全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月·423·
圈2红景天属植物P2P，组合DALP电泳图
(箭头代表大花红景天特征带)
Fig．2DALPelectrophorogramofP2P3co bination
withP3samplesamplificationforplantsof
RhodiolaL． (arrowindicatescharacteristic
bandsofR．crenulata)
子鉴定的DNA标记有10多种，应用广泛的主要有
RFLP、RAPD、AFLP和核酸序列分析等。RFLP在
技术上比较费力、成本高、多态性少，RAPD反应系
统不稳定、可靠性差，AFLP和ITS在分子鉴定上优
点突出，但是AFLP为显性标记、技术难度高，ITS
测序资金耗费大。而DALP是共显性标记，能检测
出纯和基因型及杂和基因型，提供了完整的遗传信
息，技术难度低、耗费小。本实验首次把DALP技术
用在传统中药材的鉴定上，DALP技术的优点克服
了传统分子鉴定的缺点，共显性数据提高了数据可
信度，有望成为今后中药分子鉴定的首选技术。
致谢：在材料采集中受到和云峰、张时刚、晏婴
才等的大力帮助。
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ISSR—PCR在石斛种间鉴别中的应用
沈 颖，徐程。，万小凤，张铭
(浙江大学生命科学学院，浙江杭州 310012)
摘要：目的采用ISSR—PCR方法对石斛属9种植物进行鉴别，探讨不同种石斛在DNA分子水平上的差异。方
法选取10条由SSR组成的引物，对9种石斛进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析。结果10条引物中有7条
扩增出多态性条带。每条引物可检测的多态性位点最少7个，最多14个，扩增片段大小为220～1260bp。其中，引
物UBC一807和UBC一864具有较高的多态性条带比率，均可以独立将所有被测种区分开来。结论ISSR—PCR作为
一种简便、可靠的分子标记鉴定技术，可以作为石斛属种间鉴别的方法之一。
关键词：ISSR—PCR；分子标记；石斛属；鉴别
中图分类号：R282．710．3文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)03—0423—05
收稿日期：2004—05—10
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目(C03050204)
作者简介：沈颖(1978一)，女，硕士生，研究方向为植物遗传与分子生物学。Tel：(0571)88273341E—mail：sheny78@sohu．com
*通讯作者Tel：(0571)81859020E—mail：xuel23@zju．edu．cn
万方数据
·424· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月
ApplicationofISSR—PCRtoidentificationofdifferentD drobiumSw．species
SHENYing，XUCheng，WANXiao—feng，ZHANGMing
(CollegeofLifeScience，ZhejiangUniversity，Hangzhou310012，China)
Abstract：ObjectiveToidentifyninespeciesofDendrobiumSw．byinter—simplesequencerep ats—
polymerasech inr action(ISSR—PCR)methodandtoinves igatethedifferenceamongthespeciesofDen—
drobiumSw．atDNAmolecularlevel．MethodsTenprimersconstitutedbysimples quencerepeats
(SSR)weretestedforPCRandsepharoseelectrophoresisoftheninepecies．ResultsSevenoftheten
primersamplifiedpolymorphicbands．Thenumberofpolymorphicbandpositionsofeachprimerranged
from7to14，andthesizeoffragmentsrangedfrom220to1260bp．Theamplificationp ternsoftwo
primers，namelyUBC一807andUBC一864，werehigh rintermsofpolymorphicandamplifiedbandratio．
