全 文 ：中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月·1697·
50、100、200／19／mI。组均表现出明显的刺激作用
(．P3讨论
制首乌具有补肝肾、益精血的作用。据《本草纲
目》记载，该药有“养血益肝，固精益肾，健筋骨，乌髭
发，为滋补良药。不寒不燥，功在地黄、天门冬诸药之
上”。周志文等发现，何首乌提取物(水煎醇沉粗提
物)能增加CFU—S、BFU—E、CFU—E和CFU—GM
集落产率[2]。表明何首乌有促进造血作用，但是对于
巨核系祖细胞的影响及对骨髓抑制贫血小鼠造血恢
复的作用却未见报道。
本研究结果显示，PPS体内用药后能明显增加
骨髓抑制贫血小鼠BMC数，促进骨髓抑制贫血小
鼠红系、巨核系、粒系造血祖细胞的增殖；体外用药
后对红系和粒系祖细胞的增殖均无明显的直接刺激
作用，但对巨核系祖细胞的增殖仍表现出刺激作用。
提示PPS的对红系和粒系祖细胞的增殖似乎是一
种间接作用，而对巨核系则表现出直接／间接的刺激
作用。目前还不能解释PPS对巨核系祖细胞增殖的
直接刺激作用机制，其间接作用可能与刺激造血生
长因子分泌，促进生长因子受体、转录因子、抗凋亡
蛋白等的表达有关，有待进一步的研究。
References：
[1]ShangP，YangTH，JiaM，eta1．Purificationandanalysis
ofpolysaccharidesofAng licasinensisi(Oliv．)Diels[J]．，
FourthMilMedUniv(第四军医大学学报)，2001，22(14)：
131卜1314．
Ez]ZhouzW，ZhouJH，XingST．EffectsofPolygonum
multiflorumextractonmurinehematopoieticfunctions[J]．
PharmacolClinChinMaterMed(中药药理与临床)，1991，
7(5)119—21．
[3]Liuxz．ExperimentalHa dbookfTechnologiesnCell
CultureofHematopoieticProgenitors(造血祖细胞培养技术
实验手册)[M]．Beijing：BeijingPubl shingHouse，1993．
脑舒宁胶囊对培养皮层神经细胞自由基损伤的保护作用及其机制研究
彭 伟
(山东中医药大学附属医院，山东济南250011)
缺血性中风是临床常见的疑难病，其发病率、病
残率居高不下，对人类健康危害极大，因此，对脑缺
血神经元损伤机制进行研究并寻找有效的药物进行
治疗具有重要意义。本实验采用血清药理学方法，通
过离体神经细胞培养，制备自由基损伤模型，以神经
细胞存活率，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶
(SOD)水平测定和细胞凋亡率检测探讨脑舒宁胶
囊对神经细胞损伤的保护作用及其机制。为临床防
治提供实验依据。
1材料与方法
1．1 主要试剂：MTT购自美国Sigma公司，
DMSO购自北京化学试剂三厂，MDA、SOD测试盒
购自南京建成生物工程研究所，原位凋亡检测试剂
盒购自北京医科大学病理系。
1．2神经细胞培养：无菌条件下分离新生大鼠(出
生o～1d)大脑皮层，置于预冷的D—Hank
7
S液中，
仔细剔除软脑膜及血管，0．25％胰酶37℃消化30
min，终止消化，1000r／min离心10min，沉淀用接
种液悬浮，机械吹打制成单细胞悬液，调细胞计数约
为1×106／mL，接种到经0．1％多聚赖氨酸过夜处
理的12孔培养板和培养瓶中。置37。C、5％CO。孵
箱中培养。24h后全量换液1次以去除死细胞，以
后每3天换液1次，第5天加阿糖胞苷以抑制非神
经细胞的增殖。接种液成分：85％DMEM／Fml5％
小牛血清、100U／mL青霉素，100U／mL链霉素。
维持液为含10％小牛血清的DMEM／F，。培养液。
l。3神经细胞自由基损伤模型的建立
1．3．10。7损伤模型：生物体内自由基生成途径之
一是酶促催化产生自由基，黄嘌呤氧化酶催化产生
