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狼疮2号对系统性红斑狼疮模型鼠不同组织细胞雌激素受体mRNA表达的影响



全 文 :中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·895·
炎症反应引发的AS形成过程中存在大量细胞因子
的整体变化,提示在巨噬细胞泡沫化过程中,JNK、
p38的磷酸化激活后,通过相应转录因子的磷酸化对
多种炎性相关因子及炎症介质的调节,可能是免疫炎
症反应促进泡沫细胞形成的原因之一。
本实验在检测JNK磷酸化的结果中发现,仅检
测出相对分子质量为54000的JNK2,却没有发现
相对分子质量为46000的JNKl。Ricci等[83在
ApoE一/一小鼠AS模型中也得出类似的结果,提示
在泡沫细胞形成中JNK2比JNKl的作用更为重
要。虽然目前更多的学者关注JNKl的特异性抑制
剂,但是至少在AS等免疫炎症相关性疾病的治疗
中,JNK2的特异性抑制剂更有前途和价值。
本研究观察到,PNS可以剂量依赖性地抑制巨
噬细胞受到炎症刺激后JNK、p38的磷酸化水平,
并能减少泡沫细胞内脂质沉积的增加。该结果提示,
抑制JNK、p38的磷酸化可能是PNS抗泡沫细胞
形成的又一重要机制。本室前期研究发现升高细胞
内cAMP和降低[Ca2+]i水平,是PNS发挥炎症调
节效应的重要机制[4’5]。Xia等[9]观察到cAMP在
PCI2细胞中可抑制p38和JNK活性。
Schwarzschild等口印发现提高细胞外Ca抖水平,可
抑制JNK通路激活。应用钙离子螯合剂降低细胞内
[Ca2+]i水平能够抑制地鼠V79细胞中由H:O:诱
导的JNK激酶的激活,提示PNS可能通过影响
cAMP水平、细胞内外Ca2+平衡等机制作用于
JNK、p38的转导通路中上游分子的某一环节从而
阻断或部分阻断了其磷酸化的作用。但其具体机制
尚需进一步的深入研究。
综上所述,炎症反应是促进AS的一个重要原
因,JNK、p38的磷酸化是其中一个重要环节,PNS
对JNK、p38异常激活的抑制作用进而从整体上调
控多种细胞因子的表达,可能是其有效防治AS的
分子机制之一。
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狼疮2号对系统性红斑狼疮模型鼠不同组织细胞雌激素
受体mRNA表达的影响
张京玲1,陈 宏2,朱元元3,倪春生1,戴胜刚1,樊仪2
(1.南开大学医学院,天津300071;2.天津市长征医院,天津300021;3.南开大学化学院,天津300071)
系统性红斑狼疮(systemiclupuserythema—
tosus,SLE)是人类较常见的一种典型的自身免疫
性疾病。SLE具有一定的遗传基础,属于多基因疾
病。现在认为SLE是由自身免疫紊乱、病毒感染、遗
收稿日期:2006—08—19
基金项目:天津市自然科学基金项目(023613211)
作者简介:张京玲,女,副教授,硕士,毕业于天津医科大学f临床药理专业,主要从事中药新药的药理研究。
Tel:(022)23504374E—mail:zhangjll00@eyou.com
万方数据
·896· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
传、性激素影响、神经因素刺激等多种因素综合作用
引起的。在SLE患者中,育龄期妇女的发病率是男
性的10~20倍。雌激素类口服避孕药能诱发和加
重SLE,雄激素治疗可使病情缓解。SLE这种性别
上的差异提示该病的发生与性激素及其代谢紊乱有
关。近期有报道称,在鼠模型中雌激素的加重病情的
效果是通过改变淋巴器官中雌激素受体(estrogen
receptor,ER)的数量和亲和力来实现的。可见
SLE患者雌激素功能亢进发生在受体水平。因此,
研究ER的改变将有助于阐明雌激素对SLE发病
的作用[1]。狼疮2号以舒肝清热、活血化瘀为主要功
