全 文 ：青藤碱清除氧自由基和抗脂质过氧化作用
刘　刚, 王　辉, 张先洲, 罗顺德Ξ
(武汉大学人民医院 药学部, 湖北 武汉　430060)
摘　要: 目的　研究青藤碱体外清除氧自由基与抗脂质过氧化的作用。方法　超氧阴离子自由基 (O 2÷) 由邻苯三
酚自氧化法产生, 采用 Fenton 体系产生羟自由基 (·OH ) , 研究青藤碱对 O 2÷和·OH 的清除作用; 用硫代巴比妥
酸 (TBA ) 法测定V C2Fe2+ 系统诱导大鼠肝匀浆及肝线粒体产生的脂质过氧化物丙二醛 (M DA ) , 研究青藤碱抗脂
质过氧化的作用。结果　青藤碱能清除·OH 和O 2÷, 其 EC 50分别为 1135 和 01136 m gömL , 且呈浓度依赖关系, 青
藤碱能抑制大鼠肝匀浆自氧化及 V C2Fe2+ 系统诱导引起的脂质过氧化。结论　青藤碱具有清除氧自由基和抗脂质
过氧化的作用, 对肝线粒体也有保护作用。
关键词: 青藤碱; 氧自由基; 脂质过氧化
中图分类号: R 28515　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2006) 01 0084 04
Effect of s inom en ine on scaveng ing oxygen free rad ica l and an ti- l ip id perox ida tion
L IU Gang, W AN G H u i, ZHAN G X ian2zhou, LUO Shun2de
(D epartm ent of Pharm acy, R enm in Ho sp ita l of W uhan U niversity, W uhan 430060, Ch ina)
Abstract: Objective　To study the effects of sinom en ine on scavenging oxygen free radica l and an t i2
lip id perox idat ion in v itro. M ethods　Superox ide an ion free radica l (O 2÷) induced by the au to2ox idat ion of
pyrogallo l and hydroxyl free rad ica l (·OH ) induced by Fen ton system w ere determ ined by spectropho2
tom etry. T he inh ib it ion on homogenate and m itochondria l lip id perox idat ion, m alondia ldehyde (M DA ) , of
ra t liver induced by V C2Fe2+ system w as m easu red by th iobarab itu ric acid (TBA ) co lo rim etric m ethod.
Results　Sinom en ine cou ld sign if ican t ly scavenge O 2÷ and ·OH , it’s EC 50 w ere 1. 35 and 0. 136 m gömL
respect ively. Sinom en ine cou ld also rem arkab ly inh ib it the lip id perox idat ion of ra t liver homogenate and
m itochondria induced by au to2ox idat ion and V C2Fe2+ system. T he scavenging and inh ib ito ry effect exh ib it2
ed in a concen tra t ion2dependen t m anner. Conclusion　T he resu lts ind ica te that sinom en ine po ssesses the
effect of scavenging oxygen free radica ls and an t i2lip id perox idat ion, w h ich show s the p ro tect ion of liver
m itochondria.