自由基通常称为X(黄嘌呤)／X0(黄嘌呤氧化酶)
模式。参照文献方法[1]，采用X／X0体系，将培养细
胞用D—Hank7S液洗2次，加入含有0．08U／mL黄
瞟呤氧化酶和1mmol／L黄嘌呤的无血清培养液作
用1h，然后吸除培养液，加入无血清的DMEM培
养液，37℃、5％CO。孵箱中继续培养。
1．3．2H：O。损伤模型：取培养8d的神经细胞，吸
除原培养液，D—Hank
7
S液洗2次，加入终浓度为
100p．mol／LH。0。作用1h，换以无血清的DMEM
收稿日期：2006—02—21
作者简介：彭伟(1970一)，女，山东济南人，副主任医师，副教授，硕士，主要研究方向为中西医结合治疗神经内科系统疾病。
Tel；(0531)82613190E—mail：pengwei0625@163．eom
万方数据
·1698· 中草焉 ChineseTiaditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月
继续培养。
1．4实验药物及含药血清的制备：脑舒宁胶囊(相
当于生药1．52g／g)由川芎、三七、胆南星、陈皮、人
参、制首乌、葛根、冰片等药物组成，由山东中医药大
学附属医院制剂室制备。Wistar雄性大鼠，由山东
大学动物实验中心提供。大鼠禁食12h后，ig给药。
脑舒宁胶囊分为3个剂量组，分别相当于成人等效
剂量的20倍(13．3g／kg)、10倍(6．6g／kg)、5倍
(3．3g／kg)。采用两次给药法，即于首次给药后2h，
重复给药1次，剂量相同，第2次给药后1h，1．2％
戊巴比妥钠麻醉大鼠，无菌条件下心脏取血，分离血
清，2000r／rain离心20rain，取上清液即为含药血
清。56℃灭活40rain，一20℃冻存，用前4‘C融
化，按照含药血清体积分数10％分别于损伤前24
h及损伤后加入培养液中，空白血清按相同剂量给
大鼠ig蒸馏水，相同方法分离制备血清。
1．5培养细胞分组：培养细胞分为正常对照组、模
型组、空白血清组、脑舒宁胶囊含药血清高、中、低3
个剂量组。
1．6神经细胞存活率测定：6组培养细胞，每组4
孔。每孔随机选定5个视野，以倒置相差显微镜
(10×40)分别计数每个视野实验前后的存活细胞
数，计算实验后的细胞存活率，取其平均值为该孔的
细胞存活率，取4孔的平均值为该组的细胞存活
率，统计各组之间的差异。存活细胞标准为细胞形态
及突起完整，胞体呈暗相，周围光晕完整清晰。
1．7 MDA、SOD检测：培养细胞损伤后继续培养
24h，去除原培养液，D—Hank7S液洗2次，加入0。1
mol／LPBS一0．05mmol／LEDTA(pH8．O)及1％
TritonX—100溶解细胞，加入25％H3PO。沉淀蛋
白，6000r／min离心30rain，取上清液，按试剂盒
说明，分别采用硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法测
定‘21。
1．8细胞凋亡检测：按原位细胞凋亡检测试剂盒程
序进行。培养的神经细胞分别于自由基损伤模型建
立后，4％多聚甲醛固定20rain，0．1mol／LHCl室
温处理10rain，加蛋白酶K，37℃作用20rain，加
TUNEL反应混合液37℃，封闭液作用1h， 碱
性磷酸酶标记的Anti—Dig—AP37℃孵育1h，
NBT—BCIP暗处显色30min，核固红复染，封片。阴
性对照反应液中不加TdT酶。每组取2张盖片，
10×40倍光镜下随机计数lo个视野内的凋亡细胞
数，取其平均值。
1。9统计方法：计量资料以z士S表示，应用统计软
件SPSS12．0进行单因素变量的方差分析。
2结果
2．1光镜观察：培龄9d的正常对照组的神经细胞
晕光明显，胞体饱满，多聚集成团，细胞团之间可见
粗大的突起并互相连接，网络稠密。暴露于0。’继续
培养24h后，O。7模型组神经细胞损伤明显，漂浮
细胞明显增多，神经细胞数目减少，大多数细胞失去
突起，网络消失，胞体光晕消失，仅有少数神经细胞
存活，突起萎缩，仅存胞体。H。O。模型组神经细胞损
