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Isolation and identification of flavonoids from Epimedium koreanum and their effects on proliferation of RAW 264.7 cell line

淫羊藿黄酮的分离鉴定及其对前破骨细胞株增殖的影响



全 文 :●·1458· 。中草药 ChineSeTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
致谢:日本东北大学折谷隆志教授为此项研究
提供的生药粗提物。、 、
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淫羊藿黄酮的分离鉴定及其对前破骨细胞株增殖的影响

王婷·,z;张大威2~,张金超z一,杨梦建¨,肖培根-*
(1.中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所,北京 100094;2.香港城市大学深圳研究院,广东深圳518057;

3.沈阳药科大学天然药物化学教研窒,辽宁沈阳 】10016;4.河北大学化学与环境科学学院,河北保定071002)
摘要:目的观察淫羊藿中单体黄酮的抗骨质疏松作用。方法利用硅胶和凝胶柱色谱分离淫羊藿中单体黄酮
成允,根据化合物光谱数据(ESI—MS、1H—NMR和”C—NMR)鉴定其结构,通过MTT法观察其对体外培养的前破骨
细胞株RAW264.7增殖的影响。结果从淫羊藿地上部分的醋酸乙酯萃取物中分离得到5个化合物,分别为淫羊
藿苷(I)、宝藿苷Ⅱ(U)、朝藿索B(111)、宝藿苷I(Ⅳ)及金丝桃苷(V)。活性结果表明,0.1~100Fmol/L化合物
1I对前破骨细胞RAW264.7的生长有一定程度的促进作用;浓度为0.1~100gmol/L的化合物I对前破骨细胞
RAW264.7的生长有一定的抑制作用,但随着浓度的升高,转而表现为轻微的促进作用;浓度为1.0和10tzmol/L
的化合物Ⅲ对该细胞的增殖基本上没有什么影响,而其他浓度下,则对前破骨细胞RAW264.7的增殖表现出明显
的抑制作用;除个别浓度外,化合物Ⅳ和V均对前破骨细胞RAW264.7的生长表现出相当程度的抑制作用。结论
黄酮类化合物对RAW264.7的生长是促进还是抑制依赖于其自身的化学结构以及作用浓度,淫羊莅可能是通
过黄酮类化合物抑制前体破骨细胞的增殖,进而抑制前体破骨细胞分化形成破骨细胞而发挥抗骨质疏松作用的。
关键词:淫羊蓉;黄酮;前破骨细胞;RAW264.7
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2006)10—1458一05
IsolationandidentificationofflavonoidsfromEpimediumkoreanumandtheir
effectsonproliferationofRAW264.7celline
WANGTin91~,ZHANGDa—wei2~,ZHANGJin—cha02一,YANGMeng—su2,XIAOPei—genl

(1.InstituteofMedicinalPl ntDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedical
College,Beijing100094,China;2.ShenzhenRes archInstituteofCityUniversityofHongKong,Shenzhen
518057,China;3.DepartmentofN turalProductsChemistry,ShenyangP armaceuticalUniversity,
Shenyang110016,China;4.DepartmentofChemistry,CollegeofChemistry&Environmental
Science:HebeiUniversity.Baoding071002,China)
Abstract:ObjectiveTos udytheantiosteoporosis.activityoffl vonoidsisolatedfromEpimedium
收稿日期:2006—01--9
基金项目:国家863计划资助项目(2003AA222052)
作者简介:王婷(1981一),女,河北丰润人,博士研究生,主要从事淫羊藿药理药化方面的研究工作。
E—mail:btctingwang@cityu.org.cfi
*通讯作者杨梦娃肖培根Tel:(0755)26712364Fax:(0755)26712364E—mail:bhmyang@cityu.edu.hk
xiaopg@public.bta.net.cn
万方数据
中草药 ChineseTraditionaland,HerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·。 459·
koreanum.MethodsThec mpoundswereseparatedbycolumnchromatographywi.thsilicageland
SephadexLH一20andidentifiedbyspectralanalysis(ESI-MS,1H—NMR,and”C—NMR),respectively.
