全 文 ：中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月·125·
黄花蒿SRAP—PCR反应体系的建立与优化
邓 婧1，陈 新H，宣 朴2
(1．成都中医药大学药学院，四川成都610075；2．四川省农科院
农业信息与农村经济研究所，四川成都610066)
摘要：目的用序列相关扩增多态性(SRAP)这一新的分子标记技术建立稳定可重复的黄花蒿Artemisiaannua
的SRAP最佳反应体系。方法以黄花蒿DNA为模板，分析了SRAP反应体系中的一些重要参数对PCR扩增的
影响。结果 建立了稳定可重复的SRAP反应体系；25pI。反应体系中，模板DNA为30～10,5ng，MgCI：为2．0
mmol／L，dNTPs为0．25mmol／L，Taq酶为1．0U，引物为2．0#mol／L；扩增程序：94℃预变性3rain，94℃变性1
rain，35℃复性1min，72℃延伸1rain，5个循环；94℃变性1rain，50℃复性1rain，72℃延伸1rain，35个循环，72
℃延伸7rain。结论本研究建立的黄花蒿SRAP体系重复性好，稳定性强。
关键词：黄花蒿；SRAP反应体系；优化
中图分类号：R284．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)01—0125—04
EstablishmentandoptimizationofSRAP-PCRinArtemisiaannua
DENGJin91，CHENXinl，XUANPu2
(1．ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu610075，China；2．InstituteofAgriculturalInformation
andRuralEconomy，SiehuanAcademyofAgricutureSciences，Chengdu610066，China)
Keywords：ArtemisiaannuaL．；SRAPreactionsystem；optimization
序列相关扩增多态性(sequencerelated
amplifiedpolymorphism，SRAP)是Li等Ⅱ3建立的
一种新型的分子标记技术，针对基因外显子中GC
量丰富而启动子、内含子中AT量丰富的特点来设
计引物，因不同个体的内含子、启动子与间隔区长度
不等而产生多态性。SRAP标记具有简便、稳定、中
等产率、在基因组中分布均匀的特点。适合于遗传多
样性研究、遗传图谱构建、基因定位、预测杂种优势、
cDNA指纹图谱等诸多研究领域[2~5]。目前已经在
马铃薯、水稻、柑橘类果树、黄瓜、棉花[6]、辣椒[7]等
植物和水稻稻瘟病[8]研究中应用，多集中于田
问作物，在药用植物中研究较少，且黄花蒿中未见
报道。
SRAP标记是基于PCR的标记，其反应条件易
受各种因素的干扰。为确保SRAP分析结果的可靠
性和重复性，进行SRAP—PCR反应体系的优化是非
常必要的。
青蒿来源于菊科植物黄花蒿Artemisiaannua
L．的干燥地上部分，味苦、辛，性寒，有清热解暑，除
虱，截疟的功能。其药用有效成分主要为青蒿素，被
WHO称为唯一有效的疟疾治疗药物。由于黄花蒿
的自交不亲和性，不同个体间存在遗传差异，这些导
致青蒿素在不同来源黄花蒿植株中的量存在差异，
遗传不稳定也是常规栽培中很难克服的难题[9]。因
此，对黄花蒿进行遗传育种方面的研究日益重要，有
必要构建高密度的遗传连锁图谱和进行黄花蒿遗传
多样性的研究。
本实验以黄花蒿为试材，对模板DNA、Taq
DNA聚合酶、dNTP以及M92+浓度，预变性，延伸
时间等的最佳反应条件进行探索，建立了适用于黄
花蒿的SRAP反应体系，为今后利用SRAP标记技
术开展黄花蒿种间遗传变异分析和构建遗传图谱奠
定了基础。
1材料与方法
1．1 材料：黄花蒿采自成都市，根据《中国植物志》
(第76卷)，并经成都中医药大学严铸云副教授鉴定
为黄花蒿ArtemisiaannuaL．，按Li等[1]提供的
SRAP引物序列由TaKaRa公司合成，Taq酶和反
应底物均购自TaKaRa公司。
1．2 黄花蒿总DNA提取：采用CTAB法提取总
收稿日期：2006—03—08
作者简介：邓婧(1982一)，女，四川成都，成都中医药大学药学院硕士，主要从事药用植物分子生物学研究。
Tel：(028)6668323E—mail：simplel016@sina．corn．un