效,临床应用较广,治疗SLE有较好的疗效,但其治
疗作用机制尚不清楚。为了探讨其治疗作用机制及
药物对ERmRNA表达的影响,本实验采用原位杂
交免疫组化技术对狼疮2号治疗组与生理盐水组的
SLE模型鼠不同组织细胞中ERm NA表达进行
了检测,旨在观察ER在患鼠不同组织细胞内的分
布和水平,为探讨狼疮2号治疗SLE的作用机制提
供科学实验依据。
1材料与方法
1.1 动物与分组:SLE模型鼠20只,雌性,体重
18~22g,由美国Jackson公司提供的NZB×NZW
F1小鼠,购自北京大学医学部实验动物研究中心
(美国Jackson公司在华代理商)。
1.2药品与试剂:狼疮2号由陈皮、柴胡、红花、莪
术、栀子、白芍、黄芩、甘草、当归、薄荷组成,上述诸
药材统一购自天津市药材公司,各药材采用传统中
药煎煮法制成水煎液,相当于生药1g/mL,由天津
市长征医院中药房提供。临用前用生理盐水配制成
所需浓度;原位杂交试剂盒购自TBD生物工程有
限公司;实验所需其他试剂均为市售优级纯或分析
纯试剂,。
1.3实验方法
1.3.1SLE模型鼠给药及标本制备:将SLE模型
小鼠随机分为2组,每组10只,生理盐水组,0.9%
生理盐水0.2mL/10g;狼疮2号给药组,给药剂量
为14.0mg/kg[23;每日ig给药1次,连续给药14
d。观察体重、饮食与一般状况。14d后将两组小鼠
全部处死,摘取肝、脾、肾、皮肤和子宫等组织,迅速
放入用DEPC水配制的4%多聚甲醛液中固定24
h,在无RNA酶污染的条件下经二甲苯、无水乙醇、
95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇和70%乙醇脱蜡
至水;包埋入无RNA酶污染的蜡块中,在每块组织
所得的切片中,均选取两张连续切片进行原位杂交
实验,检测各种组织细胞中ERmRNA表达量的
差异。
1.3.2原位杂交测定:采用原位杂交免疫组化试剂
盒进行测定实验。杂交检测的标记探针序列为:57一
GCCACCTGGCGTCGATTATCTGAATTTGGC—
CTGT一37; 57一CCAGATCCCTGTCTGCCAGG—
TTGGTCAGTAAGCCC一3’;具体操作如下。石蜡切
片脱蜡至水:二甲苯两次,10rain/次;无水乙醇10
min/次;90%乙醇10min/次;80%乙醇20rain/
次;0.1mol/LPBS冲洗2次。置打孔液中,室温10
rain,0.1mol/LPBS冲洗3次。滴加复合消化工作
液,覆盖组织表面,室温10~30rain。0.1mol/L
PBS冲洗2次。0.2×SSC洗一次(室温3rain)。滴
加预杂交工作液,覆盖组织37℃湿盒孵育2h。预
杂交后的洗涤,揭去盖玻片以0.2×SCC室温洗3
次,每次洗涤5rain。滴加杂交工作液(含寡核甘酸
探针),覆盖组织37℃洗3次,每次洗涤5rain,
0.2×SCC37℃洗3次,每次洗涤5rain,0.1mol
TBS37℃洗3~5次,每次洗涤5rain。滴加小鼠抗
地高辛生物素标记的抗体工作液,覆盖组织4℃湿
盒孵育过夜。0.1mol/LPBS冲洗3次,每次洗涤5
rain。滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液,
覆盖组织37℃湿盒孵育45rain。0.1mol/LPBS
冲洗3次,每次洗涤5rain。DAB显色,光学显微镜
下观察至细胞内胞浆阳性颜色与细胞外背景颜色对
比度反差明显时蒸馏水洗终止反应。细胞浆显棕黄
色颗粒为阳性反应。苏木素复染,胞核为蓝色。80%
乙醇>90%乙醇>无水乙醇>二甲苯脱水,每步须
3~5rain,中性树胶封片保留。计数方法:在
OLYMPUSXL一40显微镜下进行计数。每高倍镜
(400倍)下染色阳性细胞数占总细胞数的比率作
为阳性百分率。结果判定:以细胞质出现棕黄色颗粒
作为阳性判断标志,计数染色阳性细胞百分率。染色
强度分为4个等级:阴性(一):无阳性细胞;弱阳性
(+):阳性细胞数为10%~40%;阳性(++):阳
