全 文 ：·578· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月
鼠的心肌梗死范围。当心肌细胞受损时，细胞膜通透
性增高，胞内酶大量释放进入血液中，导致血清心肌
酶LDH的活性升高。因而，血清LDH活性可以间接
反映心肌缺血损害范围和严重程度[8]。本实验结果表
明，拟人参皂苷元可使急性心肌缺血大鼠血清LDH
活性明显降低，与其缩小心肌梗死范围相吻合。
造成心肌缺血的原因有很多，其中由于冠脉栓
塞导致的冠脉血流量不足是一个重要原因。血液黏
度增高可促进血栓形成。血液黏度升高的情况下，血
液阻力增大导致流速减慢，血液瘀滞。而在血液瘀滞
状态下，血小板与白细胞的黏附性与聚集性增强，凝
血系统易于活化，纤溶系统以及血管内皮的抗血栓
功能等变化，皆十分有利于血栓的形成，且不利于侧
支循环的建立。冠状动脉内血栓形成是大多数急性
心肌梗死的病理生理基础，血栓形成的机械性梗阻，
使相应心肌发生持久而严重的缺血坏死。现代医学
研究认为，临床缺血性心脑血管疾病多有血液黏度
增高、凝血时间缩短的现象。因此，降低血黏度、延长
凝血时间的药物将抑制血栓的形成，从而可以减缓
心肌缺血程度，减少冠心病的发作。现代药理学研究
表明，绝大部分具有活血祛瘀作用的中药均可改善
血液流变学的各项指标，如降低血液黏滞度，呈现抗
凝作用等[93。本实验结果提示中、低剂量的拟人参皂
苷元可显著延长小鼠凝血时间，并维持至4h，而高
剂量则作用不明显，其是否与阿司匹林的抗凝血作
用机制相似以及拟人参皂苷元抗心肌缺血的详细机
制有待于进一步研究。
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黄芪提取物对体外蛋白非酶糖化的抑制作用
杨 芳，杜俊蓉。，郑小媛，余彦，陈小瑞
(四川大学华西药学院药理教研室，四川成都610041)
近年来的研究表明糖尿病的高血糖状态能加速
非酶糖化(nonenzymaticglycosylation，NEG)反
应，引起非酶糖化终末产物(advancedglyeation
endproducts，AGEs)在体内蓄积，从而诱发一系
列糖尿病并发症，如糖尿病肾病、白内障、神经病变
等[1]。这些严重的糖尿病并发症是导致糖尿病患者
致残、致死的主要病因。因此寻找安全有效的AGEs
生成抑制剂对防治糖尿病并发症具有重要意义。豆
科植物黄芪具有补气升阳、益卫固表、利水消肿的功
效，是历代医家治疗“消渴症”中药复方中的常用药
材。现代药理学研究显示黄芪对糖尿病从血糖、胰岛
素的释放，免疫功能的调节，到并发症的防治等方面
都有一定疗效[2]。本研究采用不同方法观察黄芪水
提物对体外AGEs形成的影响。
1材料
1．1试剂和药物：牛血清白蛋白，Sigma公司；邻苯
二胺(OPD)，Sigma公司；氯化硝基四氮唑蓝
(NBT)，上海伯奥精细化工有限公司，批号：
收稿日期：2006—10—13
基金项目；NJtl大学辐射物理及技术教育部重点实验室开放基金资助项目(LF04004)
*通讯作者杜俊蓉Tel：(028)85503938E—mail：dujr07@gmail．com
万方数据
中草蔼 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·579·
20050110；叠氮钠(NaN。)，天津市科密欧化学试剂
开发中心，批号：20050128；辣根过氧化物酶标记的
羊抗兔IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司，批
号：ZB--2301。弗氏完全佐剂，美国Pierce公司，批
号：E163215。ActivatedCNB卜S pharose4B亲和色
谱柱，美国Pharmacia公司。氨基胍，Sigma公司，批
号：396494。pVDF膜，瑞士Roche公司。蛋白质相
对分子质量标准品，MBIFermantas公司。DAB显