伤程度与O。7模型组大致相同。脑舒宁胶囊各剂量
组以高剂量组损伤最轻微，仅少数细胞突起消失，神
经细胞数目无明显减少，绝大部分神经细胞突起仍
互相连接，网络稠密；中剂量组神经细胞数目减少，
网络仍存在，少数细胞突起萎缩；低剂量组漂浮细胞
数目增多，神经细胞数目减少，网络稀疏，多数细胞
突起消失，有些仅留胞体。空白血清组与模型组情形
大致相同。
2．2 神经细胞存活率：经O。’、H。o。损伤继续培养
24h后，模型组的神经细胞存活率明显下降，与正
常对照组比较差异显著(P剂量均能不同程度地提高神经细胞的存活率，其中
以中、高剂量作用明显，与模型组比较差异显著
(P<0．05、0．01)；空白血清组与模型组比较，神经
细胞存活率差异无显著性(P>o．05)，结果见表1。
衰1 脑舒宁胶囊对o：’或H：O：损伤的神经细胞
存活率的影响(；土s，矗一4)
Table1 EffectofNaoshuningCapsuleonsurvival
rateofneuronalcel sinjuriedby02’or
H202(i士s，露一4)
组别
剂量／
(g·kg一1)
神经细胞存活率／％
正常对照 一
模型 一
空白血清 一
脑舒宁胶囊含药血清 3．3
6．6
13．3
95．47士9．695．77士8．3
35．28土7．5AA32．00士4．8△△
37．08士6．931。67士5．7
44．05士6．349．20士7．7
71．65士7．2。73．26士6．9+
87．73士8．3。。89．35士8．5。。
与正常对照组比较：△6P<0．01
与模型组比较：。P△△P。P2．3 MDA、SOD检测结果：神经细胞经O。7或
H。O。损伤后，MDA生成增多，SOD活力则显著降
低，与正常对照组比较差异显著(P<0．01)，空白血
清组与模型组相比，差异无统计学意义(P>o．05)。
脑舒宁胶囊中、高剂量能减少MDA的生成，并能明
万方数据
中草芮 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月· 699·
显地提高SOD的活力，与模型组比较，差异显著
(P<0．05、0．01)。而脑舒宁胶囊低剂量虽有使
MDA生成减少、SOD活性提高的趋势，但与模型组
比较，差异无显著性(P>O．05)。结果见表2。
表2脑舒宁胶囊对027或H：O：损伤的神经细胞的MDA和SOD的影响(；士s，n一4)
Table2 EffectofNaoshuningCapsuleonMDAandSODinneuronalcel sinjuriedby02’orH202(j士s，n=4)
剂量／ Oz7 H20z
组男U————
(g·kg一1)MDA／(nmol·mL一1)SOD／(nU·mL一1)MDA／(nmol·mL一1)SOD／(nU·mL一1)
与正常对照组比较：△oP△△P2．4原位凋亡检测结果：阳性结果为细胞核呈蓝紫0．05)。脑舒宁胶囊中、高剂量组于0。’、H。O。损伤
色。阴性对照片无细胞核被标记，说明阳性标记具有 后第1、3天未见凋亡细胞，第5、7天可见数量不等
特异性。培养细胞经O。7、H：O。处理后，继续培养， 的凋亡细胞，较模型组均明显减少，差异具有显著性
第1天，未见凋亡细胞，第3天模型组可见少量散在 意义(P分布的凋亡细胞，凋亡细胞核呈圆形或新月形，深染 胞，第5、7天凋亡细胞逐渐增多，与模型组相比有显
呈蓝紫色，有的核外周深染而中央淡染，随着培养时 著性差异(P<0．05)。结果见表3和4。
间的延长，凋亡细胞数量逐渐增多，至第7天凋亡细 3讨论
胞数达高峰。正常对照组经无血清的DMEM处理 脑缺血再灌流时，可产生大量化学性质非常活
后，第1、3、5天均未见凋亡细胞，第7天可见少量散跃的自由基。由于自由基产生的量很大，超过了机体
在分布的凋亡细胞。空白血清组细胞凋亡时程与模 的清除能力，自由基在活性铁的催化下，起动脂质过
型组相似，两组凋亡细胞数比较无显著差异(P> 氧化。脂质过氧化是引起脑再灌流性损害的重要因
表3 O：7介导的神经细胞损伤后TUNEL检测结果(；士s，一=10)
