全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月·531·
3．57mg，置1mL量瓶中，加至刻度，摇匀，即得。
2．3供试品溶液的制备：取克心疼缓释片，研细，精
密称定1．012g，用50mL甲醇回流提取2次，每次
20rain，挥干甲醇，用水饱合正丁醇溶解后，以0．26
mol／LNa。CO。溶液萃取完全，合并碱液，调pH2，
乙醚萃取，合并乙醚液，挥于乙醚，用甲醇转移至5
mL量瓶中，加至刻度，备用。
2．4标准曲线的制备：取阿魏酸对照品溶液50、
70、100、120、150FL，分别置5mL量瓶中，用甲醇
稀释并加至刻度，依次进样。以阿魏酸质量浓度为横
坐标，峰面积与迁移时间比值为纵坐标，进行回归，
得回归方程为Y一2．4819 X一3．7113，r一
0．9997，线性范围：35．7～107．1t-tg／mL。
2．5精密度试验：取71．4t-g／mL阿魏酸对照品溶
液，重复进样5次，测定峰面积，计算峰面积与迁移
时间的比值，计算得其RSD为0．46％。
2．6重现性试验：精密称取同一批样品5份，制备
供试品溶液，计算峰面积与迁移时间的比值，其
RSD为1．0％。
2．7稳定性试验：取供试品溶液，分别在0、2、4、6
h测定峰面积与迁移时间的比值，其RSD为1．5％。
表明供试品溶液在6h内稳定性较好。
2．8加样回收率试验：取含阿魏酸75．28mg／g的
克心疼缓释片样品5份，各约0．5g，各加入3．57
mg／mL阿魏酸对照品溶液2．0mL，制备供试品溶
液，测定回收率为98．4％，RSD为3．73％。
2．9样品测定：吸取供试品溶液10弘L进样，每批
取3份，测定峰面积与迁移时间的比值，按照标准曲
线法计算样品中阿魏酸的质量分数，结果见表1。
表1克心疼缓释片中阿魏酸的测定结果(忍一3)
Table1 DeterminationofferulicacidinKexinteng
Sustained—releaseTablet(万一3)
批号 阿魏酸／(mg·g_1)
3讨论
3．1缓冲液pH值的确定：阿魏酸的荷电性随pH
的不同而异，pH<7时，阿魏酸以中性分子存在。在
毛细管区带电泳模式下，中性组分之间难以分离，这
样当缓冲液pH<7时，阿魏酸会与样品中其他中性
组分同时出峰，使分离和定量困难。而当pH>7时，
阿魏酸以羧酸根阴离子存在，在中性组分之后出峰，
易于分离和定量。为使阿魏酸既能迅速出峰，又能与
其他峰分离完全，本实验选择缓冲液pH9．0。
3．2 同存成分的干扰：克心疼缓释片中含有延胡
索，其主要成分为总生物碱，为排除其影响，样品处
理采用甲醇提取后，挥干甲醇，用水饱合正丁醇溶解
后，Na。CO。碱液萃取的办法。实验表明，既不破坏
被测成分阿魏酸，又有效排除了同存成分的干扰。
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利用板蓝根水提醇沉物生产产朊假丝酵母
张丽霞，杜连祥，路福平
(天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室，天津300222)
摘 要：目的 以板蓝根的水提醇沉物为原料培养产朊假丝酵母。方法 将原料液化、糖化处理后，以此水解液为
发酵液进行液态发酵，并对该菌在水解液中的生长特性及发酵条件进行研究。结果 优化后的培养条件为：水解液
还原糖含量2．65％，温度28℃，pH值5．5～6．5，接种量9％，装液量100mL(5mL三角瓶)。在优化培养条件
下培养20h后，产朊假丝酵母的生长达到稳定期，其活菌数达到6．61×108／mL。经检测，干燥后的菌粉中靛玉红达
0．45ptg／g。结论以板蓝根水提醇沉物为原料生产产朊假丝酵母是可行的。
关键词：板蓝根；液态发酵；产朊假丝酵母；靛玉红
中图分类号：R282．15；R286．02文献标识码：B 文章编号：0253—2670(2005)04—0531—04
收稿日期：2004—07—14
∞全}∞∞∞∞加加∞
万方数据
·532· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月
LiquidfermentationofCandidautiliswithwaterxtracted。____——alcoholpre ipitated
wastesofRadixlsatidis
ZHANGLi—xia，DULian—xiang，LUFu—ping
