全 文 ：·1790· 中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
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灰色链霉菌对8个植物C2，甾体的生物转化
范黎明1’2，沈月毛¨
(1．中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，云南昆明 650204；
2．云南农业大学植物保护学院，云南昆明 650201)
摘 要：目的 研究灰色链霉菌对8个C：。甾体的生物转化作用。方法通过灰色链霉菌在YS培养基中发酵，对
C：。甾体进行转化。结果告达亭(I)和乙酰基告达亭(V)的C一12位ikematic酯基发生羟基化，产生一个相同的新
化合物4’一羟基告达亭(Ia)。而两个乙酰化的衍生物包括乙酰基告达亭(V)和二乙酰基青阳参苷元(VI)发生去乙
酰化。青阳参苷元(I)、青阳参苷甲(I)、青阳参苷乙(Ⅳ)、去乙酰基萝蓐苷元(Ⅶ)和3一乙酰基去乙酰基萝蘑苷元
(Ⅶ)没有检测到明显的转化。结论灰色链霉菌降低了所饲喂C。，甾体的亲脂性而不是形成色霉素或c：。甾体皂苷
所具有的脱氧糖侧链。
关键词：生物转化；C。。甾体；灰色链霉菌；羟基化；4’一羟基告达亭
中图分类号：R284．18 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)12—1790一03
C。。甾体皂苷是萝蘼科植物的特征性成分，在青
阳参CynanchumotophyrllumSchneid．中也有大量
发现。青阳参是萝蘑科鹅绒藤属植物，广布于我国西
南地区，云南民间用其根做滋补强壮药，治疗小儿惊
风症和风湿关节痛。化学成分研究表明，其根含有较
高量的c2。甾体皂苷[1~3]，其中青阳参苷甲(otophyl—
losideA)和青阳参苷乙(otophyllosideB)显示抗癫
痫活性，可以保护小鼠免于听源性痉挛(audiogenie
seizures)发作，ED50值为10．20mg／kg[3]。
链霉菌属(Streptomyces)放线菌同高等植物有
密切关系，也是研究最多的微生物，其中灰色链霉菌
Streptomycesgriseus的许多基因已经被克隆并分
析[4’5]，包括许多次生代谢产物生物合成途径的基因
簇。在灰色链霉菌所产生的次生代谢产物中，色霉素
及其衍生物例如色霉素A。[6’7]，在结构上含有脱氧
糖链，这一点同青阳参中发现的C：。甾体皂苷[31相类
似。这表明，灰色链霉菌的脱氧糖转移酶可能具有与
植物青阳参中相应酶类似的功能。因此，本实验使用
灰色链霉菌对一些来自青阳参的C。，甾体及其衍生
物进行了生物转化研究，以探讨灰色链霉菌的脱氧
糖转移酶是否能够对植物成分起作用。
1材料与方法
1．1仪器与材料：旋光用。lascoDIP一370数码旋
光仪测定，红外光谱用BrukerTensor27型红外光
谱仪测定，KBr压片。核磁共振谱用BrukerAM一
400型核磁共振仪测定，以TMS为内标。质谱用
VGAutospec一3000型质谱仪测定。薄层色谱硅胶
和柱色谱硅胶(200---300目)均为中国青岛海洋化
工集团产品。
1．2底物的准备：青阳参植物材料粉碎的根以醋酸
乙酯提取，提取物进一步用石油醚提取得到石油醚
不溶的粗苷部分。取部分粗苷，以1％硫酸一甲醇回
流水解。反应体系以5％氢氧化钠水溶液中和之后，
减压除去甲醇，残液以氯仿提取。氯仿液经无水硫酸
钠干燥，浓缩得到的提取物用硅胶柱色谱，依次用氯
仿一甲醇(50：1、20：1)洗脱，分别得到化合物告达
亭(I)和青阳参苷元(Ⅱ)。另一部分粗苷依次以四
氯化碳一醋酸乙酯(95：5、85：15)提取，提取物分别
以硅胶柱色谱，氯仿一甲醇(99：1)洗脱，得化合物Ⅲ
和fv。
化合物I在10％氢氧化钾一甲醇溶液中回流加
热30h，得去乙酰基萝蘼苷元(Ⅶ)。
收稿日期：2008—04—26
基金项目：云南省自然科学基金项目(30070007)
作者简介：范黎明(1976一)，男，河南人，博士研究生，主要从事天然产物的分离研究。E—mail：fanlimin91976@gmail．COrn
