全 文 ：中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第7期2007年7月
龟板醇提物对大鼠骨髓间充质干细胞氧化损伤的修复
及其抗脂质过氧化作用
李熙灿1，谢学明¨。，黄春花H。，钟远声H+，李伊为2，周健洪2，陈东风2+
(1．广州中医药大学中药学院，广东广州 510405；2．广州中医药大学基础医学院，广东广州510405)
摘 要：目的 研究龟板95％乙醇提取物(醇提物)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)氧化损伤修复及其抗脂质
过氧化作用。方法使用密度梯度法分离大鼠MSC进行培养，经CD44鉴定后以H。0。作用于MSC3h，建立
MSC氧化损伤模型，通过MTT法检测不同质量浓度龟板醇提物(o．166、0．833、1．66、3．32、4．98mg／mL)对
MSC损伤的修复。50只SD大鼠，随机分为5组，受试组分别ig0．01、0．03、0．09g／(kg·d)龟板醇提物；阳性对照
组ig维生素E200mg／(kg·d)；对照组ig等量的蒸馏水。每天1次，共7d，分别用TBA比色法、亚硝酸盐法测定
大鼠肝中丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果与H。0：(1：10)损伤组比较，龟板醇提物各
组具有显著性差异(P<0．01、0．05)；与对照组比较，龟板醇提物低、中、高剂量组MDA水平均明显降低(P<
0．01)，同时能明显提高SOD活力(P同时，具有抗脂质过氧化作用。
关键词：龟板醇提物；Hzoz；骨髓间充质干细胞(MSC)；脂质过氧化
中圈分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)07—1043—04
Repairingofoxidativedamagetomesenchymalstemcellinratsandanti-
lipidperoxidationbyPlastrumTestudinisethanolicextract
LIXi—canl，XIEXue—min91，HUANGChun—hual，ZHONGYuan—shen91，
LIYi—wei2，ZHOUJian—hon92，CHENDong-fen92
(1．CollegeofChineseMateriaMedica，GuangzhouU iversityofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510405，China；
2．CollegeofBasicMedicine，GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510405，China)
Abstract：ObjectiveTostudyth ffectof950AethanolicextractofPlastrumTestudinis(EEPT)on
repairingoftheoxidativedamagetomesenchymalstemee l(MSC)anditsanti—lipidperoxidation．Methods
MSCswereisolatedfromratsbydensitygradienta dcultured，thenidentifiedbvCD44．Themodelof
MSCsoxidativedamagewascreatedbyusinghydrogenperoxide(H202)for3h．Theeffectonrepairingof
theoxidativedamagetoMSCwasdeterminedbyMTTmethodandthextract
7
S onentrationvariedat
0．166，0．833，1．66，3．32，and4 98mg／mL．SDrats(50)wererandomlydividedintofivegroupsin
average．Theextractgroupsweregivenbyiginthreedoses(O．01，0．03，and0．09g／(kg·d)ofEEPT；
VitE(200mg／(kg·d)3wasgivenbyigtothepositivecontrolgroup；Distilledwater(200mg／(kg·d)]
wasgivenbyigtothecontrolgroup．Thedrugwasgivenonceadayandlastedfor7d．Then，thelev lof
MDAandthevitalityofSODinliverofratswasmeasuredbyTBAmethodandnitroussaltmethod．
ResultsTherew redistinctdifferencebetweenH202damageroup(1：10)andEEPTgroupsin