Eachofthemwasabletodistinguishallthexaminedspecies．ConclusionISSR—PCRprovidesaquick，
reliablemolecularmarkertechniqueforidentificationofdifferentspeciesofDendrobiumSw．
Keywords：inter—simplesequencerep ats—polymerasechainre ction(ISSR—PCR)；molecularmarker；
DendrobiumSw．：identification
石斛属(DendrobiumSw．)是兰科第2大属，许
多种具有重要的药用价值。石斛为传统名贵中药材，
具有补肾积精、益胃生津、滋阴清热等功效。由于其
种类繁多，历代本草著作称之为医工难辨之种类口]。
《中华人民共和国药典》规定的石斛来源有铁皮石斛
D．彬?cinaleKirmuraetMigo、粉花石斛D．10ddi—
gesiiRolfe、束花石斛D．chrysanthumWall．ex
Lindl．、金钗石斛D．nobileLindl．、流苏石斛D．
fimbriatumHook．等5种。药用石斛及其原植株的
鉴定标准参差不一，以往多从形态及生理生化等方
面进行辨别。近年来，随着PCR技术的不断发展，
DNA分子标记技术逐渐被应用于中药材的鉴定研
究。例如，RAPD技术已应用于柴胡[2]、丹参[31等的
分类及药材道地性研究。
ISSR(inter—simplesequencerepeats，简单重复
序列中问区域)扩增多态性是由Zietkiewicz等于
1994年创建的一种新型微卫星类分子标记技术[4]，
其原理是真核生物广泛存在简单重复序列(simple
sequencerepeats，SSR)，如(AT)n、(GAC)n等。利
用SSR设计引物，并在引物的57或37末端添加几个
非重复的锚定碱基，以保证引物与基因组DNA中
SSR的57或37末端结合。产生的条带相当于一段介
于两段反向重复微卫星间的DNA序列。与RAPD
相比，ISSR标记迅速简便，重复性好，具有更高的多
态性[5邝]。近年来，ISSR在动、植物亲缘关系及多样
性研究、建立DNA指纹库、遗传图谱、基因定位、辅
助育种等方面应用广泛，已在大车前[7]、何首乌[8]、
钓钟柳属[9]以及柑橘属Do]等种属鉴定研究中取得
较好结果。国内对于ISSR的研究从2000年起步，
应用领域主要是水稻[1卜13]、小麦[1“、大豆Ds]等重要
经济作物。目前，大量的研究正在林业、渔业、果树等
行业展开。
应用ISSR分子标记技术进行石斛种间鉴别，
迄今还未见报道。本研究试图将ISSR标记应用于9
种石斛的种间鉴别，并对其在DNA分子水平上的
差异进行初步的研究。
1材料与方法
1．1 材料：共选用9种石斛(表1)，其中1～8由中
国科学院昆明植物研究所李树云先生提供并鉴定，9
为本实验室云南产铁皮石斛组培苗。收集新鲜幼嫩
的叶片，用硅胶干燥后保存在一20。C冰箱中。
表1石斛种类
Table1 SpeciesofDendrobiumSw．
1．2基因组DNA的提取：DNA提取参考Doyle等
方法[1引，并作适当改进。取0．2g硅胶干燥的叶片(新
鲜叶片也可)，用研钵研磨至细粉状。将研磨好的粉末
迅速转移到10mL离心管，加入4mL预热(65℃)
的抽提缓冲液(100mmol／LTris—HCl、pH8．0、20
mmol／LEDTA、4％CTAB、2％PVP、1．4mmol／I。
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月·425·
NaCl)，并加入40肛L13一巯基乙醇，混匀后于65。C水
浴90min。水浴后冷却至室温，加入等体积(4mL)
酚一氯仿一异戊醇(25：24：1)，轻微颠转50次，置于
碎冰上沉淀约30min。然后于4℃、15000×g离心
10min，收集上清液(如上清液浑浊，可重复用酚一氯
仿一异戊醇抽提1次)。转移上清液至离心管中，加入
0．5倍体积5mol／LNaCl，再加2倍体积无水乙醇，
轻微振荡后，可见白色沉淀。4℃、12000×g离心15
min，收集沉淀，用70％乙醇洗涤2次，室温下干燥。
用含有1弘L10mg／mLRNase(DNase—free)的100
弘L0．1×TE溶解沉淀，37℃温育30min。然后用等
量酚一氯仿一异戊醇抽提，方法同上，最后溶解在1mL
0．1×TE缓冲液中。
1．3 ISSR—PCR反应体系及凝胶电泳：ISSR引物
序列参考加拿大哥伦比亚大学生物技术实验室
(UBCBL)的#9引物系列，由上海生工生物技术有
限公司合成。引物序列见表2。
表2所用的ISSR引物序列及每一条引物扩增片段大小
Table2 UsedISSRprimersequencesandsizeoffragments
