全 文 ：中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第8期2007年8月·1163·
制剂与质量
梅花鹿鹿茸中促进海马神经细胞增殖蛋白的分离纯化
严铭铭1，曲晓波1，钟英杰1，赵大庆r，刘宁2，刘志强2，刘淑莹2
(1．长春中医药大学研发中心，吉林长春130117；2．中国科学院长春应用化学研究所，吉林长春130023)
摘要：目的研究梅花鹿鹿茸中蛋白的分离纯化和促进细胞增殖的生物活性。方法采用硫酸铵分级沉淀法提
取鹿茸蛋白，蛋白组分经过DEAESepHaroseFa tFlow、SepHacrylS一200和Affi—gelBluGel柱色谱分离纯化。结
果分离得到3个单一蛋白化合物CNTPI、CNTPⅡ、CNTPm。结合激光解析电离飞行时间质谱和SDS一聚丙烯
酰胺凝胶电泳确定其相对分子质量分别为6．7018×104、4．3749×104、2．3855×104。分析了CNTPm的氨基酸组
成，采用Edman测序法测定N末端氨基酸序列为GDRGTAAKHALDEEP。CNTPⅢ具有促进小鼠海马神经细胞
(HT22)增殖的作用。结论CNTPⅢ是具有促进细胞增殖的新蛋白。
关键词：梅花鹿；鹿茸；蛋白；生物活性
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)08—1163一05
Separationandpurificationofpr teinpromotingh ppocampusnervecell
proliferationfrompiloseantlerofCervusnippon
YANMing—min91，QUXiao—b01，ZHONGYing—jiel，ZHAODa—qin91，LIUNin92，
LIUZhi—qian92。LIUShu—yin92
(1．CenterofResearchandDevelopment，ChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine，Changchun130117，
China；2．ChangchunI stit teofAppliedChemistry，ChineseAcad myofSciences，Changchun130023，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheseparationandpurificationof heproteinsfrompiloseantler
ofCervusnipponandtheircellproliferationpromotingb oactivities．MethodsThpiloseantlerofC．咒i步
ponwasextractedandpurifiedbyacombinationofammoniumsulfatefractionation，ion—exchangechro—
matographyDEAESepharoseFa tFlow，gelfiltrationchromatographySephacrylS一200，andAffi—gelBlue
Gelchromatography．ResultsThr eproteinsnamedCNTPI，CNTPⅡ，andCNTPⅢwereisolated．
Theirrelativemolecularweightswere6．7018×104，4．3749×104，and2．385X104，whichwere
assessedbyMALDI—TOF—MSandSD —PAGE．AminoacidcompositionsofproteinCNTPⅢwereana—
lyzed．N—terminalEdmandegradationofproteinCNTPnl showeditsaminoacidsequence
GDRGTAAKHALDEEP．Thebioactivitytes sofproteinCNTPⅢshowedsignificantlystimulanteffects