性细胞数40%~70%;强阳性(+++):阳性细胞
数>70%。
1.4统计学处理:应用SPSS10.0统计软件包,对
资料进行统计学计算和分析。
2 结果
原位杂交免疫组化测定结果显示:SLE模型小
鼠应用狼疮2号治疗前后,皮肤表层与真皮层细胞
内ERmRNA表达量有极显著变化(P生理盐水组SLE模型鼠肾脏、肝脏和脾脏细胞的胞
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·897·
浆均呈现强阳性染色,说明细胞内有大量ER
mRNA表达,而在同等实验条件下,狼疮2号给药
组SLE模型鼠肾脏、肝脏和脾脏细胞的胞浆内则呈
现阳性、弱阳性或阴性表现,说明细胞内EgmRNA
表达量降低。其中以肝脏降低最明显,肾脏次之,脾
脏降低程度较小。生理盐水组SLE模型鼠的子宫腺
体和肌层细胞均可见大量棕黄色颗粒,有的胞核也
有强阳性表现,狼疮2号给药组SLE模型鼠的子宫
腺体和肌层细胞的胞浆内呈弱阳性或无阳性表现
(见表1)。
表1两组SLE模型鼠各组织细胞中ERmRNA原位杂交阳性表达率比较(;±s,厅=10)
Table1 ComparisonofpositiveexpressionratefERmRNAhybridizationinsitunvarious
cellsofSLEmodelmicebetweentwogroups(;±s,n一10)
与生理盐水组比较:。Pd0.05一Pd0.01⋯Pd0。001
‘P3讨论
雌激素可加强人体免疫反应,研究表明其可加
速SLE病情的发展,可能与该病的发病机制有
关[3]。在SLE患者中,以育龄期女性(13~35岁)
占多数,与同龄男性之比为9~13:1,SLE症状常
在月经期和妊娠期加重,SLE这种性别上的差异提
示该病的发生与性激素及其代谢紊乱有关。近年来,
人们发现性激素可在免疫应答的多个水平上产生明
显的影响,性激素水平及其代谢产物的异常所造成
的内环境的失调是自身免疫反应混乱的重要因素之
一[4]。动物试验研究表明,性激素对淋巴细胞的增生
与活性起重要调节作用,女性环境有助于自身抗体
分泌细胞即B细胞的激活以及自身抗体的产生口]。
1989年Athreya等证实具有狼疮样改变的B/CO
F1鼠肝脏中ER量明显高于非狼疮样鼠,狼疮鼠模
型NZB/WF1体内肝、脾、子宫的ER明显增多。说
明ER量的升高与SLE病情相关[6]。有研究显示与
正常小鼠比较,SLE模型小鼠ER在表皮组织中的
量减低,而在真皮与脾脏淋巴细胞中的量增高。说明
SLE模型小鼠皮肤和脾脏淋巴细胞中ER的量存
在着明显的异常[2]。
LeeE73认为ER在组织细胞中的分布是处于动
态平衡状态,ER的量可随着生理及病理状态而改
变。多数资料认为雌激素对ER起上调作用,由于
SLE患者雌激素代谢异常,产生16-a一羟雌酮增加,
16一a一羟雌酮是雌二醇的代谢产物,具有雌激素活
性,可能过多的雌二醇异常代谢产物需要大量ER
与之相结合,一方面使ER的转录上调,产生增多,
从而放大了雌激素的作用;另一方面产生异常生物
学效应导致发病凹’9]。另外,在狼疮鼠模型发现雌激
素和它的类似物可增加ER结合的亲和力[10I。研究
认为ER携带有独特的组织分化抗原并拥有两个重
要的结合位点——配基结合位点和核受体结合位点。
前者与雌激素结合后使后者与核受体结合率增强。生
理状态下只有少量ER进入血液中,产生少量自身抗
体,不足以致病。但雌激素代谢异常,配基结合位点结
合了异常代谢产物,引起组织分化抗原构型改变,使
抗原性大大增强,大量抗ER抗体产生[1¨。
中医理论认为系统性红斑狼疮的发生为邪阻三
焦;热毒炽盛;五脏亏虚;气滞血瘀等多种病机相互
作用、相互调节、相互转化的结果。病人多因先天禀
赋不足导致肾阴亏耗,阴阳失调,阴虚津涸,必然产
生气血运行失常,阻于经络,造成气滞血瘀,所以气
滞血瘀是本病病机总的枢纽。狼疮2号即针对这一
病机,以活血破瘀,清热解毒,疏肝益气养阴为主要
功效。方中重用活血化瘀之品以祛邪扶正,打破气血
