全 文 ：中草芮 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月·1727·
玉竹及其掺伪品的RAPD鉴定
王润玲，唐铖，周 晔+，刘 奇，安适之
(天津医科大学药学院，天津300070)
摘要：目的探索鉴别玉竹及其掺伪品热河黄精、黄精等药用植物的方法。方法采用显微鉴定和RAPD技术
进行药材鉴别。结果通过所选引物进行PCR扩增，可以获得特异性的谱带，将玉竹及其主要掺伪品热河黄精、黄
精区分开。结论建立的该分析方法可用作区分玉竹及其掺伪品的依据。
关键词：玉竹f显微鉴定；RAPD
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)11—1727—03
IdentificationofrhizomefPolygonatumodoratumanditsadulterantsbyRAPD
WANGRun—ling，TANGCheng，ZHOUYe，LIUQi，ANShi—zhi
(CollegeofPharmacy，TianjinMedicalUniversity，Tianjin300070，China)
Keywords：RhizomaPolygonatiOdorati；microscopicidentification；RAPD
玉竹始载于《神农本草经》，列为上品。玉竹性
甘、微寒，归肺、肾二经，有滋阴润燥、生津止渴之功
效。经现代研究表明玉竹有降血糖、调血脂、免疫调
节等药理活性C1]。据《中国药典》2005年版记载玉竹
的来源应为百合科植物玉竹Polygonatum
odoratum(Mill．)Druce的干燥根茎[z]。由于该属植
物外形相近，玉竹等黄精属生药显微特征只有细微
的不同。古今均将黄精属多种具互生叶而根茎圆柱
状者如热河黄精P．macropodiumTurcz．、黄精P．
sibiricumDelar．exR doute等作玉竹入药，造成玉
运用分子标记技术研究黄精属部分植物卧]，但未见
玉竹与热河黄精等掺伪品鉴别的研究报道。本实验
采用传统方法与分子标记技术相结合将玉竹及其掺
伪品热河黄精、黄精区分开，并建立植物DNA提取
的新方法。
1材料与仪器
1．1 材料：本实验的样品采自河北省、江西省山区
和北京植物园，样品来源及其特征见表1。所有植物
的根状茎均经75％酒精灭菌并用蒸馏水充分漂
洗，储存于一20℃备用。
竹品种混淆、鉴别困难，影响临床疗效‘3|。此前曾有 1．2试剂及其配制：琼脂糖(Promega公司)、Taq
表1玉竹及其掺伪品的主要特征
Table1 MaincharactersofrhizomefP．odoratumnditsadulterants
酶、dNTP、随机引物、DL一2000(宝生物公司)、EB
(Sigma公司)，其他试剂为分析纯。CTAB提取液：
2％CTAB，100mmol／LTris—HCI，pH8．020
mmol／LEDTA，1．4mol／LNaCl，2％二巯基乙
醇，pH8．0；CTAB／NaCl溶液：10％CTAB，0．7
mol／LNaCl；CTAB沉淀剂：1％CTAB，50mmol／
LTris—HCI，10mmol／LEDTA，pH8．0；高盐TE
缓冲液：10mmol／LTris—HCl，10mmol／LEDTA，
1mol／LNaCI，pH8．0。
1．3 仪器：万能研究显微镜(Olypuswvanox)，
收稿日期：2006—04一01
基金项目：天津市卫生局基金资助项目(03009)}天津医科大学科学基金资助项目(2003KY4)
作者筒介：王润玲(1959一)，女，天津市人，教授，天津医科大学药学院副院长，硕士生导师，研究方向为药物化学和中药有效成分分析。
*通讯作者 周 哗 Tel：(022)23529697E—mail：zhouye@tijmu．edu．ell
万方数据
·1728· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月
QI。一901型漩涡混合器(江苏海门麒麟医用仪器
厂)，TGL一16G型台式高速离心机(上海医用分析
仪器厂)，HH一42型快速恒温数显水箱(常州国华