MTTAssaywasusedtoinvestigatefheffectsofthecompoundso proliferationofpreosteoclastRAW
264.7cellineinvitro.ResultsFivecompoundswerei olatedfromthethylacetateextractoftheaerial
partofE.koreanum.Theirstructureswereidentifiedas cariin(I),baohuosideⅡ(Ⅱ),epimedokore—
aninB(Ⅲ),baohuosideI(Ⅳ),andhyperoside(V).TheresultsindicatedthatcompoundⅡ.couldpro—
motetheproliferationofRAW264.7celllineat.concentrationsof0.1一100ttmol/U.CompoundI atcon—
centrationsof0.1—100弘m01/LcouldinhibittheproliferationofRAW264.7cellineandturnedtostimu—
latetheproliferationofRAW264.7cell“r!easconcentrationincreased.Compoundill atconcentrationsof
1.0and10}tmol/Lhadnoeffectontheproliferation,butsignificantlyinhibitedthproliferationofRAW
264.7cellLineatotherconcentrations.Exceptindividualc }n亡entration,compounds~andV atco cen—
trationsof0.1—100,#mol/LsignificantlyinhibitedthproliferationofRAW264.7celline.Conclusion
TheffectsofflavonoidsntheproliferationofRAW264.7cellinearebi—directional。dependingoncon—
centrationsandtheirchemicalstructures.Theo teoporsismaybecontrolled.byE.koreanumthrough
inhibiting.theproliferationandifferentiationofpreosteoclast.
Keywords:EpimediumkoreanumNakai;flavonoid;preosteoclast;RAW264.7
我国已步人老龄化社会,骨质疏松症严重影响
着老年人的生活质量。中医中药在治疗骨质疏松症
方面有着独到的见解和丰富的临床经验。根据中医
“肾主骨”的理论,临床上多采用补益肾阳的中药来
治疗骨质疏松症。淫羊藿味辛、甘,性温,归肝、肾经,
是传统的补肾壮阳中药,《本草纲目.》称之有“益精
气,强筋骨,补腰膝”作用,其疗效已被多年的中医临
床实践所证实。 .
近年来,国内外学者对淫羊藿抗骨质疏松症的
疗效和机制做了较多且深入的研究,其总提物或总
有效部位对各类骨质疏松症动物模型作用的研究已
经有很多报道[1~3],体外实验多集中在探讨其对成
骨细胞的作用[4~6],而淫羊藿中单体成分对前破骨
细胞的作用则尚未见报道。为进一步阐明淫羊藿抗
骨质疏松症作用的有效成分和机制,本实验通过活
性跟踪分离,在确定活性部位的基础上,研究了从小
檗科淫羊藿属植物朝鲜淫羊藿Epimediumkore—
anumNakai活性组分中分离鉴定的.5种黄酮单体
对前破骨细胞株RAW264.7增殖的影响。 ,
1材料与方法
1.1 仪器与材料:Bruker’AV一400型核磁共振
仪;ThermoFinnigan—LCQ质谱仪;Bio—RAD
Model680型酶联免疫检测仪。
色谱用硅胶购自青岛海洋化工厂;葡聚糖凝胶
(SephadexLH一20)为Pharmacia产品;四氮唑溴
[MAA,3一(4,5一dimethylthiazol一2一y1)-2,6-diphenyl
tetrazoliumbromide]为Amresco公司产品,由上海\
生物工程有限公司分装;培养基DMEM(高糖型)购
自Gibico公司;新生牛血清为杭州四季青生物工程
材料有限公司产品。
朝鲜淫羊藿购自吉林省长春市,经本所资源室
陈四保研究员鉴定为朝鲜淫羊藿Epimediumkore—
anumNakai的干燥地上部分。
1.2方法
1.2.1活性部位的确定及化合物的分离:朝鲜淫羊
