全 文 ：·558· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月
肉桂醛和柠檬醛对黄曲霉及烟曲霉细胞DNA与RNA的影响
谢小梅1，龙凯2，许杨1，方建茹2
(1．南昌大学中德联合研究院教育部食品科学重点实验室，江西南昌 330047；2．江西中医学院，江西南昌330006)
摘 要：目的 研究肉桂醛、柠檬醛对黄曲霉和烟曲霉细胞DNA、RNA水平的影响，以期探明其抗真菌的作用机
制。方法 黄曲霉、烟曲霉接种在含有不同浓度药物的蔡氏固体培养基中，同时设不加药物为空白对照，置26．5℃
恒温培养3～6d，将对照组和用药组真菌细胞进行激光扫描共聚焦显微镜观察并作细胞扫描图像分析，以对
DNA、RNA进行定量和定位观察。结果用药组DNA、RNA水平发生不同变化，出现多核分生孢子。结论肉桂
醛、柠檬醛直接或间接影响了真菌细胞遗传物质的正常合成，以至不能完成正常细胞周期，影响分生孢子梗的正常
分化，从而抑制真菌生长、繁殖。
关键词：肉桂醛；柠檬醛；黄曲霉；烟曲霉；DNA；RNA；激光扫描共聚焦显微镜
中图分类号：R286．85 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)04—0558—03
EffectofcinnamaldehydeandcitralonDNAandRNAinAspergillusf avus
andA．fumigatuscells
XIEXiao—meil，LONGKai2，XUYan91，FANGJian—ru2
(1．TheK yLaboratoryofFoodScienceofMOE，Jiangxi—OAIJointResearchInstitute，NanchangUniversity，
Nanchang330047，China；2．JiangxiCollegeofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330006，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheffectsofcinnamaldehydeandcitralonDNAandRNAof
Aspergillusf avusandA．^migatuscellsandtheirmechanisms．MethodsA．flavuandA．／五migatus
wereincubatedonCzapek
7
Sagarplate(treatedwithcinnamaldehydeandcitralatdifferentco centrations)
at26．5℃for3—6d．Thenormalandtreatedc llswereobservedbylaserscanningconfocalmicroscope
(LSCM)andimageanalysistodescribethDNAandRNA1evelsbyquantityandlocalization．Results
DNAandRNAlevelswerechangedreatlyandmultinucleateoniosporesapp aredinthetreatedc lls．
ConclusionC nnamaldehydeandcitralhavedirectlyorindirectlyinterferedtheconventionalsynthesisof
fungalhereditaryDNAandRNAandnormaldifferentiationofconidiophoreinA．f&vusandA．／五miga—
tus，thusinhibitingheormalce lcycleandthegrowthandpropagationoffungi．