Table3 TUNELDetectingresultsofneuronalcel sinjuriedby027(；士s，n一10)
剂量／ 细胞凋亡数／(个·视野一)组男Ⅱ——
(g·k91) 第3天 第5天 第7天
正常对照 一 一 一4．0267士1．0036～
模型 一 17．9683士1．2982 27．8657士4．6360 31．6781士6．1877
正常对照
模型
空白血清
脑舒宁胶囊含药血清 3．3
6．6
13．3
18．8726士1．3927
18．0372士2．0513
9．1062士1．8334。
28．8990土4．
27．9235士4．
20．0665土3．
12．6897士1．
10．9673士1．
3602
2678
286’
6656。。
9801。。
4．6273士1．1003。+
33．5756±4．2381
34．0357士4．3286
24．6899士4．650”
19．0667士3．0877。。
14．3668土3．7815’。
与模型组比较：’P‘P■
●
1‘u
7，7●
7
1
8
0虬鸺∞吖
5
4
3
3士±士士l，u，●3
1
1
6
3卵∞踮毖∞弱埔¨
■
1
2
O
1
8
6
7
3凹弛卯鹪
3
3
2
2士±士土
2
7
2
3
6
5
3
2佃踮钉∞孙珀他加
2
4
7
2”蛇
2
1
土土一
一
5
O
1
8盯％
8
8
l
3
6
3
一
m良文l
清吡药岔囊清胶血宁白舒空脑
万方数据
·1700· 中革菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月
素，从而加重了脑再灌流性损害，脑缺血后，ATP减
少，AMP增多，后者分解产生次黄嘌呤，脑组织中
正常存在的次黄嘌呤脱氢酶，在钙的参与下转变为
黄嘌呤氧化酶，该酶在次黄嘌呤和黄嘌呤存在下，使
再灌流期进入脑组织的0。转变为超氧阴离子
(o。7)。这是缺血时产生自由基的主要途径之一[3]。
O。7进一步启动Haber—Weiss反应生成毒性更
强的羟自由基。这些自由基可以攻击细胞膜，并可以
造成许多大分子如核酸、蛋白质损伤，最终导致神经
细胞的损伤。本实验利用黄嘌呤氧化酶一黄嘌呤(x／
XO)反应系统产生O：7。利用O：’及H：O：作为外
源性自由基损伤因素，研究自由基对培养神经细胞
的损伤，并用于筛选有效的抗自由基损伤的药物。本
实验结果表明，神经细胞经O。7和H：O。损伤后，神
经细胞存活率及活性均明显下降，说明外源性自由
基的确造成了神经细胞的损伤。
本研究发现外源性o：7、H。0。作用于神经细
胞，使MDA生成量显著增加，说明生成了大量的脂
质过氧化物，间接地反映出细胞受到自由基的严重
损伤。同时SOD活力则明显下降，说明清除自由基
的能力下降，原位DNA缺口末端标记法检测到阳
性细胞，说明自由基造成的神经细胞死亡包括坏死
和凋亡。
脑舒宁胶囊能提高自由基损伤的神经细胞的存
活率及细胞活性，减少凋亡细胞数量，并能降低
MDA的生成量，提高SOD活力，有效地减轻了
O。7、H。o。对神经细胞的损伤作用。脑舒宁胶囊保护
神经细胞免受自由基损伤的可能机制：(1)直接清除
自由基，起到天然抗氧化剂的作用；(2)提高机体内
抗氧化酶的活性，启动内源性抗自由基系统来清除
过量产生的自由基；(3)增强细胞膜等易受自由基攻
击的目标的耐受性；(4)抑制自由基引起的神经细胞
凋亡。但其具体机制仍有待进一步研究。
References：
E13LiTW，KongLK，XiongW．Protectionofg nsenosides
against02’andH202damagetoculturedratcortialneuronal
cells[J]．JNormanBethuneU ivMedSci(白求恩医科大学
学报)，1998，24(2)：130—133．
Ez]ZhangJJ，CaiZ，LiuXM．ThechangeofLPOandSODon
acuteischemicstrokepatientsandeffectofantioxides[J]．J
ApoplexyNervDis(中风与神经疾病杂志)，1992，9(4)：
