全 文 ：·1856· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
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姜黄素对肿瘤坏死因子一a所致人脐静脉内皮细胞凋亡的影响
张丽，梁中琴，顾振纶
(苏州大学医学院药理学教研室苏州大学衰老和神经疾病实验室苏州中药研究所，江苏苏州 215123)
摘要：目的观察姜黄素对肿瘤坏死因子一a(TNF—a)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用。方
法建立TNF—U致HUVEC损伤模型；MTT检测细胞的存活率；光镜观察细胞形态的改变；流式细胞术检测细胞
凋亡峰；Hoechst33258染色荧光显微镜检测凋亡的细胞核；RT—PCR检测caspase一3基因的表达。结果姜黄素处
理组与TNF—n组比较其HUVEC贴壁良好；荧光显微镜下可见凋亡小体减少；流式细胞术检测凋亡峰明显降低；
caspase一3基因表达下调。结论姜黄素对TNF—a所致的HUVEC凋亡具有保护作用，该作用可能是通过下调
caspase一3的基因表达而实现的。
关键词：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)；凋亡；TNF—a
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)12—1856—04
EffectofcurcuminonTNF-a-inducedapoptosisfhumanumbilicalveinendothelialcells
ZHANGLi，LIANGZhong—qin，GUZhen—lun
(DepartmentofPharmacologyandLaboratoryofAgingandNervousDiseases，SchoolofMedicine，SoochowUniversity；
SuzhouInstituteofChineseMateriaMedica，Suzhou215123，China)
Keywords：humanumbilicalveinendothelialce ls(HUVEC)；apoptosis；TNF—a
脑血管疾病是危害人类健康的主要疾病之一，
具有较高的病死率和致残率。内皮细胞损伤是脑血
管疾病发生的首要环节。脑卒中、神经退行性疾病帕
金森病(Parkinson7sdisease，PD)、阿尔茨海默病
(Alzheimer
7
s disease，AD)、亨廷顿舞蹈症
(Huntington’sdisease，HD)与内皮细胞氧化损伤
有重要的关系[1’2]。血管内皮细胞是一种代谢活跃的
细胞。高血糖、缺氧、细胞内中毒、氧化修饰型低密度
脂蛋白(ox—LDL)、肿瘤坏死因子一a(TNF—Q)都可
促进内皮细胞凋亡[3~6]。内皮细胞凋亡与增殖之间
的动态平衡维持着内皮细胞数量的稳定和血管功能
的正常。然而内皮细胞凋亡过度既是内皮细胞功能
失调的始动环节，又是动脉粥样硬化及冠心病、脑卒
中发生、发展的细胞学基础[7’8]。在中枢神经系统疾
病中，细胞因子TNF—a常常起着启动和加速作用，
其增多可直接或间接地作用于神经胶质细胞、巨噬
细胞、血管内皮细胞，从而产生更多的自由基、补体、
蛋白酶等而加重脑损伤。
目前炎症和氧化应激在脑卒中及神经退行性疾
病的发生发展中起着十分重要的作用。姜黄素依靠
其良好的抗氧化和抗炎等作用，在脑保护及治疗脑
血管病方面具有良好的应用前景[9]。本研究通过
TNF—a刺激内皮细胞凋亡，观察姜黄素对内皮细胞
凋亡的影响。
1材料
姜黄素(质量分数99％，Sigma公司产品)，用
DMSO溶解，配成1mg／mL的溶液，4℃冰箱保
存。临用时，以完全培养液稀释。BX一51型荧光显
收稿日期：2007—04—25
作者简介：张丽(197l一)，女，河南省鹿邑人，硕士，讲师，研究方向为神经药理。
Tel：(0512)65880119Fax：(0512)65880406E—mail：liangzhongqin@suda．edu．cn
万方数据
中革菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月·1857·
微镜，Olympus；EPICSXL流式细胞仪，Coulter美
国；DG3022型酶联免疫检测仪，国营华东电子管厂