色试剂盒，美国Vectorlab公司。蒙古黄芪
Astragalusmembranaceus(Fisch．)Bungevar．
mongholicus(Bunge)Hsiao．购自北京同仁堂成都
分店，由华西药学院陈雏鉴定。其余试剂均为市售分
析纯。
1．2实验动物：成年新西兰兔，健康一级，雌雄兼
用，购自四川大学华西实验动物中心。常规饲养于本
室动物房，自由摄食、饮水。
1．3 仪器：UV一2102C型紫外可见分光光度计，
美国UNIC公司。HH．BII．420—BS型电热恒温
培养箱，上海跃进医疗器械厂。荧光检测仪(HTS
7000)，美国PERKINLMER公司。酶标仪
(Model550)，垂直电泳系统MiniPRoTEAN2&3
Cell，美国BIo—RAD公司。R一201型旋蒸仪，上
海申顺生物科技有限公司。10ATVP高效液相色谱
仪，且本岛津公司，美国奥泰2000ES型蒸发光散射
检测器。
2方法
2．1黄芪提取物制备：适量饮片用3倍量蒸馏水浸
泡1h后，回流提取两次，每次30min，合并滤液，
减压浓缩制得黄芪提取物，按照《中国药典92005年
版HPLC一蒸发光散射检测器测定提取物中黄芪甲
苷质量分数为0．06％。黄芪提取物一20℃保存备
用。临用前，用蒸馏水配制黄芪提取物溶液，滤过除
菌后使用。
2．2非酶糖化系统的建立：参照文献方法[3]并稍作
修改。在pH7．4的磷酸盐缓冲液中加入葡萄糖，牛
血清白蛋白，使其终浓度分别为500mmol／L和50
mg／mL，0．02o．4 NaN。抗菌。加入黄芪水提取物使其
终质量浓度分别为1．0、0．5、0．1、0．01mg／mL。同
时另设空白组，即不加药物完整的非酶糖化系统；阳
性组，即50mmol／L氨基胍对照组。37℃避光孵育
1个月。
2．3疫苗和抗血清的制备及纯化：参考文献方法进
行[4]。将孵育2个月的BSA—AGEs液透析处理后，
与弗氏完全佐剂(1：1)充分乳化混匀，兔多点SC2
mL，每周1次，第4次免疫后10d颈总动脉取血，
3000r／min离心收集抗血清，用饱和硫酸铵沉淀
后，通过ActivatedCNBr—Sepharose4B亲和色谱柱
纯化抗体，非竞争性ELISA法测定抗体效价，免疫
前血清作为对照血清。
2．4对果糖胺生成的抑制作用[5]：孵育1周后，取
各组反应液20弘L，分别加入1mLNBT试液，
37℃水浴，严格控制反应时间，以10％醋酸溶液
中止反应。在530nm处测定5min和15min时的
吸光度(A)值。按下式计算各药物的抑制率。
抑制率一[1一(给药As一给药As)／(对照A·s一对照
A5)]×100％
2．5对AGEs生成的抑制作用，参考文献方法[5]
并稍作修改。
2．5．1荧光检测：各组反应液37℃孵育1个月
后，用荧光检测仪(激发波长370nm发射波长440
nm)检测AGEs的荧光吸光度值(F)。按下式计算
抑制率。
抑制率一(对照F一给药F)／对照F×100％
2．5．2酶联免疫反应(ELISA)检测：将反应液各
100弘L加入96孔板，3个复孔。4℃过液，除去孔
内液体 洗板4次，每孔加入100肛L适度稀释后的
自制兔抗血清。37℃保温2h后，除去孔内液体，洗
板4次，每孔加入100弘L酶标抗体，37℃保温2h
后，除去孔内液体，洗板4次，每孔加100tLLOPD
底物液，37℃避光反应10min，每孔加50肛L硫酸
终止反应。在酶标仪490nm波长处读取A值。按
下式计算抑制率。
抑制率一(对照A一给药A)／对照A×100％
2．5．3免疫杂交分析：将非酶糖化蛋白样品与5×
上样缓冲液混合，95℃加热5min，7．5％SDS—
PAGE电泳，将蛋白电转移至PVDF膜上，5％脱
脂奶粉封膜后，加入自制兔抗血清(1：5ooo)室温
孵育1h，洗膜后加入HPR标记羊抗兔二抗(1：
2ooo)室温孵育1h，DAB显色、照相。设置不加一
抗的BSA阴性对照组。
2．6统计学方法：计量资料数据用x+s表示，计量