Key words: sinom en ine; oxygen free radica l; lip id perox idat ion
　　青藤碱 ( sinom en ine) 是从防己科植物青藤
S inom en ium acu tum (T hunb. ) R ehd. et W ils. 及
毛青藤 S inom en ium acu tum (T hunb. ) R ehd. et
W ils. var. C inereum (D iels) R ehd. et W ils. 的干
燥藤茎中提取的一种生物碱单体, 其结构类似于吗
啡。近年来大量研究表明, 青藤碱具有抗心律失常、
降压、抗炎、镇痛、免疫抑制等多种药理作用[1, 2 ] , 临
床上用于治疗心律失常、类风湿性关节炎等多种疾
病。本实验研究青藤碱对体外产生的超氧阴离子自
由基 (O 2÷) 和羟自由基 (·OH ) 的清除作用和对
大鼠肝匀浆及肝线粒体脂质过氧化的影响。
1　材料
111　药品与试剂: 青藤碱购自白云山正青制药股份 有限公司, 质量分数≥98% , 批号 20030114; 硫代巴比妥酸 (TBA )、三氯乙酸 (TCA )、维生素 C (V C)为中国医药上海化学试剂公司生产; 考马斯亮蓝、牛血清蛋白由南京建成生物工程研究所生产; 番红花红 T、邻苯三酚等均为市售国产分析纯。112　仪器: UV —2201 型紫外分光光度计 (日本岛津) ; pH S—25 型 pH 计 (上海精科) ; D Y89—1 电动玻璃匀浆机 (宁波新芝生物科技股份有限公司) ;SH Z—22 水浴恒温振荡器 (江苏太仓医疗器械厂) ;TL —4 台式离心机 (湖南仪器仪表总厂离心机厂) ;3K30 台式冷冻离心机 (Sigm a 公司)。113　动物: W istar 大鼠, 体重 200～ 230 g, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供, 动物合格
·48· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2005204202
基金项目: 湖北省自然科学基金资助课题 (2001ABB156)
作者简介: 刘　刚, 男, 博士生, 主管药师。Tel: (027) 62036675　E2m ail: liugang w h@ho tm ail. com
证为鄂医动字 192050 号。
2　方法与结果
211　对 O 2÷的清除作用: 采用邻苯三酚自氧化
法[3 ]。取 0105 mo löL pH 8. 2 的 T ris2HC l 缓冲液
415 mL 于试管中, 置 25 ℃ 水浴中预热 20 m in, 加
入 011 mL 不同质量浓度供试液, 215 mmo löL 邻苯
三酚 014 mL , 混匀后在 25 ℃ 水浴中准确反应 4
m in, 立即用 8 mo löL HC l 0. 1 mL 终止反应, 并在
波长 299 nm 处测定吸光度 (A ) 值 (以蒸馏水调
零) , 对照组用 014 mL 蒸馏水代替供试液, 同时设
立试剂空白管。计算清除率, 根据对数线性回归获得
量效曲线, 计算 EC 50, 并进行 t 检验。结果见表 1。结
果表明, 青藤碱不同质量浓度对O 2÷均有清除作用,
且呈量效关系, EC 50为 1135 m gömL ( r= 01991 6) ;
V C 的 EC 50为 0195 m gömL。
清除率= (A 对照- A 样品) öA 对照×100%
表 1　青藤碱对 O 2÷的清除作用 (x±s, n= 5)
Table 1　Scaveng ing effect of sinomen ine on superox ide
an ion free radica l (x±s, n= 5)
组　别 Θö(m g·mL - 1) A 清除率ö%
对照 - 01895±01015 -
青藤碱 0125 01798±010123 3 10184
0150 01751±010113 3 16104
1100 01556±010123 3 37188
2100 01301±010083 3 66137
4100 01163±010093 3 81179
　　与对照组比较: 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs con tro l group
212　对·OH 的清除作用: 采用 Fen ton 反应体
系[3 ]。·OH 由 ED TA 2Fe2+ 2H 2O 2产生, 由于·OH
可特异性地使番红花红 T 褪色, 根据褪色程度用比
色法来衡量·OH 的量。反应体系含 0115 mmo löL、
pH 7. 4 PBS 1. 0 mL , 40 ΛgömL 番红花红 T 110
mL , 3% H 2O 2 110 mL , 01954 mmo löL ED TA 2Fe2+
110 mL , 再加入 110 mL 不同质量浓度的供试液, 混