产品。MTT、RnaseA、蛋白酶K均为Sigma产品；
Hoechst33258染色试剂盒，碧云天生物技术有限
公司产品。
2方法
2．1 内皮细胞培养：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)
按Risso等D03改良的方法培养。无菌条件下取新生
儿脐带(20～25cm)，剪去两端钳痕，用PBS(磷酸
盐缓冲盐水)冲洗脐带内的残血，0．1％胶原酶溶
液10mL充满静脉，37℃温浴15min。收集消化液
并用含5％血清的PBS冲洗静脉，合并两液，1000
r／min离心10min，弃去上清液，用含有20％小牛
血清、青霉素(100U／mL)一链霉素(100pg／mL)、
0，002％内皮细胞生长因子的M131培养液，于
37℃、5％C0。条件下培养，次日换液，以后每2～3
天换液1次，至细胞融合单层用于实验。
2．2 MTT法检测HUVEC的存活率：用含10％
灭活新生小牛血清的M131完全培养液调细胞浓度
为2×105／mL，将100弘L细胞悬液加入96孔培养
板中，37℃、5％CO。条件下培养过夜，待细胞长至
融合进行分组。对照组(给予常规M131完全培养
液)；TNF一理组(TNF—a100ng／mL)；实验组在
TNF—a刺激的基础上加入不同质量浓度的姜黄素
12．5、25、50、100、200弘g／mL，每组设6个平行孔，
37℃、5％C0。条件下培养48h。实验终止前4h加
入10弘LMTT(5mg／mL，PBS配制无菌滤过)，4
h后用10％SDS(含0．01mol／LHCl)中止反应，
以DG3022A酶标仪于570nm波长处检测吸光度
(A)值。计算存活率(存活率一实验组A值／对照组
A值×i00％)。
2．3 光镜下观察细胞的形态学改变及Hoechst
33258染色检测细胞凋亡情况：普通洁净盖玻片将
其置于6孔板内，每孔接种2×105／mLHUVEC悬
液，37℃、5％CO：条件下培养过夜，使盖玻片上铺
满细胞达80％以上。实验分组：对照组(给予常规
M131培养液)；TNF—a组(给予TNF—alOOng／
mL)；用药组[姜黄素(50pg／mL)+TNF—a(100
ng／mL)]，继续培养24h(诱导HUVEC凋亡)。吸
尽培养液，加入0．5mL固定液，固定2h。去固定
液，用PBS洗两遍，每次3rain，吸尽液体。加入0．5
mLHoechst33258染色液，染色15min。滴一滴抗
荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻
片。光镜下观察细胞的形态学改变，荧光显微镜检测
各组呈蓝色细胞核的细胞。
2．4流式细胞仪检测细胞凋亡：用含10％灭活新
生小牛血清的M131完全培养液调细胞浓度为2×
105／mL，将细胞悬液加入6孔培养板中，37℃、5％
CO。条件下培养过夜，待细胞长至融合进行分组：对
照组(给予常规M131完全培养液)；TNF～a组
(TNF—a100ng／mL)；实验组在TNF—a刺激前
0．5h加入姜黄素50pg／mL。药物作用24h后收
集细胞，PBS清洗，70％冰乙醇固定；PBS悬浮细
胞、l500r／min离心洗涤6min、再悬浮；碘化丙啶
综合染液(PI、RNase、Tritonx一100)一步法染色
30min[113；300目尼龙筛网滤过，流式细胞仪检测。
数据由LYSIS11软件分析处理。
2．5 RT—PCR法检测姜黄素对HUVECcaspase一3
基因表达的调控作用
2．5．1 HUVEC凋亡的诱导：取生长良好的
HUVEC，置75cm2培养瓶中进行培养，待细胞长至
融合后分组，对照组给予常规培养液培养；TNF—a
组给予TNF一。c(100ng／mL)；用药组预先0．5h给
予不同质量浓度的姜黄素+TNF—a(100ng／mL)，
使药物终质量浓度分别为25、50、100pg／mL，培养
24h，用胰酶消化后收集HUVEC，细胞计数应在
5×107左右。
2．5．2 RT—PCR方法检测：RT反应体系为40
弘L：5×buffer缓冲液4弘L，4种dNTP混合液(10
mmol／L)4肛L，MgClz(15mmol／L)4弘L，随机弓|
物2弘L，M—MLV反转录酶1pL，eDNA的产物10
弘L，加双蒸水至40pL。反应条件：95℃，5rain；
42℃，60rain；72℃，10rain。PCR反应体系50肛L：
IOXbuffer缓冲液5止，4种dNTP混合液(10
