全 文 ：·568· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月
表2不同稀释度含药血清对USMC内[Ca2+]-
增加的影响(；±s，聆一8)
Table2 Effectsofdrug--containingserumatdifferentdi--
lution[Ca2+]iincreaseinUSMC(；±s，聆一8)
曲线下面积／cm2组别——
5％血清lo％血清 15％血清 20％血清
对照 10．78±0．2810．42士0．3810．63±0．3910．43土0．41
RJTE 6．66±0．30。4．51土0．32’’4．59±0．22。。4．31土0．26’+
与对照组比较：+P
响[3]。因而本实验应用中药血清药理学研究方法[4]，
它可在某种程度上克服中药本身理化性质等因素对
实验结果的干扰，不仅反映药物中可吸收部分的直
接作用，也可反映药物在机体作用下形成的代谢物
和药物诱生的机体内源性物质的间接结果，真实地
反映药物在体内的实际作用[5]。本实验含药血清的
制备过程中，选用家兔来制备含药血清从而保证物
种与人类生物学特性的相近似，并同时兼顾与体外
培养细胞一致。在目前众多的给药方案中，本实验采
用了“通法”[3]，它是研究者在对大量的中药药动学
参数进行分析后提出的一种通行方案，即每天给药
2次，连续3d，末次给药后1h采血，同时本实验也
通过对少量动物进行预实验，将不同时间的含药血
清进行比较后，对“通法”进行适当的调整，确定末次
给药后1、2、3h作为采血时间，这样所取血清才能
较真实完整地反映药物的作用。在给药剂量上，采用
公式：给药剂量一在体试验的给药剂量×反应系统
中被稀释的倍数，并进行适当调整选择了高、中、低
3个剂量组。而对于血清的处理和使用，为减少血清
的非药理性干扰和降低微生物感染机率，以符合常
规的细胞培养要求[6]，将血清进行了灭活处理。另
外，为防止含药血清在保存过程中其中药有效成分
发生变化[5]，实验中均使用新灭活及保存时间较短
的含药血清。并严格设立空白血清对照组，以排除空
白血清本身活性对实验结果的影响。实验结果显示，
RJTE的3个剂量组均能降低由缩宫素诱发的
USMC内[Ca2+]。的升高。高剂量组药物血清以
5％、10％、15％、20％稀释度温育细胞后，其作用有
随稀释度增加而增加的趋势。而空白血清对细胞内
的[Ca抖]i无明显影响。高剂量组1、2、3h3个时相
采集的血清均能明显抑制细胞内[Ca2+]。，其中1h
含药血清作用较强。实验结果与离体和在体平滑肌
标本实验结果基本相符。
References：
r1]CaiYQ．TherelaxingeffectsofRanunculusjaponicus
左旋紫草素抗副流感病毒作用
罗学娅，李明辉。，伦永志，吕 莉。，藤美君，罗原丽+，张 宁～
(大连大学医学院辽宁省教育厅生物有机化学重点实验室，辽宁大连 116622)
紫草为多年生草本植物，药用部分为紫草
LithospermumerythrorhizonSieb．etZucc．的干燥
根，为我国传统的中药之一。紫草作为一种具有抗
菌、消炎止痛、抗病毒、抗癌、免疫调节、抗生育、止血
等多方面药理作用的中药，在临床上广泛应用。紫草
对单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒Ⅲ、人类乳头瘤病
毒E2|、带状疱疹病毒[33及甲型肝炎病毒叫等均有抗
病毒作用。左旋紫草素(z—shikonin)系从紫草中提
收稿日期：2004—07—07
作者简介：罗学娅(1960一)，女，重庆市人，医学硕士，药理学教授，现任大连大学医学院药理学教研室主任，主要研究方向为天然药物的
研制与开发，曾获“2001年度大连市科学论文奖”一等奖，发表学术论文29篇。
Tel：(0411)87402364(0)E—mail：xxyluo@sina．corn
* 大连大学医学院1999级临床医学专业学生**沈阳药科大学2002级硕士研究生
～一～一
一一一
一一一
一一一～一一一一一一一一一一一一一一一一一～一一～一一一
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月·569·