匀后于 37 ℃ 保温 30 m in, 然后于 520 nm 波长处测
定A 值。空白组以蒸馏水代替供试液, 对照组以蒸
馏水代替供试液和 ED TA 2Fe2+ , 同时设立试剂空白
管, 计算清除率, 根据对数线性回归获得量效曲线,
计算 EC50, 并进行 t 检验。结果见表 2。结果表明, 5
个质量浓度青藤碱对·OH 的生成都有较强的清除
作用, 且呈现良好的量效关系, EC50为 01136 m gö
mL (r= 01991 0) ; 甘露醇的 EC 50为 3185 m gömL。
清除率= (A 样品- A 空白) ö(A 对照- A 空白)×100%
213　对大鼠肝匀浆脂质过氧化的影响
21311　对大鼠肝匀浆自发性氧化的影响[4 ]:W istar
表 2　青藤碱对·OH 的清除作用 (x±s, n= 5)
Table 2　Scaveng ing effect of sinomen ine on hydroxyl
free radica l (x±s, n= 5)
组　别 Θö(m g·mL - 1) A 清除率ö%
空白 - 01045 0±01001 0 -
对照 - 01215 0±01002 9 -
青藤碱 01031 01078 0±01001 63 3 19141
01063 01106 0±01004 73 3 35188
01125 01132 6±01002 43 3 51153
01250 01153 4±01002 73 3 63176
01500 01169 4±01003 03 3 73118
　　与对照组比较: 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs con tro l group
大鼠禁食 12 h, 次日断头处死。迅速取出肝脏, 置
4 ℃ 生理盐水中洗净表面残血, 用滤纸吸干水分,
称质量, 用 pH 7. 4 的 PBS 在冰浴条件下制成 10%
肝匀浆备用。取肝匀浆 110 mL 于试管中, 加入 110
mL 不同质量浓度供试液, 对照组以蒸馏水代替供
试液, 混匀后于 37 ℃ 水浴恒温振荡 115 h, 取出后
加 10% 三氯乙酸 210 mL , 0167% TBA 110 mL , 混
匀后沸水浴中反应 15 m in, 取出后流水冷却, 以
3 000 röm in 离心 15 m in, 取上清液在 532 nm 波长
处比色, 以空白管调零, 测定 A 值, 计算丙二醛
(M DA ) 的生成量和抑制率, 根据对数线性回归获
得量效曲线, 计算 IC 50, 并进行 t 检验。结果见表 3。
大鼠肝匀浆在 37 ℃ 恒温振荡孵育自氧化后, 氧化
产物M DA 生成量明显增加。青藤碱与肝匀浆共同
温育后, 可明显抑制M DA 的生成, 且呈浓度依赖性
变化, IC 50为 2132 m gömL (r= 01999 2)。
抑制率= (A 对照- A 样品) öA 对照×100%
表 3　青藤碱对大鼠肝匀浆自发性氧化反应的影响
(x±s, n= 5)
Table 3　Effect of sinomen ine on auto-ox idation reaction
of rat l iver homogenate (x±s, n= 5)
组　别 Θö(m g·mL - 1) M DA ö(nmo l·g- 1) 抑制率ö%
对照 - 27915±2217 -
青藤碱 0125 22516±10173 3 1913
0150 20010±15113 3 2814
1100 17519±14103 3 3711
2100 14717±12123 3 4712
4100 11519± 8163 3 5815
　　与对照组比较: 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs con tro l group
21312　对 V C2Fe2+ 诱导的大鼠肝匀浆脂质过氧化
的影响: 方法同 21311 项, 但反应体系中加 V C (1
mmo löL ) 50 ΛL、FeSO 4 · 7H 2O ( 1 mmo löL ) 50ΛL , 于 37 ℃ 水浴恒温振荡 115 h, 测定M DA 的生
成量, 并计算抑制率。根据对数线性回归求算 IC 50,
·58·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
并进行 t 检验。结果见表 4。结果表明, 肝匀浆经过
V C2Fe2+ 的诱导氧化, 氧化产物M DA 的生成量显
著增加, 不同质量浓度青藤碱与肝匀浆共同温育后
可显著抑制M DA 的生成量, 且呈良好的量效关系,
IC 50为 1194 m gömL (r= 01991 7)。
表 4　青藤碱对 VC-Fe2+ 诱导的大鼠肝匀浆脂质过氧化
反应的影响 (x±s, n= 5)
Table 4　Effect of sinomen ine on l ip id perox idation