藿的干燥地上部分15kg粉碎后,用95%乙醇回流
提取3次,将提取物浓缩得干浸膏,干浸膏用水悬浮
后,依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取,回收溶
剂。初步生物活性实验结果显示,相对于其他部位萃
取物来讲,醋酸乙酯萃取物对RAW264.7细胞的
生长表现出较好的增殖抑制作用。然后,取醋酸乙酯
萃取物(180g)用硅胶(100~200目)拌样进行硅胶
柱色谱,分别用石油醚、醋酸乙酯和甲醇梯度洗脱,
硅胶TLC检查合并相同组分,共合并成33个部分。
第21部分用硅胶柱(200~300目)色谱,石油醚、丙
酮(10:3.5)洗脱,硅胶TLC检查合并相同组分,共
合并成6份(A~F),A份经SephadexLH一20柱纯
化(MeOH洗脱),经MeOH重结晶,得一黄色针状
结晶,为化合物Ⅲ。第23~28部分合并后用硅胶柱
色谱(200~300目),氯仿、甲醇梯度洗脱,硅胶TLC
检查合并相同组分,合成12份(A~L),其中H和I
份经反复SephadexLH一20柱纯化(甲醇或氯仿:
甲醇1:1洗脱),甲醇重结晶,分别得到黄色针状结
晶化合物Ⅳ和Ⅱ。第30部分用硅胶柱(200~300
万方数据
·1460· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
目)色谱,氯仿、甲醇梯度洗脱,硅胶TLC检查合并
相同组分,共合并成8份(A~H),B份经反复
SephadexLH一20柱纯化(甲醇洗脱),甲醇重结晶,
得黄色针状结晶化合物V,F份经甲醇重结晶,得黄
色针状结晶化合物I。
1.2.2细胞生长抑制率测定:所有受试药及雌二醇
均用二甲基亚砜溶解并稀释,使得二甲基亚砜在药
液中的终浓度小于0.5%。前破骨细胞株RAw
264.7购于AmericanTypeCultureCollection
(ATCC),细胞以2×104个/mL密度接种于96孔
板,90pI./孔。过夜,加入雌二醇以及受试化合物,使
其终浓度分别为100、50、10、1、0.】pmol/L,加人受
试药48h后,每孔加入5mg/mL的MTT10肛L,
继续培养4h后小心弃培养液,然后每孔中加入100
弘LDMSO,于酶联免疫检测仪上570nm波长处测
各孔吸光度值(A),细胞生长抑制率根据公式[抑制
率一(AT—Ac)/Ac×100%(AT:受试药组的吸光
度;Ac对照组的吸光度)]计算。
2 结果
2.1化合物的鉴定
化合物I:黄色针状结晶(MeOH)。MS、
1H—NMR、13C—NMR数据与文献报道的化合物淫羊
藿苷(icariin)的数据基本一致‘“。
化合物Ⅱ:黄色针状结晶(MeOH)。正离子
ESI—MS(m/z):523(M+Na)+,501(M+H)+;负
离子ESI—MS(,72/2):499(M—H)一。1H—NMR(400
MHz,MeOD)艿:7.79(2H,d,J一6.4Hz,H一27,67),
6.95(2H,d,J=6.4Hz,H一37,5’),6.26(1H,s,H一
6),5.39(1H,brs,Rha—H一1),5.20(1H,t,J=5.2
Hz,H一2”),1.73,1.68(各为3H,s,H一4”,5”),0.94
(3H,d,J一8.8Hz,Rha—H一6)。13C—NMR(100
MHz,MeOD)d:159.2(C一2),136.1(C一3),179.9(C一
4),160.8(C一5),99.3(C一6),163.1(C一7),107.9(C一
8),155.8(C一9),106.0(C一10),122.9(C一1’),131.9
(C一27),116.5(C一37),161.6(C一47),116.5(C一5’),
131.9(C一67),22.4(C一1”),123.8(C一2”),132.4(C一
3”),25.9(C一4”),103.5(Rha—C一1),72.0(Rha—C一2),
72.1(Rha—C一3),73.2(Rha—C一4),71.9(Rha—C一5),
17.7(Rha—C一6)。以上数据与文献报道的化合物宝
藿苷Ⅱ(baohuosideⅡ)的数据基本一致‘川。
化合物Ⅲ:黄色针状结晶(MeOH)。正离子
ESI—MS(川/z):423(M+H)+;负离子.ESI—MS
(7聍/z):421(M—H)一。1H—NMR(400MHz,DMSO—
d一6)艿:12.89(1H,s,5一OH),10.76(1H,s,7-OH),
9.83(1H,s,47一OH),9.24(1H,s,3-OH),7.3l
(1H,s,H一67),7.30(1H,s,H~27),6.27(1H,s,H一