resultingfromeachprimer
反应体系：总体积25肛L，含有约20ng基因组
DNA，1．0ttmol／L引物，1×反应缓冲液，2．0
mmol／LMgCl2，0．2mmol／LdNTP，1UTaq酶，
用SDW(灭菌的双蒸水)补充体积至25肛L，反应前
每管添加约15肚L液体石蜡，以防蒸发。另用SDW
代替模板DNA作阴性对照。
PCR扩增程序：PCR反应在MJPTC一100扩增
仪上进行，反应参数为：94℃预变性7min；94℃
30S、52℃45S、72℃2min、45个循环；72℃7
min补平，反应产物在4℃下保存。
电泳以0．5×TBE缓冲液(45mmol／LTris一硼
酸，lmmol／LEDTA)配制1．5％琼脂糖凝胶，将凝
胶放置在含有0．5×TBE缓冲液的电泳槽(Bio—Rad
Sub—CellGTsystem)中，缓冲液没过凝胶表面约2
mm。PCR产物上样量8肛L，以上海生工Gene
RulerlM100bpDNALadderPlus标记片段大小，
电压60V，电泳时间约为4h。结果由凝胶成像系统
(Dolphin—DOC)拍照记录。
2结果与分析
2．1 基因组DNA浓度与纯度：提取的基因组
DNA经紫外分析检测，A：。0／2。。比值均介于1．7与
2．0，质量浓度在15～70ng／肛L。基因组DNA在
l％琼脂糖凝胶上进行电泳分析，以入基因组为对
照，基因组无降解，片段大小约为50kb。
2．2扩增产物多态性分析：引物UBC一803、UBC一
814、UBC一870无扩增条带，其余7条引物均产生可
重复的多态性扩增模式(表2)。在能产生条带的引
物中，产生多态性条带的数目由7到14条不等，而
片段的大小220～1260bp不等。图l是引物UBC一
864对9种石斛扩增结果的电泳图。
对照一以SDW代替DNA模板作为阴性对照1～9见表1
control—SDWsubstitutesDNAtemplateasn gativecontrol
1--9areshowninTable1
图1引物UBC一864扩增被测9种石斛的
琼脂糖凝胶电泳图
Fig．1Sepharoseelectrophorogramofexaminedine
speciesofDendrobiumSw．withPrimerUBC-
864amplification
应用于检测的10条引物中，UBC一807和UBC一
864均可以独立区分9个不同种质的石斛。从图1
可知，UBC一864对于不同种质石斛扩增模式有很大
差异，从而可以将所有被试样品轻易地区分开来。另
外，在700bp左右均有清晰明显的条带，但条带位
置略有差异，这可能是石斛属进化中比较保守的区
域，对其深入分析可能会揭示更多关于系统进化上
的证据。在本研究中，选择UBC一864扩增的部分多
态性条带绘制种间区分图(图2)，可以快速鉴别9
种石斛。每1个分支代表1条多态性条带标记，分支
万方数据
·426· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月
线以上代表该物种具有此条带，分支线以下则表示
缺少这一条带。
细叶石斛
美花石斛
束花石斛
攻瑰石斛
铁皮石斛
罗河石斛
球花石斛
鼓槌石斛
叠鞘石斛
图2根据引物UBC一864构建的石斛种间区分图
Fig．2Identificationp ternfexaminedsp cies
ofDendrobiumSw．withPrimerUBC一864
3讨论
石斛类植物由于多糖含量高，一般提取过程很
难去除干净，可能影响PCR扩增。本研究采用高浓
度的CTAB在高盐(1．4mol／LNaCl)与核酸形成
稳定的复合物，在酚氯仿抽提蛋白质及多糖后的水
相中，仍然用高浓度的盐(约1．7mol／LNaCl)去多
糖，收到较好效果。这一方法在目前的石斛类DNA
提取的相关报道中未见报道。 ，
ISSR—PCR实验体系的稳定是至关重要的。模
板浓度、引物浓度、M92+浓度、退火温度、pH值等诸
多因素均会影响实验结果。其中，退火温度影响较
大，较低的退火温度将导致适当的错配，从而扩大引
物在基因组上配对的随机性，而较高的温度虽然可
以提高引物与模板结合的专一性，却会降低引物与
模板结合的程度。本研究中，确定以52℃作为所有
lo条引物的退火温度。同时，在数据统计分析时选
取明显、清晰并且在多次实验中得到重复的条带进
行统计，对于只在少数实验中出现的则不予以统计。
PCR对于M92+浓度的变化也是非常敏感的。在适
宜的M92+浓度(1．5～2．5mmol／L)下，扩增结果一
致。模板、引物浓度对PCR的影响均不大，在适宜的
模板质量(10～100ng)及适宜的引物浓度(o．4～
1．5／-mol／L)下，均具有一致的扩增模式。
本实验首次将ISSR—PCR方法引入石斛种问鉴
别。实验表明，ISSR技术具有方法简便，结果稳定、
可靠等优点。ISSR引物可以直接从已有的引物库中