Keywords：cinnamaldehyde；citral；Aspergillusfla口．sLink；A．^migatusFres．；DNA；RNA；
laserscanningco focalmicroscope(LSCM)
深部曲霉菌感染已成为免疫功能低下患者的主
要死亡原因，抗生素及化学合成药物的疗效不满意。
肉桂醛、柠檬醛有良好的抗曲霉菌作用[1]，探讨它们
的抗曲霉菌机制对开发和研制新型抗真菌药物有重
要的理论和实践意义。本实验利用激光扫描共聚焦
显微镜(1aserscanningconfoealmicroscope，
LSCM)，获取了吖啶橙(acridineorang ，AO)染
色后的单细胞或细胞群的DNA、RNA等细胞特异
结构的清晰荧光图像；并结合图像分析仪，对其图像
平均荧光强度进行自动测定。细胞群体经染色后，由
于每个细胞结合的染料与DNA、RNA水平成正
比，所以每个细胞受激后发射的特异性荧光强度与
它的DNA、RNA水平成正比。因此将LSCM与图
像分析相结合可对细胞进行DNA、RNA的定量、
定位分析。本实验首次将LSCM用于研究肉桂醛、
柠檬醛对曲霉菌细胞DNA、RNA水平的影响，以
期发现药物作用的靶点，为进一步探索肉桂醛和柠
檬醛抗曲霉菌机制奠定基础。
1材料与方法
1．1 菌株：均为标准株，烟曲霉菌(CCCCMID
A1)、黄曲霉菌(CCCCMIDA2)，购自中国医学真
菌中心(南京)。
1．2药物与试剂：肉桂醛(cinnamaldehyde)购自
上海双喜香料制剂厂，纯度>95％，批号20020401；
柠檬醛(citral)德国进口，纯度>98％，批号002489
$20085632；酮康唑(每片200mg，批号 30418108)
收稿日期：2004—07—29
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30160099)
作者简介：谢小梅(1964一)，女，博士，教授，研究方向为中药与微生物。Tel：(0791)7118937E—mail：1990xxm@sohu．corn
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月·559·
为西安杨森制药有限公司生产；蔡氏培养液瞳1；吖啶
橙(Sigma公司)；其他试剂均为分析纯。
1．3 仪器：MRC--1024型激光扫描共聚焦显微
镜，共聚焦系统由Bio—Rad公司提供的软件控制，
配置Zeiss显微镜。真菌培养箱，紫外分光光度计。
1．4方法
1．4．1菌液的制备：将试验菌株接种于蔡氏斜面，
26℃培养至快速生长早期，活化2次，此时菌落覆
盖斜面，加入蔡氏液体，用吸管吹打菌落使孢子游离
于培养液中，用500目无菌尼龙网滤过，滤液经血
细胞计数板计数及紫外分光光度计测定，调整孢子
浓度为1×106／mL。
1．4．2药液的制备[1’3]：将研成细粉的酮康唑溶于
二甲基亚砜，使其质量浓度为40mg／mL。于无菌、
直径为15cm的平皿内分别加入柠檬醛9．16、6．11
弘L，肉桂醛6．36、7．62弘L，酮康唑4、50pL，将冷却
至50℃左右的蔡氏固体培养基50mL迅速倒入
上述平皿内，混匀(药物终质量浓度分别为：柠檬醛
0．16、0．11tlg／mL；肉桂醛0．13、0．16tlg／mL；酮康
唑3．2、40／,g／mL)，待其凝固。
1．4．3激光扫描共聚焦显微镜观察；将1．4．1制
备的菌液接种在1．4．2制备的含有不同质量浓度
药物的蔡氏固体培养基中(孢子终浓度为1×104／
mL)，同时设不加药物为空白对照，置26．5℃恒温
培养3～6d，PBS洗脱平皿上的孢子，用500目无
菌尼龙网滤过，滤液5000r／min离心3min，弃上
清液，用PBS将细胞悬起，调整细胞浓度为1×105／
mL。取细胞悬液1mL，加0．5％AO20pL，30℃