资料组间比较采用单因素方差分析(ONE～WAY
ANOVA)，所有数据均采SPSS11．5统计软件包
统计。
3 结果
3．1抗血清的ELISA分析：ELISA结果显示目的
蛋白(BSA—AGEs)免疫5周后，血清中产生了高效
价的抗体，稀释度为1：5000以上。
万方数据
·580· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月
3．2药物对体外果糖胺生成的抑制作用：黄芪提取
物对体外果糖胺的生成具有浓度依赖性的抑制作
用，其中0．5、1．0mg／mL黄芪提取物的抑制作用
与空白对照组比较有显著差异(P<0．05、0．01)，而
1．0mg／mL黄芪提取物的抑制率显著高于50
rnmol／L氨基胍组(P<0．05)。结果见表1。
3．3药物对体外AGEs生成的干预作用
3．3．1荧光值测定：0．01～1．0mg／mL黄芪提取
物对体外非酶糖基化体系的荧光值具有显著的降低
作用(尸果见表2。
表1 黄芪水提物对体外果糖胺生成的抑制作用
(；士s，聘=3)
Table1 InhibitionofRadixAstragaliw terxtract
onformationoffructosaminesiny豇ro
G±s，n一3)
与空白对照组比较：。P<0．05一P<0．01
与氨基胍组比较：4P<0．05
。P4P表2黄芪水提物对体外AGEs生成(荧光)的抑制作用
(x±S，万一3)
Table2 InhibitionofRadixAstragaliw terxtract
onAGEformation(fluorescence)invitro
(工士S，砣一3)
与空白对照组比较：一P”。P3．3．2ELISA检测：0．01～1．0mg／mL黄芪水提
物对体外AGEs生成均有显著的抑制作用(P<
0．01)，其中1．0mg／mL黄芪水提物的抑制率与氨
基胍比较没有显著差异。结果见表3。
3．3．3免疫杂交分析：各质量浓度黄芪水提物对体
外AGEs生成均有明显抑制作用。结果见图1。
4讨论
表3黄芪水提物对体外AGEs生成(ELISA)的抑制作用
04-_S，n一3)
Table3 InhibitionofRadixAstragaliw terxtract
onAGEformation(ELISA)invitro
(工土s，辟一3)
与空白对照组比较：一P与氨基胍组比较：44P<0．01
+。P4。P<0．05usaminoguanidinegroup
0一BSA1一空白对照2～5-1．0、0·5、0·1、0·01mg／mL黄芪水
提物6—50mmol／L氨基胍
O—BSA1一control2～5—1．0，0．5，0．1，0．01mg／mLRadix
Astragaliw terxtract6-50mmol／Laminoguanidine
图1 黄芪水提物对体外AGEs生成的抑制作用
(免疫杂交)
Fig．1InhibitionofRadixAstragaliw terxtract
onAGEformationinvitro(Westernblotti g)
体内蛋白质的非酶糖基化反应与很多慢性疾病
的病理机制有关，如动脉粥样硬化、老年痴呆、衰老
以及糖尿病并发症等。通过阻断非酶糖化反应从而
防治上述疾病的发生发展是近年来药物治疗学领域
的新策略，也取得了一些进展，如很多实验研究证明
氨基胍可通过抑制AGEs形成，有效防治实验动物
糖尿病视网膜病变等并发症口“]，但由于其副作用太
大，临床应用受限。而中药治疗糖尿病具有悠久的历
史，正确应用现代药理学方法，深入系统地研究中药
防治糖尿病及其并发症的有效物质基础及作用机
制，是推进中药现代化进程的重要工作。
AGEs是指蛋白质、脂质和核酸等大分子在没
有酶催化的条件下，自发地与葡萄糖或其他还原性
单糖反应所生成的稳定的共价化合物。如糖的游离
醛基或酮基攻击蛋白质上氨基形成schiff碱，经重
排、脱水、缩合产生AGEs。AGEs化学成分复杂，是