进行筛选而无需自行设计，方法简便、快速。ISSR具
有很好的重复性，这主要是由于ISSR引物长度一
般在15～22bp(本实验采用的10条引物长度为17
或18bp)，具有较高的退火温度。ISSR标记具有很
高的多态性。本研究选取的10条引物中，有7条引
物产生了多态性条带，其中2条引物均可独立区分
所有被测样品，使得比较种间差异成为可能。
DNA分子标记应用于中药鉴定、栽培等方面有
着很好的发展前景。目前针对石斛种间鉴别的方法
日益增多，例如利用rDNA的ITS序列，因其进化
速率较快，能很好地反应科内、属间及种间的亲缘关
系，被广泛应用于植物系统演化及亲缘关系的研究。
Lau等[171对16种石斛内转录间隔区ITS2DNA测
序的结果表明，ITS2区可作为区分石斛种间、石斛
与外类群的分子标记。丁小余等[183建立了枫斗类石
斛的rDNAITS区碱基全序列数据库，可对枫斗类
石斛待检种进行鉴别。这种方法准确可靠，但其不足
之处是对每一个被测样品都需要进行测序，费用较
高。再如张铭等[1朝曾用RAPD技术对26种石斛进
行聚类分析，并对铁皮石斛特异性条带进行测序，从
而设计出一对长度为20bp的铁皮石斛高度特异性
的引物。RAPD方法快速简便，但其重复性差，铁皮
石斛特异性引物准确可靠，但仅局限于鉴定铁皮石
斛一个种。此外，也有报道指出利用叶绿体的matK
基因序列区分石斛与其混淆品Ezo]，这一方法也需要
进行测序，如能同时结合其他进化中的一些分子证
据，方可作出全面、科学的判断。本实验旨在寻找一
种快速简便的石斛种问鉴别方法，ISSR—PCR方法
与RAPD同样快速而简便，而准确性大大提高，并
且不需要进行测序，尤其适用于多样品之问的鉴别，
极大地降低了成本。但ISSR标记能否应用于石斛
属内亲缘关系的探讨，则需要更深入的研究，需要收
集尽可能多的石斛种类，筛选多态性条带丰富的引
物，并对大量数据进行科学、有效地整理和分析。
通过本实验可以看到，ISSR标记在石斛种间鉴
别中显示出巨大的应用潜能，随着研究的深入，必将
找到更合适的引物，获得更佳的多态性图谱，从而在
种间、种下居群间等水平进行快速鉴别，为药材石斛
的鉴定和石斛GAP种质资源的确立等提供分子水
平的证据。
致谢：中国科学院昆明植物研究所李树云先生
提供并鉴定部分样本。
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霍山石斛种内遗传稳定性的RAPD初探
刘石泉，余庆波，李小军，周根余+
(i-海师范大学生命与环境科学学院生物系遗传学实验室，上海200234)
摘要：目的研究霍山石斛荚果内遗传稳定性及荚果间的差异大小。方法利用从20个随机引物筛选出来的3
个稳定性较好的10碱基引物对来自5个不同荚果的霍山石斛种群进行RAPD检测。结果5个荚果内遗传相似
系数较大，在92．5926％～100．00％，其中H1、H9、H10、H14存在一定程度的变异，H23是一个较为稳定的群体；5
个荚果问H1、H9、H10、H23的遗传距离较小，H14与其他4个荚果的遗传距离则较大。结论建立霍山石斛稳定
的元性快繁体系是切实可行的，同时说明霍山石斛种内存在一定的变异，H14与其他荚果的差异最大。
关键词：随机扩增多态性DNA；霍山石斛；荚果；遗传稳定性
中图分类号：R282．710．3文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)03—0427—05
Hereditaryst bilityamongspeciesofDendrobiumhuoshanensebyRAPD
LIUShi—quan，YUQing—bo，LIXiao—jun，ZHOUGen—yu
(LaboratoryofGenetics，DepartmentofBiology，CollegeofLifeandEnvironmentSci ce，
ShanghaiNormalUniversity，Shanghai200234，China)
Abstract：ObjectiveTostudythhereditaryst bilityinthepodandthediversityw hinthepodsof
Dendrobiumhuoshanense．MethodsThreeoptimaldecameroligonucleotideprimerswithbetterstability
selectedfrom20randomprimerswereusedtodetectthepopulationsoffivedifferentpodsofD．huosha—
nensebyrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)．ResultsThecoefficientofgenetics milaritywere
