min后，尾iv0．5％
伊文思蓝0．2mL，同时ip0．6％HAc0．2mL，30
min后，小鼠脱颈椎处死。用6mL生理盐水分次冲
洗腹腔，收集洗液，加生理盐水至10mL。放置20
min后，3500r／rain离心5rain，吸取上清液，于
722分光光度计590nlTl波长处测吸光度(A)值，
结果见表1。
2．2对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响：选用体重
万方数据
蟾蜍灵对白血病U937细胞生长抑制和凋亡诱导作用
作者： 贾彩云， 呼文亮， 俞小瑞， 于杰， 徐瑞成
作者单位： 贾彩云(河南大学医学院,细胞和分子免疫学研究室,河南,开封,475001)， 呼文亮,徐瑞成
(武警医学院生物化学教研室,天津,300162)， 俞小瑞,于杰(西安交通大学医学院生物化学
教研室,陕西,西安,710061)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(2)
被引用次数： 4次
参考文献(8条)
1.Numazawa S;Shinoki M;Ito H Involvement of Na+,K+-ATPase inhibition in K562 cell differentiation
induced by bufalin[外文期刊] 1994(01)
2.Zhang L;Nakaya K;Yoshda T Bufalin as a potent inducer of differentiation of human myeloid leukemia
cells 1991
3.Zhang L;Nakaya K;Yoshida T Induction by bufalin of differentiation of human leukemia cell U937,
and ML1 cells toward macrophage/monocyte-like cells and its potent synergistic effect on the
differentiation of human leukemia cells in combination with other inducers 1992
4.Yutaka M;Nobuko K;Shigeo N Bufalin induces apoptosis and influences the expression of apoptosis-
related genes in human leukemia cells[外文期刊] 1995(08)
5.ChenXY;Hu W L;Xu R C The effect of bufalin on growth-related gene expression of human
hepatocareinoma SMMC7721 cells and its cytotoxic effect[期刊论文]-中国药理学与毒理学杂志 2001(04)
6.Zhang J;Liu G X;Zhou L Primary culture in vitro and chemosensitity test of malignant tumor cell
1997(04)
7.Yong K J;Hidekazo O;Nobuko K Selective inhibitory effect of bufalin on growth of human tumor cells
in vitro: Association with the induction of apoptosis in leukemia HL-60 cells 1994
8.Numazawa S;Shinoki M;Ito H Involoement of Na+,K+-ATPase inhibition in K562 cell differentiation
induced by bufalin[外文期刊] 1994
引证文献(4条)
1.赵大洲.邱鹰昆.陈继永.刘淑梅.姜永涛 大孔树脂富集蟾皮总二烯内酯的工艺研究[期刊论文]-时珍国医国药
2006(10)
2.李强 蟾酥中蟾毒配基类化合物的抗肿瘤研究进展[期刊论文]-实用药物与临床 2009(2)
3.童志远 蟾酥抗肿瘤作用研究进展[期刊论文]-西南军医 2011(2)
4.闫祝辰 温化胶囊对人乳腺癌MCF-7和T-47D细胞株细胞增殖和细胞周期的影响[学位论文]硕士 2006
本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200502035.aspx