多种不同化合物的总称，包含羧甲基赖氨酸[Nc-
(carboxymethyl)lysine]、苯妥西定(pentosidine)、
蛋白交联产物(proteincross—links)等类别。AGEs
是由荧光物质和非荧光物质组成的混合物，因此本
实验用荧光分光光度法测定荧光AGEs物质，通过
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·581·
NBT显色反应检测早期非荧光产物果糖胺，经自制
抗体的ELISA检测总的AGEs的量。实验结果显
示氨基胍可显著抑制体外荧光AGEs和总AGEs
形成，但对非荧光AGEs未见明显影响，这可能与
氨基胍选择性作用于某些AGEs组分，或是氨基胍
只抑制非酶糖化过程中某些阶段的产物形成有
关[43；此外，本实验结果表明黄芪提取物对荧光和非
荧光AGEs的形成均有浓度依赖性的抑制作用，其
中对荧光AGEs的抑制作用与氨基胍相似，在高质
量浓度时对总AGEs的抑制作用也与氨基胍相似，
而对早期非荧光AGEs的抑制作用强于氨基胍。
黄芪的化学成分主要包括黄酮类、有机酸类、皂
苷类、多糖类、氨基酸等[7]，本实验采用热水煎煮制
备的黄芪提取物应主要包含黄芪的水溶性组分。有
文献报道黄酮中的槲皮素、有机酸中的阿魏酸等化
合物可抑制体外非酶糖化反应醢．9]。结合现代分离纯
化技术和成分示踪技术，研究黄芪抑制AGEs生成
的有效成分及其对AGEs相关疾病的防治作用正
在进行中。
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华佗再造丸治疗缺血性中风随机对照试验的Meta分析
蔡业峰，许越，郭建文，张新春，李伟峰，梁伟雄，黄燕+
(广卅I中医药大学第二附属医院脑病中心，广东广州 510120)
华佗再造丸的处方起源于冉氏家族，历经200
余年中医临床实践，其中成药于1985年由广州奇星
药厂研制成功，并于1990、1995、2000年连续三届以
保密处方产品收载于《中国药典》，成为中风类首选
药物。华佗再造丸经药理研究和临床观察证明，具有
保护中风患者的脑细胞免受损害和修复其受损的脑
细胞以及激活其脑细胞代偿功能，还对神经于细胞
的增殖、分化和迁移有促进作用，能够用于预防中
风、治疗中风、中风后遗症，以及冠心病心绞痛等。在
国内大量地应用于心脑血管疾病的治疗。
本研究利用循证医学Meta分析的方法，对国
内外发表的华佗再造丸治疗缺血中风临床疗效的文
献进行严格的方法学质量评价和Meta分析，以进
一步评价华佗再造丸治疗缺血中风的临床疗效和安
全性，并系统回顾与总结该类临床试验的研究质量
和存在的问题等。
1对象与方法
1．1研究对象
1．1．1研究对象的确定：国内外发表的研究华佗再
造丸治疗中风病临床疗效的随机对照文献。数据库：
国外(语种限制为英文)：Medline光盘数据库
(1966—2006．5)，EMBase光盘数据库(1984—
2006．5)，CochraneLibrary。国内：中国生物医学文
献数据库(CBM，1979—2006．10)，中国学术期刊全
文数据库(CNKI，1994--2006．10)和中文科技期刊
全文数据库(VIP，1989--2006．10)。检索方法：国外
收稿日期：2007—01—26
基金项目：国家十五攻关重点项目(2004BA721A02)
*通讯作者黄燕Tel：13380068906E—mail：Stroketcml5@yahoo．corn．cn
万方数据
黄芪提取物对体外蛋白非酶糖化的抑制作用
作者： 杨芳， 杜俊蓉， 郑小媛， 余彦， 陈小瑞
作者单位： 四川大学华西药学院药理教研室,四川,成都,610041
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(4)
被引用次数： 6次

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