ontheproliferationofnervecellsHT22inmice．ConclusionProteinCNTPⅢisanewproteinpromoting
eellproliferation．
Keywords：CervusnipponTemminck；piloseant er；protein；bioactivity
鹿茸始载于《神农本草经》，是我国的传统名贵
中药，具有增强体力，提高机体免疫能力，抗衰老，改
善性功能，抗炎，加速创伤和溃疡愈合，促进骨质修
补，增强中枢神经系统和心血管系统的功能，抗肿
瘤，增强胃肠功能和肾脏的利尿功能等作用r1]。鹿茸
中的化学成分复杂，其中粗蛋白占干重的50％以
上比]，梅花鹿茸中粗蛋白占干重高达61．24％-3]。相
关报道仅有从鹿茸中分离了几个粗蛋白和粗多
肽[1“’5]，以及从马鹿鹿茸中分离出两个相对分子质
量为3215．8和3095．1的多肽，并做了初步的活性
研究卟’7]。本实验结合拟开发梅花鹿鹿茸抗衰老蛋白
类制剂项目，采用生物化学分离手段从梅花鹿茸中
分离纯化蛋白，为进一步开发鹿茸中高活性药物提
供参考。
1材料与仪器
鲜鹿茸由吉林东丰药业提供，经长春中医药大
学邓明鲁教授鉴定为梅花鹿CervusnipponTem—
mine鹿茸；HT22细胞株引自日本，MTT购自瑞士
收稿日期：2006—12—13
基金项目：国家科技部十五攻关重大项目(2004BA907A17)
作者简介：严铭铭，女(满族)，哈尔滨人，博士，研究方向为中药化学及新药开发。Tel：(0431)86172421
*通讯作者赵大庆E—mail：yanmm595@yahoo．com．cn
万方数据
·1164· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第8期2007年8月
Fluka公司，胰蛋白酶购自Sigma公司，相对分子质
量标准蛋白、Affi—gelBlueGel购自Bio—Rad公司，
DEAE—SepharoseF stFlow和SephacrylS～200HR
购自Phamacia公司，其他试剂均为分析纯或生化
试剂。
J一25高速冷冻离心机(Beckman公司)，
Baselin810氨基酸自动分析仪，Millipore超滤器，
冷冻干燥机(丹麦)，多用电泳仪(北京六一仪器厂)，
高效液相色谱仪(Shimadzu公司)，酶标测定仪
(Bio-Rad公司)，LDI一1700激光解析电离飞行时
间质谱仪(Biomlecular公司)。
2方法与结果
2．1 鹿茸粗总蛋白的提取分离：取新鲜梅花鹿茸
500g，洗净，胶体磨匀浆，不断加人预冷的匀浆液
(20mmol／LTris—HCl，pH7．0)，4500r／min离心
30min，离心液以80％硫酸铵沉淀，取沉淀以大量
20mmol／LTris—HCl，pH7．0缓冲液透析除去硫
酸铵，内透液冻干，得梅花鹿茸蛋白粗提物33．258
g，于～20℃保存。粗总蛋白呈黄白色粉状，易溶于
水。采用Folin一酚法[81测定得蛋白质的纯度为
47．81％。采用不连续胶系统，5％浓缩胶和15％分
离胶，以考马斯亮蓝法染色，SDS—PAGE电泳结果
见图1。
1一鹿茸蛋白粗提物2一组分D13一组分DZ4-组分D3
5一组分D2S16-组分D2S27-组分D2S38-蛋白CNTP1
9一低相对分子质量标准蛋白
1-proteincrudeextractofpiloseantler2-componentD1
3-componentD24-componentD35-componentD2S1
6-componentD2S27-componentD2S38-proteinCNTPI
9一standardproteinwithlowerrelativemolecularweight
图1 蛋白CNTP1分离纯化电泳图
Fig．1SDS-PAGEAnalysisofseparated
andpurifiedCNTPI
2．2鹿茸蛋白CNTPI的分离纯化及理化性质：取
蛋白粗提物冻干品5g，溶于20mmol／LTris—HCl，