(TianjinIndustrialMicrobiologyKeyLaboratory，InstituteofBioengineering，TianjinUniversity
ofScienceandTechnology，Tianjin300222，China)
Keywords：RadixIsatidis；liquidfermentation；Candidautilis(Henneb．)Lodd．etV．Rij；indirubin
板蓝根是传统的清热解毒良药，临床上广泛用
于治疗多种疾病如流感、腮腺炎、乙脑、肝炎等，是公
认的具有较好抗病毒效果的少数中药之一[1]。板蓝
根醇沉物是采用传统的水提醇沉工艺生产板蓝根颗
粒过程中产生的泥状沉淀物，其中含有大量的淀粉、
多糖及蛋白质等，是微生物可以利用的营养物质，同
时也残留一部分药效成分。板蓝根醇沉物一直作为
废料被扔掉，不仅污染环境，而且浪费资源。为了使
板蓝根资源得到更加充分合理的应用，本实验对板
蓝根醇沉药渣进行了分析，并对其采用液态发酵培
养产朊假丝酵母，以期为板蓝根的综合利用进行有
益的探索。
1仪器与试药
Biotronik3020高效液相色谱仪，WU一875紫
外检测器；往复式摇床、水浴摇床、血球计数板，产朊
假丝酵母(中国工业微生物菌种保藏中心)，斜面保
藏培养基(11。Be麦芽汁琼脂)，摇瓶种子培养基(1l。
Be麦芽汁)，板蓝根水提醇沉物(天津兴达中药材加
工厂)，耐高温a一淀粉酶(1×105U／mL)，糖化酶
(2×104U／mL)。靛玉红对照品(中国药品生物制品
检定所)。
2方法与结果
2．1靛玉红的HPLC法测定
2．1．1 色谱条件：色谱柱：SpherisorbC18柱(250
mm×4．6mm，10弘m)；流动相：甲醇一水(80：20)；
体积流量：1．0mL／min；柱温：室温；检测波长：292
nm；进样量：20肛L。
2．1．2 标准曲线的绘制：称取靛玉红对照品5．0
mg，加少量氯仿，加热溶解，定容至50mL。分别吸
取0．05、0．1、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0mL置5mL量
瓶中，用氯仿稀释至刻度，进样测定。以峰面积对质
量浓度进行回归，计算得回归方程为y一3．08X一
8．26，r一0．9924，表明靛玉红在2．0～16弘g／mL
与峰面积线性关系良好。
2．1．3供试品溶液的制备：称取干燥、粉碎的板蓝
根醇沉物及发酵后的菌粉各25g，加氯仿250mL，
回流提取6h，经微孑L过滤膜滤过，滤液浓缩并定容
至5mL，备用。
2．2板蓝根水提醇沉物的组成：取适量的板蓝根水
提醇沉物，采用苯酚一浓硫酸法[2]测定总糖，菲林试
剂法[33测定还原糖，微量凯氏定氮法[3]测定粗蛋白，
中性甲醛滴定法[33测定a一氨基氮，重量法[3]测定含
水量，HPLC法测定靛玉红。结果总糖、还原糖、粗蛋
白、a一氨基氮、水分、靛玉红的质量分数分别为
25．7％、8．5％、6．4％、0．3％、51％、2．53pg／g。可
见，醇沉物中除水分以外主要为多糖和粗蛋白，还原
糖的质量分数只有8．5％。药效成分靛玉红的质量
分数比较高。
2．3活菌数的测定：用血球计数法[4]测定。
2．4板蓝根醇沉物水解液的制备：称取一定量的醇
沉物，加水溶解，搅拌均匀，配制成25％水溶液。90
。C、pH6．5、加酶量10U／g、液化2h，60℃、pH
5．0、加酶量200U／g、糖化4h，得到含一定还原糖
的水解液。经测定水解液中还原糖的质量分数可达
17％，能够满足菌体生长的需要。
2．5菌种种子液的制备：取活化好的斜面菌种一环
接种于种子培养基中，装液量40mL／250mL三角
瓶，于28oC、150r／rain、培养16～18h。在种子培养
过程中每隔2h取样1次，做出菌株的生长曲线，见
图l。可见，菌种在种子培养基中生长4h后进入对
数生长期，18h后便进入稳定期。镜检发现菌体细
胞呈假丝状，生长旺盛，出芽率高。此时种子液中活
菌数达1×108／mL，因此确定培养18h的种子为最
佳接种龄。
2．6发酵方法：将培养至含活菌数为1×108／mL、
出芽率大于20％、死亡率不超过1％、处于对数生长
末期的种子培养液以一定的接种量接种于醇沉物水
解液中，在一定的温度及转速下振荡培养24h，测定
其中的活菌数。
2．6．1水解液中还原糖对菌体生长的影响：将醇沉
物水解液配制成体积分数分别为7．5％、15％、
22．5％、30Voo，进行培养，测定发酵液中的活菌数，结