作用30min，5000r／min离心3min，弃上清液，
PBS洗去多余染料(洗涤4～5次，至上清液透明)，
弃去上清液，制成细胞悬液，吸取细胞悬液1滴置
载玻片上，用激光扫描共聚焦显微镜观察。实验重复
2次。仪器相关参数为：Kr／Ar激光器，Laserpower
30％，激发光为波长488nm的激光；发射波长检测
滤镜为LP580，522／35；油镜×40。
1．4．4细胞扫描图像分析：将LSCM获取的荧光
图像通过联网送人图像分析仪，每组随机选取不同
视野的细胞共计100个以上，存图，用图像分析软
件进行荧光强度分析。细胞内DNA呈绿色荧光，
RNA呈红色荧光，橙黄色荧光为DNA和RNA双
色荧光的结合。
1．4．5 数据处理：荧光强度以荧光像素的(工±s)
表示，t检验法进行两组间均数的显著性检验。
2结果
2．1 黄曲霉细胞扫描图像分析：对照组和酮康唑
(3．2t-g／mL)处理组黄曲霉细胞核内橙红色荧光
分布均匀，核圆形且大小均一；肉桂醛(0．13弘g／
mL)、柠檬醛(o．16btg／mL)作用后核内橙红色荧
光分布不均匀，以绿色荧光为主，核形态、大小不一，
可见多核细胞。对照组和酮康唑(3．2tLg／mL)处理
组黄曲霉孢子细胞核绿色荧光分布均匀；肉桂醛
(0．13t-g／mL)、柠檬醛(0．16t-g／mL)作用后可见
多核细胞，肉桂醛作用后绿色荧光增强(P柠檬醛作用后绿色荧光减弱(P檬醛作用后红色荧光均减弱(P<0．05)，见表1。
表1药物处理后黄曲霉细胞内DNA和RNA水平(辟一2)
Table1 DNAandRNAlevelsinA．flavuscell
treatedbydrugs(辟一2)
组别 终质量浓度／(vg·mL-1)DNA(荧光像素)RNA(荧光像素)
与对照组比较：’P’P<0．05VScontrolgroup
2．2烟曲霉细胞扫描图像分析：对照组烟曲霉细胞
核内橙黄色荧光分布均匀，胞质可见较强的红色荧
光；肉桂醛(o．16／-g／mL)作用后细胞核内橙黄色
荧光明显减弱，核形态、大小不一；柠檬醛(0．11
ptg／mL)、酮康唑(40t，g／mL)作用后细胞核内橙黄
色荧光分布均匀，未见胞质红色荧光。肉桂醛作用后
绿色荧光减弱(P色荧光增强(P用后红色荧光均减弱(P<0．05)，见表2。
表2药物处理后烟曲霉细胞内DNA和RNA水平(n一2)
Table2 DNAandRNAlevelsinA．fumigatuscell
treatedbydrugs(聪一2)
组别 终质量浓度／(腿·mL-1)DNA(荧光像素)RNA(荧光像素)
与对照组比较：’Pd0．05
。P<0．05uscontrolgroup
3讨论
肉桂醛、柠檬醛是肉桂、山苍子油的主要成分，
两者已分别用于化工、食品、粮食防腐和医疗卫生。
实验表明，它们具有良好的抗曲霉菌作用。但对它们
的抗曲霉菌机制报道极少。张文娟用透射电镜观察
了肉桂醛对黄曲霉的超微结构变化，认为肉桂醛可
能通过破坏真菌细胞壁，使药物渗入细胞内，破坏细
万方数据
·560· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月
胞器而起强大的杀菌作用[4]。罗曼等对柠檬醛抑制
黄曲霉生长的相关机制进行了研究，结果认为柠檬
醛可以改变黄曲霉细胞质膜的选择通透性、破坏线
粒体结构、与DNA相互作用，使DNA链断裂[5~7]。
电镜对细胞的分析仅处于细胞形态、结构的描
述，无法确定细胞内DNA、RNA水平，而应用分子
生物学技术对DNA、RNA分析是以细胞提取物进
行研究，已不能反映细胞内DNA、RNA定量和定
位的内在联系。激光扫描共聚焦显微镜则可直接对
单个细胞的DNA、RNA进行定量和定位观察，本
实验首次报道了用激光扫描共聚焦显微镜研究肉桂
醛、柠檬醛对烟曲霉、黄曲霉DNA、RNA的影响，