promotingopticdensityofMSC(尸<0．01，0．05)．Comparedwiththecontr01group，thelevelofMDAof
thextractgroupswasrather10wer(P0．05)．ConclusionEEPTcanbeusedtorepairtheoxidativedamagetoMSCfromratsremarkablyand
reducethelipidperoxidation．
Keywords：the95％ethanolicextractofPlastrumTestudinis(EEPT)；H202；mesenchymalstemcell
(MSC)；lipidperoxidation
收稿日期：2007—02—08
基金项目：国家自然科学基金项目(30271377，30371837，30472272)I广东省自然科学基金项目(31483)
作者简介：李熙灿(1970一)，男，湖南省桂阳县人，硕士，副教授，主要从事中药提取物的研究。
Tel：(020)39358076E—mail：lixican@126．eom
*通讯作者 陈东风Tel：(020)36585448E—mail：CDF27212@21cn．com
**广州中医药大学中药学院2003级本科生
万方数据
·1044· 中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第7期2007年7月
Prockop[11于1997年报道了骨髓间充质干细胞
(mesenchymalstemce l，MSC)可以分化为神经细
胞以来，MSC移植可能是未来帕金森病等神经退行
性病变治疗的一个方向[2’3]。但是，由氧化而导致的自
由基损伤可能是影响干细胞移植效果的一个重要因
素。因此，研究修复MSC的氧化损伤具有重要意义。
龟板PlastrumTestudinis为龟科动物乌龟
Chinemysreeresii(Gray)的腹甲，临床常作益肾药
使用，其味甘、咸，性寒，归肝、肾、心经，可以滋阴潜
阳、益肾强骨、养血补心。前期研究表明，龟板对脑缺
血后神经保护作用的机制与其下调脑缺血所致的一
氧化氮合酶nNOS和iNOS的异常表达有关[4]，同
时，龟板能促进神经干细胞(NSC)和MSC增
殖[5’6]，还可影响帕金森病大鼠行为和脑内多巴胺水
平，对大鼠帕金森病具有潜在的临床应用价值口]。研
究表明[8]，龟板的最强体外抗氧化活性部分分布在
95％乙醇提取物(以下简称醇提物)中。本实验以
H。O。诱导MSC损伤，进一步观察龟板醇提物对大鼠
MSC氧化损伤的修复作用，同时，观察了龟板醇提物
对大鼠肝组织中MDA水平和SOD活性的影响。
1材料与方法
1．1 仪器与试剂：高效液相仪DIONEXsummit
P680(PDA一100PhotodiodeArryD lector)；色谱
柱为DikmaDiamonsilC18(250mm×4．6mm，5
／zm)；紫外一可见分光光度计(755B，上海精密科学
仪器有限公司)；低糖DMEM(L—DMEM)、Percoll
和胎牛血清(FBS)为Gibcol公司产品，抗体兔抗
CD34、CD44、CD45、生物素化二抗(羊抗兔)、
SABC、DAB染色试剂盒均购自武汉博士德公司。
MTT为Sigma公司产品。MDA测试盒和SOD测
试盒均购于南京建成生物工程研究所；维生素E胶
囊(广州敬修堂药业)。其他试剂均为分析纯。
1．2龟板醇提物制备：药材龟板购于汕头药材采购
站，产地海南，经广州中医药大学中药学院鉴定教研
室张丹雁教授鉴定为龟科动物乌龟Chinemys
reeresii(Gray)腹甲。将龟板敲成小块，置电热恒温
干燥箱中(60±0．2)℃烘12h，再进行粉碎，过20
目筛得所需细粉，备用。40g龟板细粉放入索氏提
取器内，经过预处理后，用250mL95％乙醇提取
12h，抽滤，将滤液减压浓缩后，挥干至恒重，无溶剂
残留，得龟板醇提物(含脂肪71．3％、无机盐
6．7％)。用HPLC检测[甲醇一乙腈一水(30：30：
40)，1．000mL／min，254nm]，结果见图1。
1．3 MTT法检测龟板醇提物对MSC的损伤修复
1 2 3 4 5 6 7 8 9 J0
t min
图1龟板醇提物的HPLC结果
Fig．1HPLCResultofPlastrumTestudinis
ethanolicextract
作用
1．3．1MSC分离、培养与鉴定：清洁级SD大鼠10
只，220250g，雌性，由广东省实验动物中心提供
(粤检证字2005A010号)。将大鼠骨髓用L—DMEM
冲出，充分混匀，转入离心管，300×g离心10rain，
去上清，D—Hanks液重悬，离心去上清后，加4mL
D—Hanks液混匀。Percoll贮存液按0．56：0．44混
合，取4mL放入10mL离心管内，吸骨髓液在离
液面2cm处贴管壁缓缓加入。900×g离心
30min，收集单核细胞层，用DMEM洗涤两次。然
后计数细胞，调整密度，按1×106em2密度接种，
37℃、5％饱和湿度的CO。孵箱培养，培养液为含
10％FBS的L—DMEM，3d后更换培养液，弃去未