6),6.60(1H,s,H一3),5.30(1H,t,J一8.2Hz,H一
2”),5.24(1H,t,J=6.8Hz,H一2”),3.43(2H,d,
J=7.2Hz,H一1”),3.28(2H,d,J=6.8Hz,H一1”),
1.74(3H,s,H一4”),1.67(6H,s,H一4”,5”),1.60
(3H,s,H一5”)。13C—NMR(100MHz,DMSO—d6)艿:
163.2(C一2),102.4(C一3),181.9(C一4),158.9(C一
5),98.2(C一6),160.5(C一7),160.0(C一8),154.3(C二
9),103.5(C一10),120.9(C一17),110.7(C一2’),145.2
(C一37),147.4(C一47),128.7(C一57),118.9(C一67),
21.3(C一1”),118.9(C一2”),131.8(C一3”),25.5(C一
4”),17.7(C一5”),28.1(C一1”),122.2(C一2”),130 3
(C一3”),25.4(C一4”),17.7(C一5”)。以上数据与文献
报道的化合物朝藿素B(epimedokoreaninB)的数据
基本一致[7]。
化合物Ⅳ:黄色针状结晶(MeOH)。正离子
ESI—MS(柳屈):537(M+Na)十,515(M+H)+;负
离子ESI—MS(m/2):513(M—H)一。1H—NMR(400
MHz,DMSO—d一6)d:12.51(1H,s,5-OH),10.86
(1H,s,7-OH),7.85(2H,d,J一8.8z,H一2’,6’),
7.12(2H,d,J一8.8Hz,H一3’,5’),6.32(1H,s,H一
6),5.27(1H,d,J一1.8Hz,Rha—H一1),5.14(1H,t,
J一6.8Hz,H一2”),3.85(3H,s,47一OMe),1.66,
1.60(均为3H,s,H一4”,5”),0.78(3H,d,J=5.6
Hz,Rha—H一6)。13C—NMR(100MHz,DMSO—d。)毋:
156.7(C一2);134.4(C一3),177.9(C一4),158.8(C一
5),98.3(C一6),161.2(C一7),105..9(C一8),153.7(C一
9),104.1(C一10),】22.2(C~l7),130.4(C一27),114.0
(C一37),161.6(C一47),114.0(C一5’),130.4(C一67),
21.3(C一1”),122.3(C一2”),131.0(C一3”),25.4(C一
4”),17. (C一5”),56.5(47一OMe,102.9(Rha—C一1),
70.4(Rha—C一2),70.8(Rha—C一3),71.2(Rha—C一4),
70.0(Rha~C一5),17.4(Rha:C一6)。2以上数据与文献
报道的化合物宝藿苷I(baohuosideI)的数据基
本一致[川。
化合物V:黄色针状结晶(M亡OH)。’MS、
1H—NMR、13C—NMR数据与文献报道的化合物金丝
桃苷(hyperoside)的数据基本一致[7]。
2.2对前破骨细胞增殖的影响:见图1。在0.1~
100pmol/L浓度内,化合物Ⅱ对前破骨细胞RAW
264.7的生长有一定程度的促进作用;浓度为0.1、1
/-mol/L的化合物I对前破骨细胞RAw264.7的
生长有一定的抑制作用,但随着浓度的升高,转而表
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·1461·
图1雌二醇及化合物I~V对RAW264·7细胞
增殖的影响
Fig.1Effectsof1713一estI:odiolandcompoundsi—V
OilproliferationofRAW264.7
现为轻微的促进作用;浓度为1.0、10tzmo!TL的化
合物Ⅲ对该细胞的增殖基本上没有什么影响,而其
他浓度下,该化合物则对前破骨细胞RAW264.7
的增殖表现出明显的抑制作用;除个别浓度外,在
0.1~100/-mol/L浓度内,化合物Ⅳ和V坶对前破
骨细胞RAW264.7的生长表现出相当程度的抑制
作用。如0.1ttmol/L的V对RAW264.7的生长抑
制率达到30.5%,与雌二醇相当。
3讨论
正常的骨重建依赖于骨吸收和骨形成之间的动
态平衡,当破骨细胞的骨吸收功能超过成骨细胞的
骨形成作用后,这一平衡将失调,从而导致骨质疏松
或骨质破坏。所以,现阶段治疗骨质疏松主要从两方
面人手,即抑制骨吸收和促进骨形成。体外成骨细胞
的分离培养相对容易,纯度也高,而且目前也建立了
一些成骨细胞系,如细胞UMR106,所以体外研究
药物对骨形成作用的影响已比较成熟。破骨细胞是