电器有限公司)，日本岛津UV一240紫外分光光度
仪，9600型PCR仪(PE公司)，GDS8000凝胶成像
分析系统。
2方法
2．1 显微鉴定：截取1cm3的根状茎，投入F．A．A
固定液中固定24h。取出后用流水冲洗，乙醇脱水。
用熔点58C的石蜡包埋，上滑走切片机。切后用
1％番红、2％淡绿染色，中性树胶封片。用Olypus
wvanox万能研究显微镜PM一10AD照像系统
拍照。
2．2 RAPD分析
2．2．1DNA提取：取0．1g植物根茎置于一80‘C
预冻40rain，迅速置于白瓷乳钵并加入2mL
CTAB提取液，研磨至粉碎，置于65℃水浴60
rain，并不断振荡使之充分反应；取出后加入等体积
CHCl。一异戊醇(24：1)溶液，10000r／rain离心5
rain，取上层液，重复抽提2次至澄清．力Ⅱ入1／10体
积，65C预热的CTAB／NaCl溶液混匀，再加入等
体积CHCl。一异戊醇(24：1)溶液抽提，10000r／
rain离心5rain，取上层液，加入等体积CTAB沉淀
剂，于65℃水浴30rain，4000r／rain离心10rain；
取沉淀，加入500pL高盐TE，混匀，再加入0．6体
积的异丙醇，小心振摇，10000r／min离心15rain。
用80％乙醇清洗沉淀，挥干，用100弘I。TE(10，1)
溶液溶解，可得DNA溶液，并将样品浓度稀释至
5ng／vI。。
2．2．2PCR：PCR反应体系共20pI。，包括：20ng
DNA模板、1mmol／L引物、2弘L10×PCR缓冲液
(含M92+)、0．25mmol／I。dNTP混合物、1UTaq
酶、10pI。高压水，混匀。在PCR一9600上扩增，扩增
程序：第1阶段，预变性94℃、5rain；第2阶段，每
个循环94C变性1rain，37C退火1rain，72‘C
延伸2rain，共5个循环；第3阶段，每个循环94℃
变性15S，37‘C退火1rain，72‘C延伸2rain，共
40个循环；第4阶段，72C继续延伸7rain；4℃
储存。
2．2．3凝胶电泳：配置1．8％琼脂糖凝胶(含EB
1pg／mL)．Marker加入另一个加样孔作参照。在
lxTAE缓冲液中电泳，电泳电压70V，采用
GDS8000UVP紫外摄像分析系统下观察、照相。
3结果与分析
3．1显微鉴定：结果见图1、2(横切放大倍数lo×
10，针晶放大倍数10×40)。玉竹的维管束以外韧型
为主，热河黄精的维管束大多为外韧型，少数周木
型，针晶大小亦有所不同，但这些差别可因地理位
置，气候条件的不同发生二定的变异。
图1玉竹P．odoratum(九山顶)昱微图
Fig．1Microscopicidentificationofrhizome
ofP．odoratum(Jiushanding)
图2热河黄精P．macropodium(雾灵山)显微图
Fig．2MicroscopicidentificationofP．macropodium
(Wulingshan)
3．2 PCR：经筛选23种引物，并用其进行PCR反
应，从产生的多态性条带可以看出，玉竹与其主要掺
伪品热河黄精、黄精等的亲缘关系较近，这与它们的
性状特征和显微特征相近是一致的。由于所采集植
物的遗传特征已经发生了一定的变异，通过所产生
的多态性条带，可对所采植物进行区分。其中引物
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月·1729·
$22(TGCCGAGCTG)、$27(GAAACGGGTG)的
PCR结果稳定，可用作区分本次采集的玉竹及其掺
伪品的依据。
在对所采集的玉竹与热河黄精的PCR扩增产
物分析后可以看到，以$27作为引物进行扩增时，
在750～1000bp有一条热河黄精的特异条带，见
图3。另外，采用此种引物扩增不同条件下生长的玉
竹DNA模板并未表现出差异性，从而为其人工种
植提供了实验依据。在黄精与玉竹的鉴别方面，本实
验采用多个引物都可将二者区分开。如二者经引物
$22扩增，在250～500bp范围内得到黄精只扩增出
有一条谱带，而玉竹则可以得到两条谱带，见图4。
1、2-热河黄精(雾灵山)
3一玉竹(栽培)4-玉竹
(九江) 5-玉竹(雾灵