of rat l iver homogenate induced by VC-Fe2+
system (x±s, n= 5)
组　别 Θö(m g·mL - 1) M DA ö(nmo l·g- 1) 抑制率ö%
对照 - 31714±2212 0
青藤碱 0125 27514±16133 3 1312
0150 23313±19173 3 2615
1100 19313±12183 3 3911
2100 15915± 8143 3 4918
4100 11614± 7183 3 6313
　　与对照组比较: 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs con tro l group
214　对 V C2Fe2+ 系统诱导的大鼠肝线粒体氧化损
伤的影响
21411　线粒体的制备[5 ]: 大鼠禁食过夜, 次日断头处
死, 取肝脏于 4 ℃ 生理盐水中洗净表面残血, 滤纸吸
干水分, 称质量, 加入预冷的匀浆介质 (0101 mo löL
庶糖, 0101 mo löL T ris2HC l, 0. 1 mmo löL ED TA 2
2N a 溶液) 制成 10% 肝匀浆。将匀浆于 4 ℃、800×
g 离心 20 m in, 取上清液于 4 ℃、10 000×g 离心 20
m in, 沉淀加入预冷的匀浆介质洗涤两次, 每次 4 ℃、
10 000×g 离心 10 m in, 即得纯化的线粒体, 沉淀物
用冰冷的匀浆介质制成混悬液, 考马斯亮蓝法测线
粒体蛋白的量, 0～ 4 ℃ 储存备用。
21412　反应系统: 体积 3 mL , 内含 110 m g 线粒体
蛋白, 100 Λmo löL V C, 50 Λmo löL Fe2+ 及不同质量
浓度的药物, 用 pH 7. 4 的 PBS 补足至 3 mL , 37 ℃
水浴, 观察线粒体悬液在波长 520 nm 处 A 值的变
化。结果见图 1。线粒体肿胀是其损伤的表现, 线粒
体肿胀导致其浊度降低, 表现为 A 值下降, 由图 1
可见, 大鼠肝线粒体经 V C2Fe2+ 诱导后, 模型组肿
胀程度增加, 且随时间的延长, 肿胀越明显。加入不
同质量浓度青藤碱后, 在相同时间里, 线粒体的肿胀
受到明显的抑制, 且呈现一定的量效关系。
21413　对 V C2Fe2+ 诱导的大鼠肝线粒体脂质过氧
化损伤的的影响: 反应体积 1 mL , 内含线粒体蛋白
015 m g, 1 mmo löL V C, 1 mmo löL Fe2+ 及各种质量
浓度的药物或缓冲液, 置 37 ℃ 恒温振荡水浴, 1 h
后取出 011 mL 样品, 测定M DA 水平。结果见表 5。
　　12对照　2～ 42青藤碱 015、110、210 m gömL 　52模型
　　12con tro l　2—42sinom enine 0. 5, 1. 0, and 2. 0 m gömL
　　52model
图 1　青藤碱对 VC-Fe2+ 诱导的大鼠肝线粒体
形态改变的影响 (x±s, n= 3)
F ig. 1　Effect of sinomen ine on dila ta tion of rat
l iver m itochondr ia induced by VC-Fe2+
system (x±s, n= 3)
表 5　青藤碱对 VC-Fe2+ 诱导的大鼠肝线粒体脂质过氧化
损伤的影响 (x±s, n= 5)
Table 5　Effect of sinomen ine on l ip id perox idation
of rat l iver m itochondr ia induced by VC-
Fe2+ system (x±s, n= 5)
组　别 Θö(m g·mL - 1) M DA ö(nmo l·m g- 1)
对照 - 26187±1106
青藤碱 015 21123±01863 3
110 18136±01763 3
210 16162±01283 3
　　与对照组比较: 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs con tro l group
青藤碱能显著抑制 V C2Fe2+ 诱导的肝线粒脂质过
氧化产物M DA 的生成, 其抑制作用在一定范围内
呈浓度依赖性。
3　讨论
　　抗自由基的药物研究近年来受到人们的重视,
尤其是在防治心脑血管疾病领域。机体在代谢过程
中产生的氧自由基在某些病理条件下因代谢产物过
量, 对机体的生物大分子如蛋白质、脂质、核酸等造
成氧化损伤。氧自由基可促发不饱和脂肪酸发生脂
质过氧化 (L PO ) 反应, 反应产生的各种中间氧化
产物也具损伤作用,L PO 反应的终产物M DA 可使
含氨基的蛋白质、核酸、卵磷脂发生交联并丧失活
性, 其中·OH 的作用更强。许多病理生理现象, 如
衰老、肿瘤、炎症、缺血缺氧等均与氧自由基及其诱
导的 L PO 反应有密切关系[6 ]。
在 V C2Fe2+ 自由基发生系统中, 由 V C 引起的