取的有效成分。据初步研究显示其具有显著的抗疱
疹病毒一I型的作用，本研究旨在进一步观察其抗副
流感病毒的作用，为研发新型、高效低毒的抗病毒药
物提供实验依据。
1材料
1．1 药物：紫草二氧化碳超临界萃取液，含左旋紫
草素34．98mg／mL，由内蒙古包头医学院药理学教
研室提供。实验前用崔字牌香油(一级品，杂质<
0．1％，山东潍坊瑞福油脂调料有限公司生产)将其
稀释成不同质量浓度的药液使用。
1．2病毒株：副流感病毒为大连大学医学院微生物
学教研室冻存。
1．3细胞：原代鸡胚细胞由本实验室自行制备口]。
原代鸡胚选取9～10日龄发育正常的来亨鸡胚，购
自大连市金州区得胜养鸡厂。
1．4 10％O型人红细胞母液：本实验室自行制备。
选择21岁男性健康O型血的人红细胞供血者，抽
取其静脉血3mL，迅速打入已制备好的抗凝管中，
加入3mL生理盐水，摇匀，3000r／rain离心15
min，弃去血浆(上清液)，加入5～10倍量生理盐
水，3000r／min离心15min。如此反复清洗红细胞
3次，洗涤后的红细胞按体积用生理盐水配成10％
母液，4℃保存(不超过1周)，临用前用生理盐水
稀释成0．5％红细胞悬液。
1．5 仪器：CKOLYMPUS倒置显微镜(日本)；
HH．B11型电热恒温培养箱(3c海跃进医疗器械公
司)；96孔细胞培养板(Costar产品)。
2方法与结果
2．1病毒效价测定：将冻存副流感病毒适当稀释后
接种在9～10d龄鸡胚尿囊腔，置35℃孵育，72h
后放入4℃冰箱过夜，取出鸡胚收获尿囊液，采用
血细胞凝集实验卟1对其进行血凝滴定，测得其血凝
效价为1：640。同时将尿囊液在鸡胚细胞滴定组织
培养半数感染量(TCID。。)Is．7]，即将此副流感病毒
尿囊液进行10倍稀释成1×10-1～1×10-6不同稀
释度，将各稀释度的病毒感染鸡胚细胞单层，37℃
吸附1h后，弃病毒液，换维持液，每个稀释度重复
3孔，设正常细胞对照，37℃培养，逐日在倒置显微
镜下观察细胞病变，连续观察3d，记录各孔病变情
况，采用ReedandMuench法计算TCID50，求得其
TCID5。为1×104。
2．2药物毒性测定：用香油将34．98mg／mL左旋
紫草素药液倍比稀释成5个质量浓度，分别加入含
已长成单层鸡胚细胞的96孔培养板中，每孔50
tLL，每孔加入细胞维持液50肛L，轻轻吹打均匀，使
各孑L药液终质量浓度分别为17．49、8．75、4．37、
2．19、1．10mg／mL。每个质量浓度重复3孔，各设3
个香油溶剂对照孔及正常细胞对照孑L，置37℃培
养。逐日在倒置显微镜下观察细胞形态。细胞无病
变为一；细胞病变在25％以下为+，25％～50％
为++，50％～75％为+++，>75％为++++。
连续观察3d，结果见表1。
表1左旋紫草素对鸡胚细胞的毒性
Table1 Toxicityofl-shikonint chickenembryocell
结果显示，左旋紫草素在本实验的质量浓度范
围内对鸡胚细胞无毒性作用，故在抗病毒实验中可
排除药物本身毒性对细胞的影响。香油对细胞生长
也无抑制作用。
2．3药物抗病毒实验
2．3．1平皿内直接杀灭副流感病毒实验：将直径2
cm的无菌滤纸片分别置于直径为9cm的平皿底
部，分别取6．0、3．0、1．5、0．75、0．375mg／mL左旋
紫草素药液各200p．L，浸涂于上述无菌滤纸片上，同
时设香油溶剂对照组及空白对照组(以生理盐水浸
涂无菌滤纸片)。上述各滤纸片周围加少许生理盐水，
以维持平皿内部的湿度。另吸取病毒液200pL滴加
在每个平皿盖上，并均匀摊开，盖好皿盖，密封。放置
于电热恒温培养箱内，温度保持于33℃，接触60
min，然后取下皿盖，分别用l800I*L的生理盐水洗
下病毒液，此病毒液的稀释度为1：10。将洗下的病
毒液依据血细胞凝集实验中病毒液稀释的方法分别
稀释成1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：
640的稀释液，然后利用血细胞凝集实验对病毒液进
行效价测定。每管设3个重复管。结果见表2。
结果可见，当药物质量浓度由6．0～0．75rag／
mL依次递减时，病毒效价依次为1：40、1：80、
1：80、1：160。表明左旋紫草素对副流感病毒具有