*通讯作者陈新Tel：(028)66683823E—mail：chennew@tom．corn
万方数据
·126- 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
DNA。取约100mg冷冻的黄花蒿样品研成细粉，转
移至1．5mL离心管中，加入800肛LCTAB液，振
荡混匀，放置在65℃水浴中30min(约10min振荡
1次)，加入等体积的氯仿一异戊醇(24：1)，抽提两
次，10000r／min离心10min，将水相转移至另一干
净离心管中，在得到的水相中加入等体积的无水乙
醇，轻轻颠倒混匀，一20℃沉淀，取出样品在室温下
5000r／rain离心5min，使DNA附于管壁，小心去
上清，空气干燥，加入100弘LddH。O，37℃保温30
min，4℃保存备用。取10肛L，1．o％琼脂糖凝胶电
泳，电压140V，电流100mA，紫外灯下观察结果，
并用Totallabv2．01测定所提DNA的量约为30
ng／,uL。
t．3 PCR反应程序的优化：参考Li等[11的扩增程
序。94℃预变性·5min，94℃变性1min，35℃复性
1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，
50。C复性1min，72℃延伸lmin，35个循环，72℃
延伸1min。在Bio—RAD基因扩增仪上进行反应程
序优化。预变性时间为1、2、3、4、5min；最后延伸时
间为1、3、5、7、10min。
1．4 PCR反应体系的优化：在25pL反应体系中
加入2．5肚L的10倍Buffer(Mg抖free)缓冲液，2．0
mmol／LMgCl2，0．2mmol／LdNTPs，1UTaq酶，
模板DNA30ng，1．0／lmol／L引物，ddH：O加至25
弘L。以此体系为基础，按以下顺序逐级优化反应参
数，选择优化出的最佳参数做下一个参数优化：每反
应含模板DNA量分别为6、9、15、30、45、60、90、150
ng；每反应引物浓度分别为0．3、0．5、1、1．5、2．0、
2．5、3．0、4．0ttmol／L；每反应dNTPs终浓度分别
为0．05、0．1、0．15、0．2、0．25、0．3、0．35、0．4nimol／
L；每反应M92+浓度分别为0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、
3．0、3．5、4．0mmol／L；每反应TaqDNA聚合酶的
用量分别为0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．5U。
1．5扩增产物电泳分析：在2．0％的琼脂糖凝胶中
分离扩增产物，电泳结束后在凝胶成像系统下观察
照相。
2结果与分析
2．1模板DNA浓度对SRAP扩增的影响：适宜的
模板量是保证特异性扩增的前提，模板量过多会降
低特异扩增效率，增加非特异性产物。模板DNA小
于15ng时产物少，在30～105ng时扩增条带稳定
且几乎无差异(图1)，因此黄花蒿DNA在30～105
ng都可以，为节约模板，本实验采用模板为30ng。
2．2引物浓度对SRAP扩增的影响：用MEl一EMl
引物，比较了引物浓度差异对扩增结果的影响。引物
浓度小于1／tmol／L时扩增产物较少，在1．5～4．0
umol／L时条带清晰稳定(图2)，通过比较，选择引
物浓度为2．0umol／L。
M—Marker
1～9依次为：6、10、15、30、
45、60、75、90、105ng
引物(MEl～EMl)
1—9：6，10，15，30，45，
60，75，90，and105g，
respectively，Primer
(MEl一EMl)
图1模板DNA量对SRAP反应的影响
Fig．1EffectsofDNAconcentrationonSRAPpatterns
M—Marker
1～8依次为：0．3、0．5、1、
1．5、2．0、2．5、3．0、4．0
／lmol／L
引物(MEl～EMl)
1—8：0．3，0．5，1，1．5，
2．0，2．5，3．0，and
4．0／lmol／L，respectively，
Primer(MEl一EMl)
图 引物浓度对SRAP反应的影响
Fig．2EffectsofprimerconcentrationonSRAPpatterns
2．3 dNTPs浓度对SRAP扩增的影响：dNTPs浓
度直接影响PCR扩增产物的生成。dNTPs浓度不
足时，扩增产物减少，浓度过高时，会从两方面影响