由骨髓单核细胞前体融合形成的具有骨吸收功能的
多核巨细胞[8],在骨代谢性疾患及某些溶骨性疾病
的骨吸收及骨质破坏中起重要作用,由于破骨细胞
的分离培养存在着难度大,技术水平要求高等因素
的限制,直到1982年,Chamber和Magnus才首次
成功分离原代破骨细胞。而且原代分离得到的破骨
细胞数量少、纯度低,因此,对破骨细胞细胞的研究
明显滞后于其他细胞,同时也限制了对其分子水平
的深入研究。破骨细胞的永生化是个世界难题,目前
世界上尚没有成功建立破骨细胞系,但是已建立了
一些前体破骨细胞系。例如,目前较多采用的是
Raschke等于1978年采用艾贝尔逊(氏)小鼠白血
病病毒(Abelsonmurineleukemiav rus)转染淋巴
细胞淋巴瘤建立的鼠源性单核巨噬细胞系RAW
264.7。
本实验采用RAW264.7细胞模型,首次研究
了5个淫羊藿单体黄酮对前体破骨细胞系RAW
264.7增殖的影响,得到以下结果:(1)黄酮类化合
物对RAW264.7的生长是促进还是抑制依赖于其
自身的化学结构以及作用浓度;(2)单体黄酮对前体
破骨细胞系RAW264.7增殖的影响没有表现出浓
度依赖性。可见,淫羊藿可能是通过黄酮类化合物抑
制前体破骨细胞的增殖,进而抑制前体破骨细胞分
化形成破骨细胞而发挥抗骨质疏松作用的。据文献
报道,活性氧在骨改建中有如下作用:①增加破骨细
胞数量嘲;②激活静止态的破骨细胞mj;③直接参
与骨基质的降解n妇;④拮抗破骨细胞的活性抑制物
质‘12]。可见,淫羊藿的抗骨质疏松作用大概与其所
含的黄酮类化合物的抗氧化性也是密切相关的。另
外,单体黄酮对前体破骨细胞系RAW.264.7表现
出的生物效应与雌激素是类似的,都没有表现出浓
度依赖性,这与文献中报道雌激素的某些生理效应
表现为U型效应也是一致的[1“14]。当然,淫羊藿抗
骨质疏松作用的物质基础以及机制,尚需要运用现
代分子生物学手段进行深入的研究。
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多管藻化学成分研究
柳全文1’3,李桂华1,刘珂孙,张婷4,范 晓¨,郭红艳·
(1·烟台师范学院化学与材料科学学院,山东烟台:264025;2.烟台大学药学院,山东烟台264003;3.中国科学院
海洋研究所,山东青岛 266071;4.烟台师范学院生命科学学院,山东烟台264025)
摘 要:目的 研究红藻多管藻PolyMphoniaurceolata的化学成分。方法采用硅胶、SephadexLH一20柱色谱、反
相HPLC分离化合物,运用波谱技术分析确定化合物结构。结果从多管藻乙醇提取物的醋酸乙酯萃取层中分离
得到10个化合物,分别为2,27,3,3-四溴一4,4’,5,5-四羟基二苯甲烷(I)、2,2’,3一三溴一37,4,47,5一四羟基一6-乙氧
甲基二苯甲烷(Ⅱ)、双一(2,3-二溴一4,5-二羟卞基)一醚(Ⅲ)、3-溴一4一(2,3-二溴一4,sL--羟基苯甲基)一5一甲氧甲基苯二
酚(Ⅳ)、2,3-二溴一4,5-二羟基苯甲醇(V)、2,3-二溴一4,5-二羟基苯甲基甲醚(Ⅵ)、3-溴:4一羟基苯甲酸(Ⅶ)、2-溴一4,
5-二羟基苯甲醛(Ⅶ)、2,3一二溴一“5一二羟基苯甲醛(Ⅸ)、3-溴一4,5一二羟基苯甲醛(x)。结论化合物I~Ⅳ、Ⅶ、Ⅶ
均为首次从该属海藻中发现。
关键词:红藻;多管藻;结构鉴定
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2006)10—1462—04
ChemicalconstituentsfromPolysiphoniaurceolata
I。IUQuan—wenl~,LIGui—hual,LIUKe2,ZHANGTin94,FANXiaos,GUOHong-yanl
(1·CollegeofChemicalandMaterialScience,YantaiNorm lUniversity,Yantai264025,China;2.Seh001ofPharmacv,
YantaiUniversity,Yantai264003,China;3.InstituteofOceanology,ChineseAcademyofSciences,Qingdao
266071,China;4.CollegeofLifeSci ncsYantai、NormalUniversity,Yantai264025,China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatethechemicalconstituentsofredalga,Poly5iphonia扛rceoznt吐.