*通讯作者沈月毛Tel；(0871)5223111Fax：(0871)5150227E—mail：yshen@mail．kib．ac．cn
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月·1791·
化合物l、Ⅱ、Ⅶ分别溶于吡啶，室温下与醋酸
酐反应过夜，进行乙酰化。粗产物通过进一步的硅胶
柱色谱，得到化合物V、Ⅵ和Ⅶ。
化合物I、Ⅱ、Ⅲ和N通过与对照品的TLC对
比而鉴定。
化合物V：白色固体，EI—MS聊屈：532EM+]
(1)，489(28)(M+一COCH3)，404(3)[M+一
(CH。)2CH(CH3)C=CHCOOH]，361(34)(404一
COCH3)。
化合物Ⅵ：白色固体，El—MSm／z：566(1)
(M+一H20)，541(6)(M+一COCH3)，524(9)，506
(2)，481(4)，445(3)，404(2)，36l(26)，343(12)，301
(35)，283(50)，180(12)，163(55)，121(100)。
化合物Ⅶ：白色固体，EI—MSm屈：380EM+]，
337(80)(M+一COCH。)，319(100)，30l(68)，
283(66)。
化合物Ⅷ：白色固体，EI—MSm／z：422[M+]，
404(4)(M+一H20)，387(3)(404一H20)，379(62)
(422一C()CH3)，36l(73)，343(32)，319(25)，301
(72)，283(100)。
1．3生物转化实验：灰色链霉菌单菌落菌种接种在
固体培养基平板上，所用培养基为YS培养基：酵母
提取物3g，可溶性淀粉IOg，琼脂10g，蒸馏水
1 000mL，pH值7．2；28。C置培养l周。
菌种活化采用液体活化法，挑取单菌落接种于
液体YS培养基，28C，180r／min振荡培养72h
后，转接于新鲜YS液体培养基(1000mL的三角
瓶中装入100mL液体培养基)，接种量2％，同条件
培养48h再饲喂底物；底物溶解于乙醇或醋酸乙
酯，饲喂量为i0mg底物／loomI。培养液，继续培
养72h后，停止发酵，发酵液在20C下以7000r／
min离心30min，分离上清液和菌丝体。上清液经过
减压浓缩，以醋酸乙酯萃取3次，无水硫酸钠干燥，
回收溶剂得到粗提物，通过TI。C检测生物转化情
况，进一步通过反相硅胶柱色谱(丙酮一水梯度洗
脱)、硅胶柱色谱(氯仿一甲醇梯度洗脱)和葡聚糖凝
胶柱SephadexLH一20(甲醇洗脱)色谱分离，得到转
化产物。
化合物47一羟基告达亭(Ia)：白色粉末，EQ3／to
(f0．4，CHCl3)，IR‰KB。r(cm一1)：3444，2975，2933，
1 709，1642，1466，1386；EI—MSm／z：506EM+-I
(2)，488(3)(M+一H20)，463(27)(M+一COCH3)，
445(68)，427(4)，405(2)，362(23)，344(24)，319
(60)，301(59)，283(57)．144(10)。127(100)，1ll
(62)；HR—El—MS朋屈506．2873(C28H4208，计算值
506．288O)；1H—NMR和13C—NMR数据(400Hz，
C。D。N—d。)见表1。
表I化合物Ia的NMR数据
TableNMRDataforcompoundI a
2结果与讨论
在实验中，以灰色链霉菌为生物反应器，对告达
亭[2](caudatin，I)、青阳参苷元[2](qingyang—
shengenin，Ⅱ)及两者的乙酰化产物乙酰基告达亭
(V)和二乙酰基青阳参苷元(VI)、去乙酰基萝蘑苷
元(deacetylrnetaplexigenin，Ⅶ)、3一乙酰基去乙酰基
萝蓐苷元(3-acetyldeacetylmetaplexigenin，Ⅷ)和青
阳参苷甲【31(otophyllosidesA，11I)、青阳参苷乙L3j
(otophyllosidesB，Ⅳ)这样8个植物C21甾体进行了
生物转化。化合物I和V的主要转化产物是Ia(26
mg和3mg，得率分别是13％和3％)。化合物VI被