果活菌数分别为3．68×108、5．34×108、5．12×108、
4．87×108／mL。可以看出，当水解液体积分数为
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月·533·
1一活西数2-pH值
1一cellnumber2一pHvalue
图1产朊假丝酵母种子生长曲线
Fig．1GrowthcurveofC．utilisseed
15％时，发酵液中活菌数最高，此时发酵液中还原糖
质量分数为2．65％。继续增加水解液体积分数不利
于菌体生长。这一现象符合克雷布特效应[5](the
Crebtreeeffect)，即在有氧条件下，较高质量分数的
糖抑制酵母菌的呼吸作用，当葡萄糖质量分数大于
5％时，就会使酵母菌细胞中的呼吸酶合成和线粒体
形成受到抑制，酵母生长速率明显下降。
2．6．2培养温度对菌体生长的影响：温度的高低与
发酵中的酶反应速率、氧在培养液中的溶解度和传
递速率等密切相关，从而影响菌体生长和产物合成。
在水解液中，改变培养温度，使其分别在22、25、28、
31、34℃下培养，测得活菌数分别为4．52×108、
5．33×108、5．64×108、5．26×108、4．91×108／mL。
该菌的最佳生长温度为25～28℃。
2．6．3初始pH值对菌体生长的影响：在水解液
中，将初始pH值分别调至4．5、5．0、5．5、6．0、6．5，
接种进行培养，测得活菌数分别为4．21×108、4．83
×108、5．62×108、5．54×108、5．67×108／mL。可见，
当培养基的初始pH值为5．5～6．5时，发酵液中活
菌数最高。
2．6．4不同接种量对菌体生长的影响：在水解液
中，改变摇瓶接种量，使接种量分别为3％、6％、
9％、12％、15％，测定发醇液中的活菌数，分别为
3．76×108、5．21×108、6．17×108、6．11×108、
5．89×108／mL，结果表明当接种量为9％时，发酵液
中的活菌数最高。
2．6．5装液量对菌体生长的影响：溶解氧是需氧菌
发酵的必备条件，摇瓶装液量直接影响氧的传递。在
优化培养基中改变装液量，使装液量分别为50、75、
100、125、150mL，进行接种培养，测得活菌数分别
为4．36x108、5．61×108、5．78x108、5．23×108、
3．74×108／mL。当装液量为100mL时，发酵液中的
活菌数最高。
2．7在优化培养条件下菌种的发酵动力学曲线：以
15％醇沉物水解液为发酵培养基、接种量为9％、初
始pH6．0、装液量100mL、28℃下培养，每隔2h
测定发酵液中的相关参数，绘制发酵动力学曲线，见
图2。产朊假丝酵母在优化的培养条件下，6h进入
对数生长期。随着菌体的大量繁殖，发酵液pH值迅
速下降，还原糖和总糖不断减少，而蛋白的量逐渐增
加。在20h左右进入稳定期，还原糖几乎被耗尽，发
酵液pH值有所上升，此时测得其平均活菌数为
6．61×108／mL，蛋白的质量浓度为0．838g／lOOmL
发醇液。
辛、。姿
色S2莶
星萋釜囊
＼吲跚“
辐 梨
}匾
怕
1一活菌数2一还原糖3一粗蛋白4总糖5pH值
1-cellnumber2 educedsugar3-crudeprotein
4-totalsugar5-pHvalue
图2产朊假丝酵母在优化培养条件下的发酵动力学曲线
Fig．2FermentationkineticcurvesofC．utilis
underoptimalconditions
2．8产品成分分析：将发酵液离心，取沉淀摊平于
3 ℃下鼓风干燥制成菌粉。发酵前后每100mL发
酵液中的干物质及各成分的比例见表1。可见，发酵
后的产品中蛋白质比原料提高105％，总糖在发酵
过程中由于菌体生长而大部分被消耗掉，质量分数
有所降低。产品中药效成分靛玉红损失较为严重，可
能是原料水解及发酵液灭菌过程受热所致。发酵得
率为42．6g菌粉／100g原料干基。
表1产品成分分析
Table1 Productingredientanalysis
项目干重／g粗蛋白／％总糖／％不溶物／％靛玉红／(pg·g-1)
发酵前7．35 13．1 52．4 32．8 2．53
茎登星!：!! !!：! !!：! !!：! !：!1
3讨论
板蓝根醇沉物为板蓝根颗粒水煎醇沉制备工艺
中的遗弃物，其质量与板蓝根颗粒剂前浸膏相当。板
蓝根木质部的薄壁细胞中含有大量的淀粉粒，煮沸
提取过程中树脂状物、植物蛋白和淀粉粒大量溶出，