PCR扩增：一方面错误率大大增加；另一方面同
TaqDNA聚合酶竞争M92+，使反应体系中的M92+
总量下降，TaqDNA聚合酶活性受到影响。dNTPs
浓度低于0．15mmol／L时扩增强度较低；在0．15～
0．25mmol／L时条带多且清晰，大于0．3mmol／L
时扩增产物明显减少(图3)。比较后选择dNTPs的
最佳浓度为0．25mmol／L。
M—Marker
1～8依次为：0．05、0．1、
0．15、0．2、0．25、0．3、0．35、
0．4mmol／L
引物(MEl～EMl)
1—8：0．05，0．1，0．15，0．
2，0．25，0．3，0．35，and
0．4mmol／L，respectively，
Primer(MEl一EMl)
图3 dNTPs浓度对SRAP反应的影响
Fig．3EffectsofdNTPsconcentrationonSRAPpatterns
2．4 M92+浓度对ISSR扩增的影响：反应混和物中
万方数据
中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月·127·
的离子强度，尤其是M92+浓度对SRAP反应的特
异性和扩增效率均有影响，浓度过高会使非特异扩
增产物增加或导致扩增失败，浓度过低会使扩增产
物减少或导致扩增反应失败。M92十是Taq酶的激活
剂，Mg抖不足时，Taq酶的作用效率降低，且dNTP
竞争Mg抖，Mg2+受dNTP总量的影响。M92+浓度
小于1．5mmol／L时无扩增；2．0mmol／L时条带清
晰稳定，大于2．5mmol／L时条带弥散变弱(图4)。
因此，Mg抖适宜浓度为2．0mmol／L。
M—Marker
1～8依次为：0．5、1．0、
1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0
mmol／L
引物(MEl～EMl)
1 8：0．5，1．0，1．5，2．0，
2．5，3．0，3．5，and4．0
mmol／L，respectively，
Primer(MEl一EMl)
图4 M92+浓度对SRAP反应的影响
Fig．4EffectsofM92+concentrationonSRAPpatterns
2．5 TaqDNA聚合酶对ISSR扩增的影响：Taq聚
合酶用量的多少直接影响PCR反应的成败，酶用量
过低导致扩增失败；酶量过高，使非特异性产物增
加。当酶用量小于0．5U时无扩增产物，在1．0时扩
增条带清晰稳定；当酶用量大于1．5U时产物弥散
(图5)。因此，Taq聚合酶的用量为1．0U最佳。
M—Marker
1～6依次为：0．5、1．0、
1．5、2．0、2．5、3．5U
引物(MEl～EMl)
lm6：0．5，1．0，1．5，
2．0，2．5，and3．5U，
respectively，Primer
(MElEMl)
图5 TaqDNA聚合酶量对SRAP反应的影响
Fig．5EffectsofTaqDNApolymerase
concentrationonSRAPpatterns
2．6预变性时间和延伸时间：用引物ME3一EM4考
察了预变性和延伸时间对SRAP反应的影响，结果
表明预变性时间和延伸时间对扩增结果无太大影
响，延伸时间在1～10min，变性时间在1～5min扩
增条带无太大差异。比较后选择预变性时间3min，
延伸时间为7min。见图6、7。
3讨论
以黄花蒿DNA为材料，建立了重复性好，分辨
率高的SRAP反应体系，即在25弘L反应体系中，模
板DNA为30～105ng，2．5弘L的lo倍Buffer
(M92+free)缓冲液，2．0mmol／LMgCl2，0．25
mmol／LdNTPs，1．0U乳g酶，2．0umol／L引物；
扩增程序：94℃预变性3min，94。C变性1min，35
℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性
1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循
环，72℃延伸7min。
M—Marker
1～5依次为：1、3、5、7、10
mln
1—5：l，3，5，7，and10
rain，respectively
图6延伸时间对SRAP反应的影响
Fig．6EffectsofamplificationtimeonSRAPpatterns
M—Marker
1～5依次为：1、2、3、4、5
mln
1—5：1，2，3，4，and5
min，respectively