明显的直接杀灭作用，且呈现良好的量效关系。而
0．375mg／mL药物和香油则对副流感病毒无杀灭
作用。
万方数据
·570· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月
表2左旋紫草素对副流感病毒的直接杀灭作用
Table2 Directvirucidaleffectofl-shikoninonparainfluenzavirus
组别
质量浓度 病毒稀释度
／(mg·mL一1)1：10 1：20 1：40 1：80 1；160 1：320 1：640 NS
2．3．2药物对副流感病毒的抑制作用：采用细胞病
变(CPE)法[5]。将鸡胚细胞2．5×108／L接种到96
孔培养板中，每孑L100弘L，37℃培养，次日弃去培
养液，分别加入100TCID。。副流感病毒液100弘L，
37℃吸附1h后，弃病毒液。每孔分别加入左旋紫
草素药液50弘L及维持液50pL，轻轻吹打均匀，使
各孔的药液终质量浓度分别为6．0、3．0、1．5、0．75、
0．375mg／mL。每个质量浓度重复3孔，同时设正
常细胞对照组、病毒对照组及香油溶剂对照组。
37℃培养，逐日在倒置显微镜下观察细胞病变进
展情况。当病毒对照组细胞病变出现++++，而细
胞对照组为一时，即可终止实验。细胞发生病变
为+++(≥50％细胞产生病变)，可判断药液对
病毒无抑制作用。结果见表3。
表3左旋紫草素对副流感病毒的抑制作用
Table3 Inhibitoryeffectofl-shilkonin
onparainfluenzavirus
左旋紫草素在6．o～0．75mg／mL可抑制副流
感病毒对鸡胚细胞的致病变作用，且呈剂量依赖性。
而0．375mg／mL药物和香油则不能抑制副流感病
毒的致细胞病变作用。这与药物在平皿内直接杀灭副
流感病毒实验的结果相吻合。以上结果提示左旋紫草
素具有一定的体外抗副流感病毒作用。
3讨论
本实验采用的病毒液是用鸡胚培养法中的尿囊
腔接种法获得的。鸡胚培养法是常用的病毒培养法
之一，操作简单，鸡胚来源容易，且鸡胚本身带病毒
的情况也极为少见。培养方法主要有4种途径接种
不同的部位，即绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔及卵黄
腔，其中以尿囊腔接种法最为简单易行，且病毒液收
获容易，病毒效价高，因此，本实验采用此方法培养
副流感病毒。
本实验所采用的血细胞凝集反应测定病毒效价
是基于副流感病毒能够释放出血细胞凝集素，该物
质能够使豚鼠及人O型血红细胞发生凝集，通过细
胞凝集的情况判断病毒的效价。实验所用红细胞悬
液必须新鲜，因为陈旧的红细胞将出现非特异性的
凝集，影响实验结果。
目前在国内外绝大多数的医学病毒还没有有效
的治疗药物，而作为抗病毒药物所必须具备的最重
要的条件就是只对细胞内的病毒有抑制作用，而对
细胞的正常生命代谢无影响。由于当前使用的抗病
毒药物均不能满足这一要求，开发研制新型抗病毒
药物就成为国内外研究的热点问题之一。
紫草为中医治疗中的常用药物，关于其药理作
用及临床应用的报道有很多，但关于紫草有效活性
提取物抗病毒作用的研究报道所见甚少。本实验采
用血细胞凝集反应及细胞病变法来研究紫草提取物
中左旋紫草素的抗副流感病毒作用，实验结果显示
其在实验所用的质量浓度范围内毒性较低，且具有
一定的体外抗副流感病毒活性及直接杀灭副流感病
毒的作用。这一研究结果为紫草素的抗病毒作用又
增添了新的内容，也为其在临床上的进一步广泛应
用提供了有价值的实验依据。然而，左旋紫草素的抗
副流感病毒作用机制，以及其在体内的抗副流感病
毒效果，均有待于更深入的研究与探索。
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合成冰片和天然冰片的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
胡利民1，屈彩芹1，李怡岚2，刘洋1，孙玉敏1，张伯礼1
(1．天津中医学院中医药研究中心，天津300193；2．天津市卫生防病中心，天津300011)
冰片为临床常用的内服或外用中药，来源有天
然与合成之分，含右旋龙脑(d—borne01)的天然冰