结果表明：与阴性对照组相比，肉桂醛、柠檬醛作用
黄曲霉后，视野中有大量多核细胞，肉桂醛处理黄曲
霉后DNA水平增加，而柠檬醛作用后DNA水平
减少；酮康唑作用黄曲霉后，DNA、RNA水平不变；
肉桂醛作用烟曲霉后DNA水平减少，而柠檬醛、酮
康唑作用后DNA水平增加；药物作用于烟曲霉、黄
曲霉后RNA均减少(除酮康唑作用黄曲霉外)。
烟曲霉、黄曲霉归类于半知菌亚门丝孢纲丝孢
目丛梗孢科曲霉属。在它们的正常生长繁殖过程中，
当分生孢子被接种在适宜培养基上培养一定时间
后，孢子萌发产生一短的芽管，芽管以顶端生长方式
延长并产生分枝，期间细胞核分裂，核迁移至延长的
菌丝内，每隔一定间距形成一横隔，将菌丝分隔成一
个个小室。分生孢子梗则从特化了的厚壁而膨大的
菌丝细胞垂直生出，其顶部膨大为可孕性的顶囊，顶
囊表面产生小梗，单核的分生孢子自小梗顶端以向
基式生成法的方式产生[2’8’⋯。构巢曲霉Aspergillus
nidulans基因突变体研究已证明，至少有50多个基
因调控着核分裂、核迁移、胞质分裂和横隔形
成口“11]。本实验中肉桂醛、柠檬醛作用黄曲霉后分
生孢子出现多核现象，可能是由于药物影响了黄曲
霉分生孢子梗在分化过程中核迁移、胞质分裂和横
隔形成的协调进行从而影响黄曲霉的繁殖。肉桂醛
处理黄曲霉及柠檬醛处理烟曲霉后DNA水平增
加，可能是由于药物直接干扰了DNA的正常合成，
使细胞周期在G。期到M期重复复制。而肉桂醛作
用烟曲霉、柠檬醛作用黄曲霉后，其DNA水平明显
减少，细胞核模糊不清，说明药物直接作用靶位即便
不是DNA，也间接干扰了DNA正常合成或导致细
胞周期停滞在G。期。药物作用后(除酮康唑作用黄
曲霉外)，烟曲霉、黄曲霉RNA水平均减少，可能是
由于药物抑制RNA合成或加速RNA降解，RNA
代谢的异常，最终导致蛋白质代谢异常。罗曼发现柠
檬醛作用黄曲霉后，以NADP+为辅酶测定苹果酸
脱氢酶(MDH)活力降低，推测MDH活力的降低
将导致细胞内NADPH还原力的减少，推断还原力
的减少抑制四氢叶酸(FH。)的合成而间接影响核
酸合成[6]。同位素标记试验也表明肉桂醛、柠檬醛作
用黄曲霉、烟曲霉后3H—TdR，3H—UdR，3H一亮氨酸
的摄入较对照组减少，以3H—UdR减少更明显∞j，这
与本实验结果一致。本实验中以酮康唑作阳性对照，
其作用靶位是羊毛甾醇14a一去甲基化酶，该酶是真
菌细胞膜必需成分麦角甾醇生物合成过程中的一个
关键酶，实验中酮康唑作用黄曲霉后DNA、RNA
水平不变，而作用烟曲霉后DNA水平增加、RNA
水平减少，说明酮康唑的作用靶位除细胞膜外，也干
扰了遗传物质的正常合成[12|。
本实验结果表明不同药物作用于黄曲霉、烟曲
霉，对DNA的影响不一，说明药物结构不同，作用
机制不同，不同菌种对药物的反应也不同，也说明中
药活性成分抗曲霉菌机制是复杂的、多方面的，本室
正在从不同层面研究肉桂醛、柠檬醛的抗曲霉菌作
用机制。
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万方数据
肉桂醛和柠檬醛对黄曲霉及烟曲霉细胞DNA与RNA的影响
作者： 谢小梅， 龙凯， 许杨， 方建茹， XIE Xiao-mei， LONG Kai， XU Yang， FANG Jian-ru
作者单位： 谢小梅,许杨,XIE Xiao-mei,XU Yang(南昌大学中德联合研究院,教育部食品科学重点实验室
,江西,南昌,330047)， 龙凯,方建茹,LONG Kai,FANG Jian-ru(江西中医学院,江西,南昌
,330006)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(4)
被引用次数： 14次

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