higherwithinfivepodsattherangeof92．5926％一100．oO％，thevariationpresentedintheHI，H9，
H10，andH14，butH23wasastablegroup．Therewasasmallerg neticd stancewithinthepodsH1，H9，
收稿日期：2004—05—22
基金项目：上海市高等学校科学技术发展基金资助项目(03DZ02)
作者简介：刘石泉(1969一)，男，湖南益阳人，讲师，在读研究生，研究方向为药用组织培养及分子检测。E—mail：lsq205@sina．com
*通讯作者Tel：(021)64323698E—mail：zhougenyu@sina．com
万方数据
ISSR-PCR在石斛种间鉴别中的应用
作者： 沈颖， 徐程， 万小凤， 张铭， SHEN Ying， XU Cheng， WAN Xiao-feng， ZHANG Ming
作者单位： 浙江大学生命科学学院,浙江,杭州,310012
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(3)
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本文读者也读过(10条)
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引证文献(42条)
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16.雷栗.王益.赵阿曼.朱培林.周世良 栀子道地药材遗传关系的ISSR证据[期刊论文]-中草药 2009(1)
17.莫雪梅 分子生物学在中药研究中的应用现状探讨[期刊论文]-现代食品与药品杂志 2006(2)
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19.吴志刚.冷春鸿.陶正明.魏余煌.姜程曦 参薯种质遗传多样性的ISSR分析[期刊论文]-中国中药杂志 2009(23)
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25.申彦晶.谭雪梅.赵翾.赵树进 白木香的遗传差异及ISSR分子鉴定[期刊论文]-解放军药学学报 2008(1)
26.贺安娜.欧立军.王玉娇.佘朝文 虎耳草ISSR反应体系的建立及优化[期刊论文]-怀化学院学报 2012(11)
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28.吴振兴.王慧中.施农农.赵艳 兰属Cymbidium植物ISSR遗传多样性分析[期刊论文]-遗传 2008(5)
29.周洁.王忠华 DNA分子标记技术在药用植物上的应用[期刊论文]-科技创新导报 2011(4)
30.冯尚国.胡旭.赵红燕.王慧中 DNA分子标记在铁皮石斛研究中的应用[期刊论文]-中草药 2010(3)
31.周喜军.张冬梅.罗玉兰.苏金乐.李建祥 冬青属植物的ISSR标记分析及其应用[期刊论文]-河南农业大学学报
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32.郭艳丽.鞠爱霞 DNA分子标记技术在中药鉴定学中的应用[期刊论文]-黑龙江医药 2012(4)
33.王慧中.卢江杰.施农农.赵艳.应奇才 13种石斛属植物遗传多样性的AFLP分析[期刊论文]-分子细胞生物学报
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34.张晓峰.刘福艳 DNA指纹图谱技术在中药研究中的应用进展[期刊论文]-齐鲁药事 2012(12)
35.刘静.何涛.淳泽 分子标记技术在石斛属植物中的应用研究进展[期刊论文]-应用与环境生物学报 2008(6)
36.蹇黎 ISSR和SRAP标记技术在兰花植物种质资源研究中的应用[期刊论文]-北方园艺 2011(23)
37.周佐斌.葛刚 中药材道地性的DNA分子鉴定[期刊论文]-江西科学 2008(3)
38.吴志祥.聂京涛.曹娴.何欢乐.蔡润.潘俊松 利用ISSR对矮牵牛品种遗传多样性的聚类分析[期刊论文]-上海交通
大学学报（农业科学版） 2012(3)
39.王际振.刘亚琼.杨兵.王献 ISSR分子标记及其在园林植物遗传育种中的应用[期刊论文]-山东农业科学 2008(8)
40.张奇.段承俐 铁皮石斛的鉴定研究[期刊论文]-生物技术通报 2008(6)
41.斯金平.何伯伟.俞巧仙 铁皮石斛良种选育进展与对策[期刊论文]-中国中药杂志 2013(4)
42.赵杨 二色胡枝子遗传多样性及胡枝子属种间亲缘关系研究[学位论文]博士 2006

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