贴壁细胞，2～3d换液1次，接近融合的MSC用含
0．25％胰酶室温消化2～3min，按1×104／cm2传
代，传至第3代得到1×107／cm2个细胞。将部分
MSC接种至含盖玻片的24孔培养板内，滴加含
10％胎牛血清的DMEM培养液，2h后细胞处于
贴壁未分化状态，取出盖玻片做Brdu、CD44免疫组
化及两者结合的免疫组化双重染色。
1．3．2H。0。损伤MSC模型[9]：传3代的MSC分
为对照组、H：O。损伤组(10％)和龟板醇提物组。对
照组加入含10％胎牛血清的DMEM培养液；H20。
损伤组在含10％胎牛血清的DMEM培养液中加
H。O。损伤；龟板醇提物组MSC经HzO：损伤3h
后，换含不同质量浓度(o．166、0．833、1．66、3．32、
4．98mg／mL)龟板醇提物培养液。作用24h后各组
分别以MTT法检测。
1．3．3MTT法测细胞活性：制备单细胞悬液，计
数，调整细胞浓度为1×105／mL，接种于96孔板，
每孑L200弘L。每孑L力Ⅱ入MTT(5mg／mL)20弘L，
37℃孵育4h，弃上清。每孔加入二甲基亚砜150
弘L，振摇10rain，于490nm波长测吸光度(A)值。
1．4大鼠肝组织脂质过氧化检测
1．4．1动物分组与给药：清洁级SD大鼠50只，
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第7期2007年7月·1045·
220～250g，雌性，由广东省实验动物中心提供(粤
检证字2005A010号)。大鼠随机分为受试组、阳性
对照组和对照组。受试组大鼠用量按成人(60kg)30
g／d折算成龟板醇提物约为0．01g／(kg·d)，以其
1、3、9倍设低、中、高[o．01、0．03、0．09g／(kg·d)]
剂量，以丙二醇为溶剂，10mL／kgig给药；阳性对
照组：维生素E胶囊200rag／(kg·d)，以丙二醇为
溶剂，10mL／kgig给药；对照组给予等体积的蒸馏
水，持续给药1周。
1．4．2大鼠肝组织中脂质过氧化降解产物MDA
水平、SOD活性的测定：用TBA比色法口叩测
MDA。取10％组织匀浆0．1mL，按测试盒操作法
加入试剂，反应终体积为4．2mL。反应管用旋涡混
匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小
孔，95℃水浴40min，取出后流水冷却，然后3500
r／rain离心10min。取上清液，532nm处，1cm光
径比色杯，蒸馏水调零，测各管A值。组织(湿)中
MDA水平=(A测定一A测定空白)／(A标准一A标准空白)x
标准品浓度(10nmol／mL)／蛋白量(mg／mL)。
用亚硝酸盐法[1妇测SOD，包括总SOD和
CuZn—SOD。取10％组织匀浆稀释50倍，即50肚L
10％匀浆+2450肚L生理盐水，配成0．2％组织匀
浆。(1)总SOD测定：取组织匀浆10肛L，按测试盒
操作法加入试剂，反应体积为1．31mL。反应管用旋
涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40rain，加入
显色剂2mL混匀，室温放置10min，于波长550
nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测A值。组
织中总SOD活力=(Axe照一A测定)×反应液总体积／
(50％A对照×取样量×组织中蛋白量)。(2)CuZn—
SOD测定：样品按试剂盒操作进行前处理，取组织
匀浆10肛L，按测试盒操作法加入试剂，反应体积为
1．31mL。反应管用旋涡混匀器充分混匀，置37℃
恒温水浴40min，加入显色剂2mL混匀，室温放置
10min，于波长550nm处，1am光径比色杯，蒸馏
A测定)×反应液总体积／(50％A对照×取样量×组织
中蛋白量)。Mn—SOD活力为总SOD活力减去
CuZn—SOD活力。
1．5统计学处理：采用SPSSll．0统计软件进行统
计与分析，所得数据用z±S表示，单因素方差分析。
2结果
2．1 龟板醇提物对H。O。损伤MSC的影响：结果
见表1。H。O。损伤组与对照组比较具有显著性差异
(PH。O。损伤组比较，龟板醇提物不同质量浓度组对
H：O。损伤MSC均具有修复作用(P龟板醇提物随质量浓度增大修复能力增强，呈正向
关系。
表1龟板醇提物对H20：损伤MSC的影响(；±s，n一5)
Table1 EffectofEEPTonH202damage
toMSC(；±s，席一5)
与对照组比较：△6P<0．01
与H202损伤组比较：’P<0．05一P(0．01
△△P’P2．2龟板醇提物对大鼠肝组织中的MDA水平及
SOD活力的影响：结果见表2。与对照组比较，龟板
醇提物低、中、高剂量组MDA水平均明显降低
(P<0．01)，同时，能明显提高SOD活力，包括总
SOD、CuZn—SOD和Mn—SOD(P<0．05、0．01)。且
低剂量提高SoD活力能力最强，对于总SOD、
CuZn—SOD和Mn—SOD，龟板醇提物低、中、高组均
