全 文 ：·386· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrags第36卷第3期2005年3月
药理与I隘床
四物汤化学成分组合对人骨髓基质细胞系HFCL细胞增殖
及造血相关基因表达的影响
李鹰飞，佟 丽，梁乾德，王升启。
(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
摘 要：目的 观察四物汤及其化学成分组合对人骨髓基质细胞系HFCL细胞增殖及造血相关基因表达谱的影
响，探讨其促HFCL细胞增殖的可能机制。方法MTT法测定四物汤化学成分组合对体外HFCL细胞增殖的影
响；运用流式细胞术分析细胞周期的变化；制备人造血相关细胞因子寡核苷酸芯片并检测四物汤及其化学成分组
合所致的造血相关细胞因子基因差异表达情况。结果 四物汤化学成分组合增强HFCL细胞的能量代谢，促进
HFCL细胞增殖；四物汤化学成分组合组处于G。／G，期的细胞显著少于空白组；增殖指数(PI)则显著大于空白
组；IL：一Ra、NF—KB、TPO基因表达上调。结论四物汤化学成分组合可通过上调IL：一Rd、NF—KB、TP0基因表达而
促进HFCL细胞增殖。
关键词：四物汤化学成分组合；细胞增殖；造血相关基因表达谱；寡核苷酸芯片
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)03—0386—04
EffectsofcomponentcombinationinS wuDecoctiononproliferationofhumanbone
marrowstromalcellinesHFCLandhematopoiesis—relatedgenexpression
I。IYing—fei，TONGLi，LIANGQfan—de，WANGSheng—qi
(InstituteofRadiationMedicine，AcademyofMilitaryMedicalScience，Beijing100850，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectsofcomponentcombinationinSiwuDecoction
(CCSWD)ontheproliferationofhumanbonemarrowstromalcellinesHFCLandhematopoiesis—related
geneexpressionandtoprobeintothemeehanismofthestimulativeeffectsofSWDandCCSWDonthepro—
liferationofHFCLcells．MethodsMTTandFCMwereusedforassayingtheproliferationpote cyand
cellcycleofHFCLcells，respectively．Ahumanhematopoiesis—relatedcytokinoligonuleotidemicroarray
waspreparedtoinvestigatethediversityofgeneexpressionofHFCLcellsinSWDandCCSWDgroups．
ResultsThenergymetabolismandproliferationpo encyofHFCLcellstreatedwithCCSWDweremore
promptedthanthatofthecontrolgroup．Meanwhile，thepercentageofHFCLcellsinGo／C1phasetreated
withCCSWDwasignificantlylower，whiletheproliferationindex(PI)washigherthanthatofthecon—
trolgroup．Comparedtothecontrolgroup，expressionsofIL2一Ra，NF—KB，andTPOwereup—regulatedin
CCSWDgroup．ConclusionThepr liferationofHFCLcellscouldbefacilitatedbyCCSWDwithup—regu—
latingthexpressionsofIL，一Ra，NF—IcB，andTPO．
Keywords：componentcombi ationinS wuDecoction(CCSWD)；cellproliferation；hematopoiesis—
relatedg neexpressionprofile；oligonucjeotldeml roarray