并进一步糊化。醇沉时，由于大量沉淀物的吸附和包
3
2
1
0
一。一Ⅲ．色一×一＼簌坦烬
万方数据
·534· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月
裹作用，使得醇沉物中留有较大量的靛玉红[6]。研究
结果表明，板蓝根醇沉物具有明显的清热解毒作用，
并对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的生长均有明显
的抑制作用，其作用强度与同剂量板蓝根颗粒剂前
浸膏相当[7]。板蓝根醇沉物中靛玉红的量明显高于
板蓝根颗粒剂前浸膏，说明板蓝根醇沉物中含有一
定的药理活性物质。
对原料及成品的主要成分进行比较可以看出，
产品的含氮量明显高于原料。作为饲料添加剂，既含
有大量的蛋白质，菌体中又富含维生素、多种酶及辅
助因子等成分，可为动物生长提供丰富的营养。同
时，醇沉物经过发酵后有效成分靛玉红的质量分数
仍然高达0．45btg／g，残留的靛玉红也可发挥清热
解毒的作用。
醇沉物中的糖分以多糖为主，而多数微生物只
能以小分子的单糖、双糖作为碳源，因此需要对其中
的多糖进行水解，成为可发酵性糖。多糖水解分为酶
水解和酸水解两种，考虑到酸水解条件比较剧烈，温
度高，时间长，所需pH值在1．5～1．8，水解结束后
调节pH值会带入较多的金属离子，不利于菌体的
生长，因此选择条件较温和的双酶法进行水解。
高质量浓度的还原糖对酵母菌生长具有抑制作
用，应当将发酵液初始还原糖质量浓度控制在5％
以下。在对数生长后期，随着菌体的大量繁殖，发酵
液中还原糖等营养物质被耗尽，有害代谢产物不断
积累，使得菌体的生长速率下降。为了提高培养液中
的菌体数，可在对数生长后期，采用分批补料或流加
补料的方式，向发酵液中补加还原糖，以延长菌体的
对数生长期，从而获得高密度培养液。
我国是中草药种植、生产加工和消费的大国，近
年来随着对中药资源开发力度的不断加大，中药材
加工产生的废弃物也越来越多。这些药渣中的绝大
多数均作为废料被扔掉或烧毁，这其中有尚未提取
完全的有效成分及未开发的新用途。本研究中探讨
了利用板蓝根醇沉物培养益生菌的方法，不仅有效
解决了污染问题，并且使原料资源得到了更充分合
理有效的利用，提高了产品的附加值，同时为采用相
似工艺进行生产的其他中药的综合利用提供参考。
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桑叶中多糖提取分离工艺的研究
张琳华，高瑞昶，许明丽
(天津大学化工学院，天津300072)
摘要：目的优选桑叶多糖提取分离最佳工艺。方法 比较稀酸、稀碱、蒸馏水3种提取方法，采用L。(34)正交试
验，对影响多糖的水提取工艺和醇沉分离工艺的因素水平进行了研究，并比较了不同蛋白去除法对多糖提取分离
的影响。结果 桑叶多糖的最佳提取工艺为用10倍量蒸馏水在70℃下提取2次，每次1．5h。醇沉分离最佳工艺
为醇沉时乙醇体积分数80％，药液浓缩至1mL药液儋生药，pH值为4。用三氯乙酸(TCA)法去除蛋白质的效果
优于传统的Savage法。结论优选的桑叶多糖提取分离工艺稳定可行。
关键词：桑叶；多糖；提取分离；正交试验
中图分类号：R284．2 文献标识码：B 文章编号：0253—2670(2005)04—0534—04
收稿日期：2004—07—02
作者简介：张琳华(1976一)，女，上海人，1999年毕业于四川大学食品科学与工程系，现为天津大学化工学院制药工程专业2002级在读
硕士，研究方向为药用天然产物的研发。Tel：(022)27457016E—mail：elley2001@sina．corn．cu
万方数据
利用板蓝根水提醇沉物生产产朊假丝酵母
作者： 张丽霞， 杜连祥， 路福平， ZHANG Li-xia， DU Lian-xiang， LU Fu-ping
作者单位： 天津科技大学生物工程学院,天津市工业微生物重点实验室,天津,300222
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(4)
被引用次数： 4次

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3.蔡薇薇.王友群.刘根源.李华武 治疗糖尿病中药复方有效部位的研究[期刊论文]-食品与药品 2010(6)
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