213—216．
[3]WangSM，HeCM．Anti—lipidperoxidationandoxygenfree
radicalscavengingactivityofPericarpiumCitriReticulatae
extract[J]．JChinPharmUniv(中国药科大学学报)，
】998．29(6)：462—465．
蛇床子素抑制大鼠骨质疏松的实验研究
汤群芳1，孔令军2，顾振纶1，谢梅林p
(1．苏州大学医学院药理研究室，江苏苏州215123；2．苏州大学医学院儿科系，江苏苏州215123)
蛇床子素(osthole)为从伞形科植物蛇床
Cnidiummonnieri(L．)Cusson果实中提取得到的
香豆素类化合物。具有抗炎、抗心律失常、抗诱变、抗
肿瘤、抗变态反应以及抑制伴刀豆球蛋白A所致小
鼠肝炎等作用[1’2]。近年来有研究报道蛇床子素能够
防治去卵巢致大鼠高转换型骨质疏松，促进成骨细
胞的增殖和成骨作用[3]。本实验以地塞米松诱导大
鼠实验性骨质疏松症为模型，进一步观察蛇床子素
对激素引发骨质疏松大鼠的骨代谢血清学指标、骨
矿化密度(bonemineraldensity，BMD)及骨小梁
结构的影响。
1材料与方法
1．1实验动物：选用3月龄健康SD雌性大鼠，体重
(160±20)g，清洁级。实验动物生产许可证：XCYK
(苏)2002—0008，实验动物使用许可证号：SYXK
(苏)2002—0037，苏州大学实验动物中心供应。
1．2药品与试剂：地塞米松磷酸钠注射液，江苏第
六制药厂生产，批号020802；维生素D。(VitD3)，上
海罗氏制药有限公司惠赠；蛇床子素，质量分数为
95％，西安绿泉生物技术有限公司提供，批号
030516；血清碱性磷酸酶(ALP)、磷(P3+)及钙
(Ca抖)测定试剂盒均购于南京建成生物技术公司，
批号均为20050104；甲状旁腺激素(PTH)和雌二
醇(E。)放免测定试剂盒购子北京中国原子能科学
研究院，批号均为200501；自细胞介素一1(IL一1)、骨
钙素(BGP)和降钙素(CT)放免测定试剂盒购于
收稿日期：2006—03—08
作者简介：汤群芳(1975一)，女，江苏苏州人，在读硕士，研究方向为中药药理。Tel：(0512)65471556
*通讯作者谢梅林Tel：(0512)65880320E—mail：Xiemeilin@Suda．edu．en
万方数据
脑舒宁胶囊对培养皮层神经细胞自由基损伤的保护作用及其
机制研究
作者： 彭伟
作者单位： 山东中医药大学附属医院,山东,济南,250011
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(11)
被引用次数： 1次

参考文献(3条)
1.Li T W;Kong L K;Xiong W Protection of ginsenosides against O2-and H2O2 damage to cultured rat
cortial neuronal cells 1998(02)
2.Zhang J J;Cai Z;Liu X M The change of LPO and SOD on acute ischemic stroke patients and effect of
antioxides 1992(04)
3.Wang S M;He C M Anti-lipid peroxidation and oxygen free radical scavenging activity of Pericarpium
Citri Reticulatae extract 1998(06)

引证文献(1条)
1.李伟.刘德山.常萍.林炜炜 脑神康胶囊对培养大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的保护作用[期刊论文]-中国老年学
杂志 2009(17)


本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200611038.aspx