片，传统认为是冰片中的正品。合成冰片是经化学方
法合成而得，除含有龙脑外，还含有大量异龙脑(龙
脑的差向异构体)，目前大多中成药均使用合成冰
片。近年，在湖南等地发现从樟属植物中可提取纯度
95％以上的右旋龙脑，增添了一种新的天然冰片药
物资源[1]，临床和制药选择时，需对其安全性进行较
系统的研究。本实验对该来源冰片和现用合成冰片
的毒性进行了较系统的对比研究，对两种冰片进行
了小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验。
1材料
1．1药品：天然冰片和合成冰片，均为白色结晶体，
脂溶性，不溶于水。GC检测，天然冰片含右旋龙脑
95．2％左右，合成冰片含右旋龙脑60．2％，异龙脑
36．7％。均由天津天士力制药集团有限公司提供。
1．2动物：ICR小鼠(SPF级)，体重18～22g，雌
雄各半。北京维通利华实验动物技术有限公司提供，
动物合格证号SCXKl1-00—0008。
1．3试剂：羧甲基纤维素钠(CMC)，上海化学试剂
站分装(批号960823)；环磷酰胺(CTX)，上海华联
制药有限公司(批号011211)。
2方法与结果
2．1两种冰片LD。。值测定：两种冰片粉碎，过120
目筛，1％CMC蒸馏水溶液配成混悬液；采用同种
来源和种属小鼠120只，给药前禁食16h，自由饮
水。按体重随机分组，每组10只，雌雄各半。各组ig
给药1次，连续观察14d，记录每日动物死亡情况，
用孙瑞元等编制的《NDST新药统计程序》软件，
Bliss法计算LD。。。结果合成冰片ig给药LD。。为
4．881g／kg，天然冰片ig给药LDso为4．656g／kg。
2．2取材时间点的确定：取体重18～22g雄性
ICR小鼠，分别按2．44、2．33g／kg等容积(0．4
mL／10g)ig给予合成冰片、天然冰片，在给药后6、
12、24、48、72h5个时间点分别处死3只动物，取胸
骨，直接法制备骨髓涂片，Giemsa染色，显微镜油镜
下计数1000个嗜多染红细胞(PCE)的微核发生
率。结果显示给药后5个时间点间小鼠PCE微核
率无明显差异。因此正式试验选择给药后24h作为
制备骨髓标本时间点。
2．3 正式试验：两种冰片最高剂量均取1／2LD。。
剂量，以1／4LD。。、1／8LD。。作为中、低剂量。将ICR
小鼠按体重随机分成8组，每组10只，雌雄各半。
其中6组分别为合成冰片0．601、1．2203、
2．4405g／kg组；天然冰片0．582、1．164、2．328g／
妇组，均ig给药；溶剂对照组(CMC组)ig给予
l％CMC(0．4mL／10g)；阳性对照组(CTV组)
按60mg／kg剂量，生理盐水稀释后ip环磷酰胺。
采用一次染毒法，各组给药后24h同2．2项方法制
备胸骨骨髓涂片，Giemsa染色，显微镜油镜下计数
PCE微核率及计数200个PCE时与正常红细胞
(NCE)的比例。数据处理：采用Poisson分布的U
检验进行统计处理：结果见表1。各组PCE／NCE在
正常值范围，表明两药各剂量均无明显骨髓抑制作
用。合成冰片与天然冰片各剂量组微核发生频率雌
鼠与雄鼠比较差异不显著(P>0．05)；合成冰片与
天然冰片各剂量组微核率与CMC组比较差异不显
著(P>0．05)，且均显著低于CTX组(P<0．01)。
收稿日期：2004—08—07
基金项目：国家重点基础研究发展规划“973”项目(1999054403)；天津市自然科学基金资助项目(013613711)
作者简介：胡利民(1966)，男，内蒙古呼和浩特市人，副研究员，博士，硕士生导师，主要从事中药药理及毒理研究，发表论文20余篇。
Tel：(022)23051076E—mail：tonghon@eyou．com
万方数据
左旋紫草素抗副流感病毒作用
作者： 罗学娅， 李明辉， 伦永志， 吕莉， 藤美君， 罗原丽， 张宁
作者单位： 大连大学医学院辽宁省教育厅生物有机化学重点实验室,辽宁,大连,116622
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(4)
被引用次数： 14次
参考文献(7条)
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