四物汤首见于宋代《太平惠民和剂局方》，由熟
地、当归、白芍、川芎组成。具有增强免疫、补血调血
等功效，在临床广泛应用，为补血、调经之良方。近年
来主要对其全方、单味药及配伍的机制研究较为系
统和深入，但这些研究对象多限于药材或个别的单
体成分，研究结果也只是涉及一个或几个基因，难以
体现中药尤其是中药复方多成分配伍、多靶点、多途
径协同起作用的特点，也难以从基因网络水平研究
中药的机制，而基因芯片有高通量、多靶点的特点，
有利于克服此局限。本实验室前期研究表明四物汤
收稿日期：2004—06—19
基金项目：国家自然科学基金项目(30271617，30070913)；“十五”军队重点项目(012019)；北京市“二四八”重大创新工程项目
(H010210220113)
作者简介：李鹰飞(1977一)，男，山东青岛人，军事医学科学院放射医学研究所生物技术室2001级硕士研究生，从事中药基因组学方面
的研究。E—mail：1yf334@yahoo．corrl．cn
*通讯作者Tel／Fax：(OLO)6693221lE—mail：sqwang@nic．bmic．ac．cn
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月·387·
含有芍药苷、果糖、蔗糖、葡萄糖、阿魏酸等成分，芍
药苷等具有促进辐射致血虚小鼠造血功能的作
用口矗3；用寡核苷酸芯片研究了血虚小鼠造血相关细
胞因子基因表达谱，各组织中共发现21个差异表
达的基因。这些基因的功能大致分为3类：促细胞
生长或增殖；免疫调节；诱导血细胞形成或促造血祖
细胞形成集落[3]。本研究基于化学基因组学的思路，
结合基因芯片技术探讨四物汤化学成分组合对人骨
髓基质细胞系HFCL细胞增殖的作用及对其基因
表达谱的影响。
1材料
1．1 药材及制备：四物汤由熟地黄、当归、白芍、川I
芎组成，全部药材均购自北京同仁堂药店，经本室马
百平研究员鉴定。按《太平惠民和剂局方》规定的剂
量称取熟地黄15g、当归10g、白芍10g、川I芎6g。
经水煎、滤过、浓缩、制成100％药液(即含生药1
g／mL)，置4‘C保存。细胞培养时，滤过除菌。
1．2 四物汤化学成分组成及其含量测定：阿魏酸、
芍药苷、川I芎嗪对照品均购自中国药品生物制品检
定所，果糖为国产分析纯。用HPLC法测得30mL
四物汤药液含果糖1002mg、阿魏酸6mg、芍药苷
79．5mg，基于文献分析换算得30mL四物汤药液
含川芎嗪30mg[4]。用不含血清的培养液按果糖：
阿魏酸：川I芎嗪：芍药苷为2004：12；60：159
配成总质量浓度为5mg／mL溶液，置4℃保存备
用。细胞培养时，须滤过除菌。
1．3 主要试剂及仪器：MTT(Sigma公司)；
IMDM、胎牛血清、Trizol、Rnasin40U／／_￡L，均为
GibcoBRL公司产品；Super—scriptⅡ逆转录酶
(200U／／1I。，Invitrogin公司)；Cy3／Cy5一dUTP(1
mmol／I，，Amer—shamPhar acia)；阳性对照LUC
mRNA及芯片由本实验室制备。Mill—QBioeel超
纯水器(Millipore公司)，Napco--5410CO：培养箱
(Heraeus公司)，Wallac1420酶标仪(芬兰产品)，
DU640核酸蛋白紫外分析仪(Backman公司)，
GenePix4000B扫描仪(AxonInstruments，Inc)，
GenePixr04．0分析软件(AxonInstruments，
Inc)。其他试剂均为国产分析纯。
1．4细胞系：人骨髓基质细胞系HFCL(简称HF—
CI．)来源于正常人胎儿骨髓基质细胞，由中国医学
科学院血液学研究所姜学英教授建系[5]，本室保存。
培养于含10％胎牛血清IMDM培养液，实验均用
处于对数生长期的细胞。
2方法
2．1 MTT法测定四物汤化学成分组合对HFCL
细胞增殖活力的影响：将制备的HFCL悬液接种在
96孔培养板中，每孔接种培养液200FL，含4×103
个细胞。经CO：培养箱孵育24h，观察细胞生长状
态良好，换无血清培养液，继续孵育48h，将细胞阻
滞在G，期。换含3％血清培养液，每孑L溶液总体积
为200FL。四物汤化学成分组合设10个给药组，终
质量浓度分别为0．25、0．5、1、2、4、8、16、32、64、128
／生g／mL，每组8个复孔，另设不含药的细胞悬液对
照组和空白对照组。37。C、5％CO。饱和湿度条件下
培养48h后，每孔加入MTT液(5mg／mL)20
肛L，继续避光培养4h，离心，弃上清液，每孔加入
200,uL二甲基亚砜，振荡10min，在酶联免疫检测
仪上于波长490nm测定各孔吸光度(A)值卟]，计
算细胞生长增殖率。