瘀滞的恶性循环。据文献报道,活血化瘀药确有调节
机体免疫功能的作用[1引。该中药通过清热解毒、活
血化瘀之功效,降低了ERmRNA的异常表达增
多,可能会减少ER结构的异常改变,进而恢复ER
原有的抗原性,减少多种自身抗体(如dsDNA)的
产生。狼疮2号还可调节体内多种炎性细胞因子的
水平,促进细胞免疫而抑制过表达的体液免疫应答和
致病自身抗体的产生,因而使SLE病情得以缓解和
改善口3|。总之,狼疮2号对SLE的治疗作用可能是
药物对机体作用的综合结果,其对机体细胞内ER
rnRNA表达的影响可能是其治疗作用机制之一。
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紫苏叶油对肢体缺血一再灌注大鼠离体结肠平滑肌细胞的作用
刘 蓉1,徐芳2,唐 方1
(1.天津医科大学总医院中医科,天津300052;2.天津中新药业达仁堂制药厂,天津300193)
紫苏Perillafrutescens(L.)Britt.是唇形科
紫苏属药用植物,性温、味辛。紫苏叶具有发散风寒、
行气和胃之功效。紫苏叶含挥发油,主要成分为紫苏
醛、黄酮以及金属元素。紫苏叶在临床上应用广泛,
其药理作用的研究也较丰富。有关其促进胃肠运动
的作用虽有报道[1],但鲜有系统研究,而基于胃肠动
力障碍模型的研究尚未见报道。本研究拟在通过建
立肢体缺血一再灌注引发大鼠胃肠动力障碍模型,制
备离体单个结肠平滑肌纽胞,观察紫苏叶油对模型
大鼠结肠平滑肌细胞收缩的影响,并通过钙鳌合剂
EGTA和钙离子通道阻断剂维拉帕米从细胞水平
探讨其作用机制。
1材料
1.1药品:紫苏叶油,由天津达仁堂制药厂提供。
1.2实验动物;清洁级Wistar大鼠,雌雄各半;体
重(120±20)g,购自北京大学医学部实验动物部,
许可证号:SCXK(京)2002--0001。
1.3 试剂:Ⅱ型胶原酶,美国Invitrogen公司;
Hank
7
s液、PBS,北京鼎国生物技术有限公司;台盼
蓝、50%戊二醛,天津精细化工厂;10%水合氯醛溶
液,购自天津医科大学总医院制剂室。EGTA为
Sigma公司产品;维拉帕米,上海禾丰制药有限公司。
1.4仪器:Nikon102光学显微镜,日本;5810R型
Eppendorf低温高速离心机,德国;Olympus倒置相
差显微镜,日本;Olympus—Vsp一3显微照相系统,
日本;Cmias2000图像分析系统,北京。
2方法
2.1 肢体缺血一再灌注大鼠模型制备:采用改良
Yassin法[2’3]。实验动物于造模前24h禁食,饮水不
限。以10%水合氯醛(o.3mL/100g)ip行术前麻
醉。结扎实验大鼠双侧大腿根部,持续3h,造成双
侧下肢缺血。迅速解除结扎,肢体再灌注12h,模型
制备完成。
2.2离体单个结肠平滑肌细胞的制备:模型大鼠脱
颈椎处死,迅速取出近端结肠5cm(回盲部2cm
以下部位)并置于4℃生理盐水中,沿肠系膜对侧
收稿日期:2006—11—03
作者简介:刘蓉(1975一),女,主治医师,博士生,主要从事消化系统疾病及中药药理研究。
Tel:(022)60362561E—mail:heliurong@eyou.com
万方数据
狼疮2号对系统性红斑狼疮模型鼠不同组织细胞雌激素受体
mRNA表达的影响
作者: 张京玲, 陈宏, 朱元元, 倪春生, 戴胜刚, 樊仪
作者单位: 张京玲,倪春生,戴胜刚(南开大学医学院,天津,300071), 陈宏,樊仪(天津市长征医院,天津
,300021), 朱元元(南开大学化学院,天津,300071)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2007,38(6)

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本文链接:http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200706041.aspx