pH8．0缓冲液，o．22弘m膜滤过，采用DEAE—
SepharoseFa tFlow阴离子交换色谱分离纯化。色
谱条件：DEAE—SepharoseF stFlow柱(20cm×
2．6cm)；体积流量：0．8mL／min；流动相：20
mmol／LTris—HCl、pH8．0缓冲液，100mmol／L
NaCl—20mmmol／LTris—HCl、pH8．0缓冲液，200
mmol／LNaCl—20mmol／LTris—HCl、pH8．0缓冲
液。结果得到3个洗脱峰，分别收集，透析，冻干，分
别命名为组分D1(4．753g)、D2(3。538g)、D3
(7．834g)(图2)。Folin一酚法测定纯度分别为
53．27％、67．71％、68．29％。组分D1、D2、D3的
SDS—PAGE电泳结果见图1，可见组分D2、D3较
纯净。
n3
0 100 200 300 400
t／min
图2鹿茸粗总蛋白的DEAE—SepharoseFastFl w
洗脱色谱图
Fig．2Elutionchromatogramofproteincrudeextract
ofpiloseantleronDEAE—SepHaroseFastFlow
取组分D21 g溶于0．5mL20mmmot／L
Tris—HCl，pH8．0缓冲液中，0．22pm膜滤过，采
用SepHacrylS一200HR凝胶过滤色谱分离纯化。色
谱条件：SepHacrylS一200HR柱(50cm×1．0cm)；
体积流量：0．5mL／min；流动相：50mmmol／L
NaCl—20mmmol／LTris—HCl，pH8．0缓冲液。收集
洗脱峰峰尖部分，透析，冻干，得到3个组分D2S1
(64mg)、D2S2(156mg)、D2S3(89mg)(图3)。
Folin一酚法测定纯度分别为84．12％、90．34％、
83．76％。各峰冻干样品的SDS—PAGE电泳结果见
图1，可见组分D2S2较纯净。
取组分D2S20．156g，溶于0．3mL20mmol／L
Tris—HCl，pH7．0缓冲液中，0．22弘m膜滤过，采用
Affi—gelBlueGel色谱分离纯化。色谱条件：Affi—gel
BlueGel柱(15cm×2．5cm)；体积流量：0．5
mL／min；流动相：1．0mol／LNaCl一20mmol／L
Tris—HCl，pH7．0缓冲液。收集洗脱峰峰尖部分，
透析，冻干，得冻干品21mg，命名为CNTPI。
Folin一酚法测定纯度为98．98％。SDS—PAGE电泳
结果见图l，表明CNTPI为单一成分。
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第8期2007年8月·1165·
CNTPI为白色絮状物，极易溶于水。SDS—
PAGE电泳中在6．7×104左右为一条带，表明其纯
度很高。采用激光解析电离飞行时间质谱仪，以芥子
酸为基质，取1pL样品进样分析，见图4。结果其相
对分子质量为6．7018×104，m／z67018．25为蛋白
CNTPI质子化分子离子峰[M+H]+，m／z
33432．35为蛋白CNTPI的双电荷离子峰EM+
2H]抖。
n，S1
0 10 20 30 40 50 60 70
t／min
图3组分D2的SephacrylS-200HR桂色谱图
Fig．3D2ElutionchromatogramofSephaeryiS-200HR
2，o炳而—百妇丽’西妇矿’面对矿气不可—1融105
，行／2
图4蛋白CNTPI激光解析电离飞行时间质谱
Fig．4MALDI—TOFMSofCNTPI
2．3鹿茸蛋白CNTP11的分离纯化及理化性质：取
组分D31 g溶于0．5mL20mmol／LTris-HCl，pH
7．40缓冲液中，0．22弘m膜滤过，采用SepHacryl
S一200HR凝胶过滤色谱分离纯化。色谱条件：
SepHacrylS一200HR柱(50cmx1．0cm)；体积流
量：0．5mL／min；流动相：100mmol／LNaCl—20
mmol／LTris—HCl，pH7．40缓冲液。收集洗脱峰峰