山) 6～8一黄精(3叶，
4叶，5叶)9-Marker
1， 2-P． macropodium
(Wulingshan)3-rhizo—
meofP．odorati(eul—
ture)4一P．odoratum
(Jiujiang)5-P．odora—
turn(Wuling—shan)
6—8一P． sibiricum(3
leaves．4leaves．5
leaves)9一Marker
图3引物$27产生的结果
Fig．3ResultofPremier$27
1～4一黄精(3叶，4叶，5
叶，6叶) 5～6一玉竹
(栽培) 7-玉竹(九山
顶)8-玉竹(雾灵山)
9一Marker
l一4一P．sibiricum(3
leaves，4leaves，5
1eaves，6leaves)5—
6-rhizomeofP．odora—
turn(culture)7-P．
odoraturn(Jiushanding)
8一rhizomefP．odorati
(Wulingshan)
9一Marker
图4 引物$22产生的结果
Fig．4ResultofPremier$22
3．3 由于植物中次生代谢产物——多酚类化合物
可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物
DNA纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、
连接酶及DNA聚合酶等酶类的生物活性。因而本
实验采用的是在Doyle[51的基础上改进的CTAB提
取法。CTAB是一种阳离子去污剂，能与核酸形成
复合物，这些复合物在低盐溶液中会因溶解度的降
低而沉淀，在高盐溶液中可解离，使DNA和多糖分
开，再用乙醇沉淀DNA除去CTAB，这样可有效避
免多酚类化合物介导的DNA降解[6]。本实验利用
CTAB这一性质，并在提取过程中多次通过氯仿一异
戊醇溶液提取蛋白质等有机物杂质逐步将各种植物
的模板DNA提纯，再通过沉淀模板DNA除去
CTABO这样不仅可以获得较纯的模板DNA，而且
可有效地避免DNA降解。此外，向样品加入适当比
例、预冷的异丙醇处理可使DNA较快地沉淀出来，
而蛋白、多糖以及CTAB等提取试剂则大部分残留
在溶液中。这对于最终获得高质量的DNA也有一
定的促进作用。虽然该方法的提取步骤较复杂，但对
于提取试剂的要求不高。一般方法裂解细胞，需要用
蛋白酶K来消化蛋白质或降解一些细胞组分，而后
通常用酚一氯仿溶剂抽提。分离成两相后，核酸在水
相中。用乙醇沉淀法做进一步纯化，再重新溶解在适
宜的缓冲液中。本实验在提取过程中未采用蛋白酶
K，苯酚等试剂，不仅避免了干扰，而且仍获得了纯
度较高的DNA。一般做植物多态性等研究时，通常
提取新鲜植物的叶绿体DNA，但本实验建立的提
取方法即使根茎部含有大量的多糖，蛋白质等干扰
物质，也能提取到足够量的DNA，所得到的DNA
纯度仍能达到生物学实验技术要求。另外，对常温放
置一年以上的玉竹、黄精等根茎的DNA进行提取，
结果表明本法同样适用。这对玉竹等根茎人药的药
用植物很有意义，在生药采收后，人们可从人药部位
提取遗传物质进行药材真伪鉴定。
玉竹的来源较多，分类混乱，运用传统方法鉴别
较为困难，通过提取所采样品药用部位的DNA，运
用分子生物学技术，建立了玉竹及其掺伪品的快速、
准确的鉴别方法。
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万方数据
玉竹及其掺伪品的RAPD鉴定
作者： 王润玲， 唐铖， 周晔， 刘奇， 安适之， WANG Run-ling， TANG Cheng， ZHOU Ye，
LIU Qi， AN Shi-zhi
作者单位： 天津医科大学药学院,天津,300070
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(11)
被引用次数： 8次

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引证文献(8条)
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