去乙酰化，得到化合物Ⅱ。化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ和Ⅷ
与空白对照相比，没有观察到生物转化发生。没有转
化的底物通过TLC与原有底物相对比而确定。
高分辨质谱确定化合物Ia的分子式为
C。。H。。o。。包括2D—NMR在内的波谱数据表明化合
万方数据
·1792· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
物Ia是化合物I[2]的47位羟基化产物。化合物Ia
的13C—NMR谱显示28个信号峰，其中大多数与化合
物I的信号相似。1H—NMR谱中的单峰信号艿1．49／
1．50(H一5’，H一6’)和艿2．43／2．49(H一77)与碳信号艿
73．3s有远程相关，表明羟基化出现在侧链的C一47
位置。27位质子信号艿6．72与4’位碳信号艿73．3的
远程相关也证明了这一点。所以，化合物Ia被鉴定
为47一羟基告达亭(47一hydroxycaudatin)，见图1。而
1H—NMR谱中的质子信号艿2．43／2．49(&15．7，C一
77)，1．49／1．50(3c29．0／29．1，C一57，C一67)成对出
现，表明Ia是47位差向异构体。
H
h⋯弘。。蚴R3=H靴R4=肭舭和Ⅳ
IIR1：HR2。№州 无转化m，。撇
R2=HO《×
№：§刈§-0、黟0ⅣR1=l§刈rN拶o‰H3 6cH3 6c№
曰屹2、、氐人
V即知心；姒
VIRI=赶R2御以
ⅦRI=R2-H
VIIRI一^cR2，H
无转化
无转化
无转化
-。。。：。～。枞和枞
IIR3=”R4-Ho以
无转化
无转化
图1化合物I～Ⅷ及Ia的生物转化与结构
Fig．1／Structuresandbiotransformation
ofcompoundsI——VJandI a
实验显示灰色链霉菌对C。。甾体的骨架不敏感，
但是化合物I和V的C一12位ikemaic酯基都被羟
基化，而12位侧链基团是对羟基苯甲酸的化合物Ⅱ
则没有发生转化，这表明12位侧链基团的ikemaic
酯基很可能是一个活性中心，它的存在可能使化合
物I和V对灰色链霉菌产生某种毒性或抑制作用。
实验中观察到的另外一个有趣现象是所有饲喂
的乙酰化C。，甾体底物都被灰色链霉菌除去了乙酰
基，这表明灰色链霉菌对这些化合物的“解毒”机制
可能是通过降低其脂溶性来阻止它们通过灰色链霉
菌的细胞膜。这一点同告达亭侧链的羟基化是一致
的。此外。所有的转化产物以及没有转化的底物都存
在于培养液中而不是从菌体中提取得到，这意味着
底物可能并没有进入细胞内，灰色链霉菌对底物告
达亭C一12位侧链的羟基化可能是由胞外的细胞色
素P一450酶系来催化的。众所周知，细胞色素P一450
酶系是一类功能多样的血红素蛋白，广泛分布于动
物、植物和微生物，负责催化与调控多种内源物质的
代谢与转化或外源化合物的活化与降解[8]。微生物
中的许多外来化合物生物转化通常都是被细胞色素
P一450酶系催化的，这已经被许多报道证实凹d0。。
致谢：2D一、1D—NMR和HREIMS数据分别由
中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资
源持续利用国家重点实验室王德祖研究员、何以能
先生和梁惠玲女士测定。
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万方数据
灰色链霉菌对8个植物C21甾体的生物转化
作者： 范黎明， 沈月毛
作者单位： 范黎明(中国科学院昆明植物研究所,植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室,云
南,昆明,650204;云南农业大学植物保护学院,云南,昆明,650201)， 沈月毛(中国科学院昆
明植物研究所,植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室,云南,昆明,650204)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(12)
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