尖部分，透析，冻干，得到3个组分D3S1(107mg)、
D3S2(197rag)、D3S3(84mg)(图5)。Folin一酚法测
定纯度分别为91．49％、92．56％、84．74％。各组分
电泳结果见图6，表明组分D3S1、D3S2较纯净。
取组分D3S10．107g，溶于0．2mL20mmol／L
Tris—HCl，pH7．0缓冲液中，0．22肛m膜滤过，采用
Affi—gelBlueGel色谱分离纯化。色谱条件：Affi—gel
／＼
／ ＼
—一L—
O 20 40 60 80
t／min
图5组分D3SephacrylS-200HR柱色谱图
Fig．5D3ElutionehromatogramofSephacryl
S一200HR
BlueGel柱(15cm×2．5cm)；体积流量：0．5
mL／min；流动相：1．0mol／LNaCl—20mmol／L
Tris—HCl，pH7．0缓冲液。收集洗脱峰峰尖部分，
透析，冻干，得冻干品28mg，命名为CNTPⅡ。
Folin一酚法测定纯度为98．15％。SDS—PAGE电泳
结果见图6，表明CNTPⅡ为单一成分。CNTPⅡ为
白色絮状物，极易溶于水。SDS—PAGE电泳中在
4．3x104左右为一条带，表明其纯度很高。激光解
析电离飞行时间质谱见图7，显示其相对分子质量
为4．3749x104，m／z43749．21为CNTPⅡ质子化
分子离子峰EM+H]+，m／z21615．14为CNTPⅡ
的双电荷离子峰EM+2H12+。
l一组分D3S12-组分D3S23-组分D3S34-低相对分子质量
标准蛋白 5一蛋白CNTPⅡ6-蛋白CNTPⅢ
1_componentD3S12-componentD3S23-componentD3S3
4一standardproteinw thlowerrelativemolecularweight
5-protdnCNTPⅡ6-proteinCNTPⅢ
图6蛋自CNTPⅡ和CNTPm分离纯化电泳图
Fig．6SDS—PAGEElectrophorogramofseparated
andpurifiedCNTPIIandCNTPⅢ
2．4鹿茸蛋白CNTPm的分离纯化及理化性质：
取组分D3S20．197g，溶于0．4mL20mmol／L
Tris—HCl，pH7．0缓冲液中，0．22／xm膜滤过，用
Affi—gelBlueGel色谱分离纯化。色谱条件：Affi—gel
BlueGel柱(15cm×2．5cm)；体积流量：0．5mE／
min；流动相：1。0mol／LNaCl—20mmol／LTris—
万方数据
·1166· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第8期2007年8月
l 1．L。． ．JL ．，』 0。一
1．0×1042 1×1044 1×1046．0×1048．0×1041 0×105
，咒／2
图7蛋白CNTPⅡ激光解析电离飞行时间质谱
Fig．7MALDI—TOFMSofCNTPⅡ
HCI，pH7．0缓冲液。弃去流穿峰，收集洗脱峰峰尖
部分，透析，冻干，得冻干品57mg，命名为CNTP
Ⅲ。Folin酚法测定纯度为99．77％。SDS—PAGE电
泳结果见图6，表明CNTPm为单一成分。CNTPⅢ
为白色絮状物，极易溶于水。SDS—PAGE电泳中在
2．3x104左右为一条带，表明其纯度很高。激光解
析电离飞行时间质谱见图8，显示其相对分子质量
为2．3855×104，m／z23854．98为CNTPm质子
化分子离子峰即[M+H]+峰，m／z11824．83、
18653．76、47060．36分别对应于CNTPm的双电
荷离子峰[M+2H]抖、四聚体五电荷离子峰E4M+
5HI抖和二聚体离子峰[2M+HI十。
1．0×1041．8×1042．6×1043．4×104．2×1045．0×104
m／z
图8蛋白CNTPm激光解析电离飞行时间质谱
Fig．8MALDI—TOFMSofCNTPm
以6mol／LHCl，105℃水解24h，采用PICO—
TAG法在BASELIN810氨基酸自动分析仪上检