细胞生长增殖率一[(A给药--A空自)／(A对照一以空自)一1]×
100％
2．2流式细胞术测定化学成分组合对HFCL细胞
周期的影响：将制备的HFCL悬液接种在10cm2培
养瓶中，每瓶接种培养液5mL，含2×105个细胞。
经CO。培养箱孵育24h，观察细胞生长状态良好，
换无血清培养液，继续孵育48h，将细胞阻滞在G。
期。换含3％血清培养液，分为空白、四物汤及四物
汤化学成分组合3组，四物汤终质量浓度为32gg．／
mL、四物汤化学成分组合终质量浓度为8Fg／mL，
每组6瓶，继续避光培养12h。0．25％胰酶消化，1
体积细胞悬液(约1×106个细胞)加9体积70％
乙醇，于一20℃固定细胞12h(可保存2～3周)。
离心，用PBS液洗涤除尽乙醇，离心后的细胞重悬于
1mLPI染液，室温染色30min[7]。流式细胞仪荧光
检测各细胞周期DNA水平，计算增殖指数(PI)。
2．3 四物汤及其化学成分组合对HFCL基因表达
谱的影响口3
2．3．1寡核苷酸芯片的制备：从Genebank中检索
并选取142个造血相关的人源细胞因子基因的
mRNA序列，用Mprobe软件设计备选探针，长40
mer。经Blast分析从其中筛选出基因特异性寡核苷
酸探针。合成5L氨基修饰的寡核苷酸探针。3×SSC
点样液溶解探针至0．5弘g／肛L。点样仪将探针点于
本实验室自制的醛基化基片上，放置过夜备用。
2．3．2荧光标记探针的制备：将制备的HFCL悬
液接种在25cm2培养瓶中，每瓶接种培养液12
mL，含1×106个细胞。经CO。培养箱孵育24h，观
察细胞生长状态良好，换无血清培养液，继续孵育
万方数据
·388‘ 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月
48h，将细胞阻滞在G，期。换含3％血清培养液，分
为空白、四物汤及四物汤化学成分组合3组，四物汤
终质量浓度32弘g／mL、四物汤化学成分组合终质
量浓度8／ag／mL，每组2瓶，继续避光培养12h。按
Trizol试剂说明书提取各组细胞的总RNA[8]，紫外
分析仪测定纯度及浓度，1％甲醛变性琼脂糖凝胶
电泳分析总RNA的完整性[9]。取各组总RNA约
80弘g置于EP管中，分别加入阳性对照LUCmR—
NA0．3btg进行反转录，用Cy3一dUTP标记空白组
cDNA，Cy5一dUTP标记不同给药组cDNA，如此
实验重复2次。cDNA产物溶于2肚L水中备用。
2．3．3杂交：将已溶解的cDNA探针与6pL杂交
液充分混匀，96℃水浴变性2min后立即冰浴。将
等量的空白组cDNA探针杂交液分别与不同给药
组cDNA探针杂交液混合，均匀铺到芯片上，用盖
玻片封片，置于密封湿润的杂交仓中，42℃杂交3
h。杂交完毕，分别用洗液A(1×SSC，0．2％SDS)，
洗液B(0．2×SSC)，洗液C(0．1×SSC)梯度洗
片，室温干燥。
2．3．4 激光共聚焦扫描及结果分析：GenePix
4000B扫描仪扫描芯片，GenePixPr04．0分析软件
对扫描数据进行定量分析。
2．4数据处理：MTT实验和流式细胞术实验的数
据统计分析进行组间t检验，结果均以z-4-_S表示。
差异表达基因的筛选应用GenePixr04．0分析软
件筛选差异基因，标准是：(1)两种相互比较的信号
荧光强度值至少有一个大于600，或者其中一个约
为0，另一个信号值大于1000；(2)信号荧光强度的
比值大于1．5或小于0．66。进行信号归一化校正的
点为LUC及看家基因。
3 结果
3．1 四物汤化学成分组合对HFCL细胞增殖活力
的促进作用：1、2、4、8、16、32、64、128t-g／mL四物
汤化学成分组合显著地增强HFCL细胞的增殖活
力，见表1。
3．2 四物汤化学成分组合对HFCL细胞周期的影
响：与空白组相比，四物汤组处于G。／G，期的细胞明
显减少，PI则明显大于空白组；四物汤化学成分组
合组处于G。／G。期的细胞显著少于空白组，PI则显
著大于空白组，表明四物汤及其化学成分组合都有
助于细胞通过阻滞点，促进增殖。同时，四物汤与其
化学成分组合相比差异不显著，见表2。
3．3 四物汤化学成分组合对HFCL细胞表达谱的
影响：图1为基因表达谱差异分析的散点图，y轴代
表1 四物汤化学成分组合对HFCL细胞增殖活力
的促进作用(i±j，席一8)
Table1 StimulativeeffectofCCSWDonproliferation
potencyofHFCLcells(；±s，聆一8)
与对照组比较：一P<0．01⋯P<0．001
。。P表2 四物汤化学成分组合对HFCL细胞周期
的影响(j±S，n一6)
Table2 EffectofCCSWDonHFCLcell