图7预变性时间对SRAP反应的影响
Fig．7Effectsofinitiallydenaturingtime
onSRAPpatterms
对黄花蒿SRAP扩增影响最大的是dNTPs、
M92十、TaqDNA聚合酶浓度，引物的适宜浓度范围
比较宽，对DNA质量浓度要求不高，这与任羽等口3
对辣椒和武志朴等ho]对小麦的研究是相同的；预变
性时间和延伸时间没有太大影响，这与武志朴等[1们
对小麦的研究不同，原因可能是植物基因组大小或
所用仪器、试剂不同所致。黄花蒿的SRAP扩增程
序中开始5个循环退火温度为35℃，确保两引物与
靶DNA上位点的结合，后35个循环的退火温度上
升到50℃，从而保证了反应稳定可重复性，如果退
火温度在40个循环中始终保持35℃，则扩增的重
复性会很差。
SRAP是对ORFs开放阅读框进行扩增，对基
因相对较少的着丝粒附近及端粒的扩增较少，如结
合可扩增这些区域的SSR标记，可获得覆盖整个基
因组的连锁图。在遗传多样性研究中，SRAP比
万方数据
·128· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
AFLP更能反映表型的多样性及进化史rs]。由于省
去了酶切，连接等的步骤，整个方法比AFLP操作
简单，相比之下，具有更广泛的应用前景。
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前体和诱导子饲喂黄芩愈伤组织强化黄芩苷生产研究
王梦亮，任撂兴，刘滇生
(山西大学现代化学研究所，山西太原030006)
黄芩Scutellariab icalensisGeorgi为唇形科植
物的干燥根，性寒、味苦，具有清热燥湿、泻火解毒等
功效[1]，含数种黄酮苷。黄芩苷(baicalin)是其主要
有效成分，药理作用最强，具有抑菌抗炎[2]、抗HIV一
1活性‘“4|、抗氧化[5|、抗变态反应[6]和清除自由基[73
等药理作用。因此近年来，临床上对黄芩药材的需求
量大增，黄芩野生资源破坏严重，产量日趋下降，有
的产区种群已濒临灭绝[8]，因此利用植物组织培养
技术对黄芩进行组织培养来生产其有效成分是解决
目前供需矛盾的有效途径之一。
在植物细胞培养中，向培养基中加入目的化合
物生物合成的前体及应用诱导子是提高有用次生代
谢产物产量的有效途径。目前在黄芩愈伤组织培养
研究中，尚未见相关的报道。本实验研究了3种前体
和3种诱导子对黄芩愈伤组织合成黄芩苷的影响，
旨在为黄芩苷的工业化生产提供理论依据。
1材料与方法
1．1 材料：黄芩愈伤组织由本实验室从黄芩试管苗
幼茎诱导而来。培养基为MS培养基(附加0．2rag／
LIAA和2mg／L6-BA)，蔗糖4％，琼脂0．8％，pH
5．8，暗培养，(25士1)℃培养周期为40d。
1．2添加前体和诱导子实验设计：前体物为乙酸
钠、L一苯丙氨酸和酪氨酸；浓度梯度为0．1、0．5、
1．0、2．0mmol／L。诱导子为硝酸铈铵、水杨酸和硝
酸银；浓度梯度分别为0．01、0．1、0．5mmol／L；
0．1、1．0、10mmol／L；0．01、0．05、0．1mmol／L。
将新鲜黄芩愈伤组织接种于添加各种前体和诱
导子的固体培养基中并立即置于培养箱中暗培养，
处理时间为40d。对照为不添加任何前体或者诱
导子。
1．3干、鲜质量测定方法：将培养完成的愈伤组织
用滤纸将表面的水吸去，放在天平上，称其鲜质量，
随后放入烘箱(60℃)烘烤至恒重，再称其干质量，
并可得到细胞的干质量比。
1．4 HPLC法测定黄芩苷
1．4．1 色谱条件[1]：ODS色谱柱(150mm×4．6
收稿日期：2006—03—10
作者简介：王梦亮(1966一)，汉，男，山西平遥人，硕士生导师，长期从事中草药的研究开发，生物化工等领域的科研工作。
Tel：(0351)7016101E—mail：mlwang@SXU．edu．ca
万方数据
黄花蒿SRAP-PCR反应体系的建立与优化
作者： 邓婧， 陈新， 宣朴， DENG Jing， CHEN Xin， XUAN Pu
作者单位： 邓婧,陈新,DENG Jing,CHEN Xin(成都中医药大学药学院,四川,成都,610075)， 宣朴,XUAN
Pu(农业信息与农村经济研究所,四川成都 610066)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(1)
被引用次数： 8次

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