MethodsThecompoundsI—Xwereisolatedbyacombinationofs licagel,SephadexLH一20,anaRP—
HPI—Cchromatographies,andt eirstructureswereelucidatedwithspectroscopicmethodsincludingIR,
MS,andNMR.ResultsTencompoundswerei olatedfromethylacetateextractoftheredalge,P.“rcP—
olata·Theirstructureswereidentifiedas:2,27,3,37一tetrahromo一4,47,5,57一tetrahydroxydiphenyl
methane(I),2,27,3-tribromo一37,4,47,5一tetrahydroxy一6-ethyloxymethyldiphenylmethane(Ⅱ),b 5
(2,3一dibromo一4,5一dihydroxybenzyl):ether(i11),3一bromo一4一(2,3一dibromo一4,5一dihydroxybenzyl)一5一
methoxymethylpyrocatechol(IV),2,3-dibromo一4,5一dih多droxybenzylaclohol(V),2,3-dibromo一4,5一
dihydroxybenzylmethylether(Ⅵ),3一hromo一4一hydroxybenzoicacid(Ⅶ),2一bromo一4,5-dihydroxyben—
zaldehyde(Ⅷ),2, 3-dibromo一4,5 dihydroxybenzylaldehyde(IX),and3一bromo一4,5-dihydroxyben—
zylaldehyde(X).ConclusionCompoundsI—IV,ⅦandVIIIareobtainedfromthisalgaspeciesforthe
firsttjme. 1
收稿日期:2006—03—17
基金项目:垦家自然赞学重点基金资助项目(29932030);国家“863”高技术发展计划专项(200lAA620403);烟台师范学院博士基金项目
(20062901) 一⋯’。’
I乍妻磐鑫些Ⅱ龛字‘窖7#’掌,博士,从事新药研发和天然药物化学研窜。 E-mail:qwliu2001@yahoo.co.m.cn*通讯作者刘珂,范晓
万方数据
淫羊藿黄酮的分离鉴定及其对前破骨细胞株增殖的影响
作者: 王婷, 张大威, 张金超, 杨梦甦, 肖培根, WANG Ting, ZHANG Da-wei, ZHANG Jin-
chao, YANG Meng-su, XIAO Pei-gen
作者单位: 王婷,WANG Ting(中国医学科学院,中国协和医科大学药用植物研究所,北京,100094;香港城
市大学深圳研究院,广东,深圳,518057), 张大威,ZHANG Da-wei(香港城市大学深圳研究院
,广东,深圳,518057;沈阳药科大学,天然药物化学教研室,辽宁,沈阳,110016), 张金超
,ZHANG Jin-chao(香港城市大学深圳研究院,广东,深圳,518057;河北大学化学与环境科学学
院,河北,保定,071002), 杨梦甦,YANG Meng-su(香港城市大学深圳研究院,广东,深圳
,518057), 肖培根,XIAO Pei-gen(中国医学科学院,中国协和医科大学药用植物研究所,北
京,100094)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2006,37(10)
被引用次数: 17次

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