Fe3+ 到 Fe2+ 的循环促使 O 2÷、H 2O 2和·OH 的生
成, 诱发多不饱和脂肪酸氧化, 产生脂氧自由基和脂
过氧自由基, 引发链式和支链式反应, 使多不饱和脂
肪酸进一步发生过氧化形成L PO。L PO 大部分由
肝细胞产生, 其分解也主要在肝脏,M DA 是 L PO
的主要降解产物, 其水平可反映L PO 的程度。
·68· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
本实验研究结果表明, 青藤碱体外可清除O 2÷
和·OH; 可显著降低肝匀浆的自氧化与 V C2Fe2+
诱导产生的M DA ; 对于肝线粒体经 V C2Fe2+ 诱导
氧化引起的M DA 的生成及肿胀度的改变有显著的
抑制作用。说明青藤碱具有清除自由基和抗脂质过
氧化作用, 其抗氧化作用可能与其分子结构中的酚
羟基有关[7, 8 ]。提示青藤碱可作为一种天然抗氧化
剂, 其药效学和作用机制有待进一步研究。
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葡萄籽原花青素舒张家兔离体主动脉的研究
张团笑1, 贺　殿2, 牛彩琴3, 秦晓民1Ξ
(11 兰州医学院 生理学教研室, 甘肃 兰州　730000; 21 兰州医学院 药物化学教研室, 甘肃 兰州　730000;
31 甘肃中医学院 内科教研室, 甘肃 兰州　730020)
摘　要: 目的　研究葡萄籽原花青素 (PC) 对主动脉环的舒张作用及机制。方法　采用家兔离体主动脉平滑肌标
本, 以去甲肾上腺素 (NA ) 预收缩主动脉后给予不同剂量 PC 观察其张力变化, 并探讨去除血管内皮、给予 NO 合
酶抑制剂左旋硝基精氨酸 (L 2NNA )、甲烯蓝 (M B )、环氧酶抑制剂吲哚美辛 ( Indo) 和 Β肾上腺素能受体阻断剂普
萘洛尔 (P rop ) 对血管张力变化的影响。结果　PC 对动脉环静息张力无明显影响, 但不同剂量 PC 可使 1×10- 6
mo löL NA 预收缩的血管出现明显地舒张 ( r= 0163, P < 01001)。去除血管内皮、1×10- 4 mo löL L 2NNA 或 1×
10- 5 mo löL M B 可减弱 PC 的舒张作用, 但 Indo 和 P rop 无影响。另外, 40 ΛgömL PC 对无内皮血管环NA 和 KC l
的量效收缩反应明显减弱, 且 NA 和 KC l 的 PD 2分别由对照组的 7105±2119 和 1157±1137 降低为 6104±1177
和 1101±0193。结论　PC 对主动脉的舒张作用是通过平滑肌细胞膜上的受体依赖性 Ca2+ 通道和电压依赖性
Ca2+ 通道抑制 Ca2+ 内流, 使动脉环舒张, 其作用与内皮释放的 NO 有关。
关键词: 原花青素; 离体主动脉环; 内皮细胞; 血管舒张
中图分类号: R 28515　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2006) 01 0087 03
Va sod ila tion of procyan id in s from grape seeds on isola ted rabb it aorta
ZHAN G T uan2x iao 1, H E D ian2, N IU Cai2qin3, Q IN X iao2m in1
(11D epartm ent of Physio logy, L anzhou M edical Co llege, L anzhou 730000, Ch ina; 2. D epartm ent of Pharm aceu tical
Chem istry, L anzhou M edical Co llege, L anzhou 730000, Ch ina; 3. D epartm ent of M edicine,
Gansu Co llege of T radit ional Ch inese M edicine, L anzhou 730020, Ch ina)
Key words: p rocyan id in s; iso la ted ao rt ic rings; endo thelia l cells; vasodila t ion
　　原花青素 (p rocyan id in s, PC) 是广泛存在于植
物中的多酚类化合物, 由不同数量的儿茶素或表儿
茶素缩合而成。PC 在葡萄属植物种子中的量很高。
葡萄盛产于西北, 作为药用由来已久, 具有补气血、
·78·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2005206220
基金项目: 甘肃省教育厅科研项目 (033B 202)
作者简介: 张团笑 (1968—) , 男, 甘肃省静宁县人, 讲师, 1995 年毕业于兰州医学院临床系, 学士学位, 现从事平滑肌生理和药理研究。Tel: (0931) 8611050
　E2m ail: lanyizhangtx@163. com