mmol／L)5弘L，MgCl2(15retool／L)5弘L，caspase一
3正向引物2弘L，easpase一3反向引物2弘L，p-aetin
正向引物2pL，pactin反向引物2弘L，Taq酶1
弘L，加双蒸水至50pL。PCR引物均由上海生工生
物科技有限公司合成。caspase一3正向引物为5’一
TTCAGAGGGGATCGTTGTAGAAGTC一3’，反肉
引物为5I-CAAGCTTGTCGGCATACTGTTT—
CAG一3，扩增产物263bp；pactin正向引物为57一
TTCAGAGGGGATCGTTGTAGAAGTC一3’，反向
引物为5t-CAAGCTTGTCGGCATACTGTTT—
CAG一37，扩增产物309bp。在配制琼脂糖时加入溴
化乙锭(EB，0．5弘g／mL)，PCR扩增产物在2％琼
脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统扫描，用
BANDLEADER3．0进行灰度分析。
万方数据
·1858· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
3结果
3．1 对HUVEC存活率的影响：MTT实验结果显
示，与对照组相比，TNF—a组细胞存活率明显降低
(P组细胞存活率高，且呈现剂量依赖性趋势。姜黄素
200pg／mL时细胞存活率达到(67．73±6．95)％
(PHUVEC的存活率，减轻其所致的损伤。见表1。
表1 姜黄素对TNF—a损伤的HUVEC存活率的影响
(；±s，痒一6)
Table1 EffectofcurcuminonsurvivalrateofHUVEC
injuredbyTNF—CXG+s，露一6)
组别p／(t*g·mL-1)A值 存活率／％
与对照组比较：△oP与TNF—a组比较：。|P△△P<0．01口scontrolgroup
。P<0．05。。P<0．01USTNF一“group
3．2对HUVEC形态学的影响
3．2．1 光镜观察结果：在实验观察期闯，对照组
HUVEC始终呈梭形贴壁生长(图1一A)；而TNF—a
(100ng／mL)培养的HUVEC，细胞由梭形变圆，继
而脱离瓶壁悬浮于培养液中，贴壁的HUVEC明显
减少(图1一B)。姜黄素(50／生g／mL)处理的TNF—a
组的HUVEC贴壁良好，细胞形态与对照组相比未
见明显的差别(图1一C)。
A一对照组 B—TNF—a组C—TNF—a+姜黄黍组
A—controlgroupB—TNF一“groupC—TNF—a+curtuming o p
图1 HUVEC细胞生长状态
Fig．1Growths atusofHUVEC
3．2．2荧光显微下观察HUVEC凋亡结果：TNF—
q(100ng／mL)处理24h的HUVEC可观察到部
分细胞出现染色质浓缩，断裂的染色质形成粗细不
均的颗粒弥漫于胞浆；部分细胞核固缩，形成致密浓
染的凋亡细胞核，而对照组及姜黄素组HUVEC均
未觅凋亡的细脆核。
3．3 姜黄素抑制TNF—a诱导的HUVEC凋亡：
TNF—a(100ng／mL)处理HUVEC24h，HUVEC
呈现出凋亡特征的亚二倍体峰，表明有部分细胞发
生凋亡。而姜黄素(50tLg／mL)+TNF一0t(100ng／
mL 组的HUVEC流式细胞仪直方图上凋亡峰降
低。对照组未见调亡峰。结果见表2。
表2姜黄素对TNF—a损伤的H．UVEC细胞凋亡的
影响(；士F，一一3)
Table2 EffectofcurcuminonapoptosisfHUVEC
injuredbyTNF—aG+s，一一3)
与对照组比较：6△尸△△P<0．01wcontrolgroup：‘P<0．05USTNF一8group
3．4姜黄素抑制HUVEC的caspase一3基因的表
达：caspase一3基因RT—PCR产物电泳结果见图2一
A，对照组未见明显条带出现。与对照组相比，经
TNF一0c处理24h的HUVEC检测到caspase一3上
调，而预先0．5h加入不同质量浓度的姜黄素组
(25、50、100／Mg／mL)对TNF—a激活的HUVEC表
达caspase一3有抑制作用，在姜黄素(50、100孵／
mL)组对caspase一3有明显抑制作用(P<0．05)，
内参照pactin的结果表明各组的RNA定量基本
一致，见图2一B。
A一电泳图B一定量分析l一对照组 2-TNF—q组3～5-TNF—
n+姜黄素(25、50、100pg／mL)与对照组比较：。P<0．05