cycle(x±S，n一6)
细胞周期／％组别——PI／％
Go／Gl G2／M S
与对照组比较：‘P<0．05’”P<0．0I
。P<0．05”’P<0．01U5controlgroup
釜
×
旨
卑8
蠢
鼋
兰
罱0
乏
已
×10
按
∞
￡5
曷
茎
昌0
A一四物汤组B一四物汤化学成分组合组
A—-SWDgroupB—-CCSWDgroup
图1基因表达谱分析散点图(看家基因
及阳性对照LUC校正)
Fig．1Scatterplotsofgeneexpressionprofile
(normalizedbyhouse—keepinggenesand
positivecontrolLUC)
表药物处理组荧光强度，x轴代表对照组荧光强
度。图中对角线上及其附近的点代表无差异表达的
基因，左上方远离对角线的点代表表达上调的基因，
右下方远离对角线的点代表表达下调的基因。图中
实心点代表无差异表达基因。
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第3期2005年3月·389·
经分析比较发现，四物汤组差异表达的基因共
有10个，四物汤化学成分组合差异表达的基因共
有3个。具体分析结果见表3和表4。
表3 四物汤作用12h后HFCL细胞差异表达基因
Table3 Differentexpressionofge esinHFCL
cellstreatedbySWDfor12h
表4四物汤化学成分组合作用12h后
HFCL细胞差异表达基因
Table4 Differentexpressionofge esinHFCL
cellstreatedbyCCSWDfor12h
4讨论
骨髓成纤维样基质细胞是造血微环境的主要成
分，约占骨髓基质细胞的60％～70％，通过分泌细
胞因子及细胞间的相互接触参与调节造血干细胞的
增殖与分化[10|，对正常造血具有调控作用。
本研究发现四物汤化学成分组合0．25～128
tzg／mL可增强骨髓成纤维样基质细胞HFCL增殖
活力，且在8tlg／mL以下组增强作用呈浓度依赖关
系，大于8弘g／mL组随药物浓度增加，增强作用反
而减弱，这可能与化学成分组合浓度加大改变了
HFCL培养环境有关。四物汤化学成分组合作用于
HFCL12h后，相对于空白组G。／G，期细胞显著减
少，与四物汤相似，说明二者加强了HFCL细胞
DNA合成，加快了细胞分裂、增殖速度，这一作用
与四物汤可促进小鼠骨髓细胞由G，期进入S期的
作用相吻合[11|。四物汤化学成分组合对细胞增殖活
力的影响远大于对流式细胞术实验中PI的影响，
说明其促HFCL增殖外，主要是促进HFCL的能量
代谢。
四物汤化学成分组合组有3个表达上调的基
因。其中IL一2受体是异多聚体糖蛋白，由a、B、73
条链组成，a链(又称CD25)是IL一2特异的，IL一2
与IL一2受体结合后，传递信号，引起细胞的增殖反
应。NF—xB是一种重要的转录因子，对细胞因子诱
导的基因表达起关键性调控作用，在T细胞激活作
用过程中也起重要作用，还能够抑制肿瘤坏死因子
(TNF—a)诱导的细胞凋亡。TPO增强祖细胞DNA
合成和增加细胞多倍体倍数，刺激巨核细胞合成蛋
白质，增加巨核细胞总数，进而增加血小板生成。这
3者的作用可能与四物汤促进骨髓造血于祖细胞的
增殖，抑制骨髓造血干祖细胞的凋亡作用相关。
四物汤及其化学成分组合作用于HFCL细胞
12h后，化学成分组合表达上调的基因只有3个，
少于四物汤的10个，说明四物汤由于含有更多的
成分，作用的范围更广范。而且化学成分组合来源于
四物汤，所以该组表达上调的3个基因在四物汤组
也是表达上调的，表明四物汤作用机制与其特定的
物质基础存在一定的对应关系，因此可以应用基因
芯片技术研究复方中药作用机制与其化学成分的关
系或用于初步筛选、确定复方中药的有效成分。
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作者： 李鹰飞， 佟丽， 梁乾德， 王升启， LI Ying-fei， TONG Li， LIANG Qian-de， WANG
Sheng-qi
作者单位： 军事医学科学院放射医学研究所,北京,100850
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(3)
被引用次数： 6次

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6.高月.马增春.梁乾德.刘明.王宇光.谭洪玲.肖成荣.张伯礼 四物汤的方证结合研究[期刊论文]-世界科学技术-中
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