没有显著性差异(P>0．05)，说明龟板醇提物增加
水调零，测A值。组织中CuZn—SOD活力一(A对照一大鼠肝组织中SOD活力不受剂量的影响。
表2龟板醇提物对大鼠肝组织中MDA水平及SOD活力的影响(；±s，n一10)
Table2 EffectofEEPTonlevelofMDAandvitalityofSODinlivertissueofrats(工±s，一=10)
与对照组比较：+P<0．05一P<0．01
’P<0．05’‘P 万方数据
·1046· 中草蔼 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第7期2007年7月
3讨论
本研究结果表明，龟板醇提物对大鼠MSC氧
化损伤具有明显修复作用。H：O。加入MSC中后，
MSC细胞内抗氧化酶活性下降，过多的氧自由基不
能被及时清除而堆积在细胞内，致使它们与细胞内
的一些生物大分子，如蛋白质、核酸、脂质等发生反
应，生成大量氧化物或过氧化物，造成MSC细胞损
伤。同时H。0。通过其代谢产物羟自由基(·OH)使
抗凋亡基因bcl一2表达下调，降低细胞抗氧化能力，
从而导致细胞凋亡[1引。而龟板醇提物则能修复
MSC的这种氧化损伤，其修复能力随着质量浓度的
增大而增强。为观察龟板醇提物对MSC氧化损伤
的修复作用机制，本实验观察了龟板醇提物对在体
动物肝脂质过氧化的作用。
本实验结果表明，龟板醇提物低、中、高剂量组
均可降低大鼠肝组织中MDA的水平(P同时能不同程度地提高大鼠肝组织中SOD活力，
包括总SOD、CuZn—SOD和Mn—SOD(P<0．05、
0．01)。也就是说，龟板具有抗脂质过氧化作用。
值得一提的是，中医认为，龟板具有滋阴潜阳、
益肾强骨、养血补心的功效，龟板益肾作用可能与其
抗氧化性有关，本实验结果恰好证明了这一点。因
此，本实验在从抗氧化的角度诠释中医益肾理论方
面，作了有益的尝试。至于龟板醇提物抗氧化作用的
活性成分，有待更进一步研究。
致谢：广州中医药大学中药学院鉴定教研室张
丹雁教授对实验药材给予鉴定。
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银杏叶提取物的心肌延迟保护作用及其机制研究
李年生1，钟志莲2，姜德建p
(1．中南大学药学院药理学系，湖南长沙410078；2．中南大学湘雅医院检验科，湖南长沙410078)
摘要：目的观察银杏叶提取物(EGb761)对大鼠离体心脏心肌的延迟保护作用及其机制。方法离体大鼠心
脏全心停灌缺血30min后再灌注30min产生缺血再灌损伤，观测心率(HR)、冠脉流量(CF)、左室内压(LVP)
和左室内压变化最大速率(+dp／dt⋯)，测定心肌组织中肌酸激酶(CK)释放量、心肌组织丙二醛(MDA)和一氧
化氮(N0)的量。结果实验前24h单次ig给予EGb761(50或100mg／kg)可显著改善心肌缺血再灌注所致的
心功能(LVP和+dp／dt⋯)损伤，抑制心肌组织CK释放和MDA水平的增加以及N0水平的降低。预先给予
N0合酶抑制剂L—NAME(5mg／kg)或心肌肌细胞膜ATP敏感钾通道(sarcKn”)阻断药HMRl883(3rag／
kg)，均可明显抑制EGb761对心肌缺血再灌注损伤的延迟保护作用。结论EGb761对缺血再灌注诱导大鼠心肌
损伤具有延迟性保护作用，这一保护作用可能与增加NO合成和开放sarcK—TP通道有关。
关键词：银杏叶提取物(EGb761)；缺血再灌注损伤；ATP敏感钾通道；一氧化氮
中圈分类号：R286．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)07—1046—05
收稿日期：2007—01—08
作者简介：李年生，男，学士，主管实验师，研究方向为心血管药理。
*通讯作者姜德建Tel：(0731)2355077Fax：( 31)2355078E—mail：linianshen98@163．corn
万方数据
龟板醇提物对大鼠骨髓间充质干细胞氧化损伤的修复及其抗
脂质过氧化作用
作者： 李熙灿， 谢学明， 黄春花， 钟远声， 李伊为， 周健洪， 陈东风， LI Xi-can， XIE
Xue-ming， HUANG Chun-hua， ZHONG Yuan-sheng， LI Yi-wei， ZHOU Jian-hong，
CHEN Dong-feng
作者单位： 李熙灿,谢学明,黄春花,钟远声,LI Xi-can,XIE Xue-ming,HUANG Chun-hua,ZHONG Yuan-
sheng(广州中医药大学中药学院,广东,广州,510405)， 李伊为,周健洪,陈东风,LI Yi-
wei,ZHOU Jian-hong,CHEN Dong-feng(广州中医药大学基础医学院,广东,广州,510405)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(7)
被引用次数： 6次

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