A—-etectrophoregramB--quantitatiyean lysis1-controlg up
2-TNF-agroup3—5一TNF-a+curcumin(25，50，and100vg／
mL)。P<0．05wcontrolgroup
图2 HUVEC的c嬲p嬲e一3tuRNA基因表达
Fig．2Caspase-3mRNAexpressionofHUVEC
4讨论
研究发现一些炎症细胞因子，如TNF—a可导致
内皮细胞损伤[1¨。目前认为TNF一口是引起血管损
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月·1859·
伤的主要成分，在病理状态下，TNF—a可导致血管
内皮细胞、血管平滑肌的损伤。TNF—a在许多疾病
如缺血再灌注、炎症、动脉粥样硬化、脑卒中、神经退
行性病变如阿尔茨海默病、帕金森病的发生发展过
程中起着重要的作用。本研究发现用TNF—a刺激体
外培养的HUVEC诱导其凋亡后，光镜下可见细胞
由梭形变为圆形，继而脱离瓶壁悬浮于培养液中，细
胞核呈固缩、碎裂状，贴壁细胞减少；荧光显微镜可
见凋亡小体形成。而预先使用姜黄素组HUVEC细
胞形态则未见明显改变，凋亡小体明显减少。提示姜
黄素对TNF—oc诱导的内皮细胞凋亡具有保护作用。
在细胞凋亡的信号传递过程中半胱氨酸蛋白酶
(caspase)家族在整个细胞凋亡过程中起中心杀手
作用。在正常的状态下，它们以无活性的酶原形式存
在，凋亡信号刺激其特异性天冬氨酸残基处被剪切
后激活。上游的caspase就能次序地激活其他下游
的caspase，形成caspase级联反应，将凋亡信号传
至凋亡底物，由此引发瀑布式连锁反应，进而激活
caspase一3等，后者成为凋亡信号的最终执行者。本
实验结果显示TNF—a刺激HUVEC细胞凋亡后
caspase一3表达与对照组相比明显增强，而经姜黄素
预处理的HUVECcaspase一3表达明显下降。提示
姜黄素是通过抑制caspase一3的表达而减少细胞凋
亡的，其对HUVEC的保护作用可能与其对凋亡信
号的最终执行者caspase一3的抑制作用有关。
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文冠果果壳乙醇提取物对大鼠学习记忆障碍的改善作用
刘新霞1”，纪雪飞1，陆玲玲1，杨柏珍3，王力华3，邹莉波p
(1．沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁沈阳110016；2．河北大学医学部，河北保定071000；
3．中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳110016)
摘 要：目的 研究文冠果果壳乙醇提取物(EEHXs)对双侧颈总动脉结扎大鼠学习记忆障碍的改善作用及其作
用机制。方法用DigBehv动物行为分析系统分析大鼠的自发活动，Y迷宫法及Morris水迷宫法测试大鼠的学习
记忆能力，比色法检测大脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)、乙酰胆碱酯酶(AchE)的水平，
尼氏染色观察海马组织形态学改变。结果模型组大鼠自发交替反应正确率、空间记忆能力和工作记忆能力显著
降低，SOD活性显著下降，MDA和AchE水平显著升高，海马神经元变性、脱落；EEHxS显著改善大鼠的学习记
忆能力、提高s0D活性、降低MDA和AchE水平，显著抑制海马神经元的变性及脱落。结论EEHXS对双侧颈
收稿日期：2007—04—07
作者简介：刘新霞(1976一)，女，在读硕士，研究方向为神经、精神药理学及中药药理学。
*通讯作者邹莉波Tel：(024)23986260E—mail：libozou@163．com
万方数据
姜黄素对肿瘤坏死因子-α所致人脐静脉内皮细胞凋亡的影响
作者： 张丽， 梁中琴， 顾振纶， ZHANG Li， LIANG Zhong-qin， GU Zhen-lun
作者单位： 苏州大学医学院,药理学教研室,苏州大学衰老和神经疾病实验室,苏州中药研究所,江苏,苏
州,215123
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(12)
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