测CNTPⅢ的氨基酸组成[9]，结果见表1。结果表
明，CNTPⅢ主要含甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、天冬
氨酸。采用Edman测序法测定N末端氨基酸序列，
表1蛋白CNTP19的氨基酸组成分析
Table1 AminoacidcompositionanalysisofCNTPⅢ
氨基酸 物质的量比例／％ 氨基酸 物质的量比例／％
Tvr 2．51 Pro 4．46
AsD 10．19 Ala 10．27
G1u 13．07 Val 4．97
Ser 4．55 Ile 4．02
His 7．98 Leu 7．53
Arg 4．08 Phe 3．36
G1v 13．82 Lys 2．06
Thr 6．25
对蛋白质从N末端开始进行逐步降解，对降解的氨
基酸用HPG1000蛋白测序仪进行分离鉴定，结果
CNTP皿N末端氨基酸序列为GDRGTAA
KHALDEEP。
2．5鹿茸蛋白CNTPⅢ药理活性的测定
2．5．1 培养条件：小鼠海马细胞HT22细胞培养于
含10％小牛血清(FBS)的IMDM培养基中，37。C，
5％CO。培养。每周更换培养基2～3次，用0．25％
胰蛋白酶工作液消化分散细胞，进行传代培养。
2．5．2体外促细胞增殖活性的测定：取对数生长期
的HT22细胞，用0．25％胰蛋白酶消化后，用培养
液(含10％小牛血清的IMDM)调细胞密度为5×
105／mL，接种于96孔板，每孑L接种0．1mL，于37
℃，5％CO。中培养4h。取0．1mL不同质量浓度待
测样品加入到IMDM培养液中。每种样品10个复
孔，对照为不含药物的IMDM培养液。继续培养36
h后，每孔加入20肛L5mg／mLMTT，继续孵育4
h。将孔内液体吸干净后，每孑L加入0．15mLDM—
SO，微孔震荡仪上震荡至颗粒完全溶解，在BIO—
RAD680酶标仪上测定490nm波长处吸光度(A)
值，结果见表2。鹿茸蛋白CNTPⅢ能够明显促进小
鼠海马神经细胞增殖，并且这种促进作用具有量效
关系，即随着质量浓度的提高，促生长活性增加。
表2鹿茸蛋白CNTPⅢ对HT22的体外作用
Table2 EffectofCNTPⅢonHT22cellinvitro
与对照组比较：’P<0．05
。P3讨论
’。P⋯PSwiss—Prot和GenBank蛋白序列库检索结果
表明CNTPm蛋白序列与已知蛋白序列的同源性
远远小于50％，提示其可能是源于鹿茸的新蛋白，
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第8期2007年8月·1167·
序列中所含的丙氨基酸比例占15％，预示着此蛋白
二级序列结构为一个普通的a螺旋结构。
鹿茸蛋白CNTPill对于生长状态不良的细胞
的促生长作用更明显，如处于复苏期的细胞等，但是
平行实验研究表明鹿茸蛋白CNTPI对小鼠海马神
经细胞有微弱增殖作用，蛋白CNTPⅡ则无作用。
电泳实验表明，蛋白CNTPI反复冻融后会少
量分解为蛋白CNTPⅡ和CNTPⅢ。结合激光解析
电离飞行时间质谱所测定的三者的相对分子质量可
以看出，CNTPI的相对分子质量(6．7018×104)为
CNTPⅡ(4．3749×104)与CNTPIII(2．3855×
104)的之和，提示蛋白CNTPⅡ和CNTPⅢ可能为
蛋白CNTPI的两个亚基。
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3．九江学院，江西九江332005；4．天津大学，天津300072)
摘要：目的研究大孔吸附树脂纯化黄连总生物碱的工艺。方法采用LD605、D101、DA201、NKA一9、AB一8大
孑L吸附树脂对黄连总生物碱进行吸附纯化。以总生物碱的收率、质量分数为考察指标综合评价。结果 AB一8大孔
吸附树脂具有最佳的吸附洗脱参数，其动态饱和吸附一洗脱量达1。23mg／g，2倍体积蒸馏水、2倍体积40％乙醇依
次洗脱，总生物碱收率为85％，质量分数为80％。结论AB一8大孔吸附树脂对总生物碱综合性能较好，适合于黄
连总生物碱的分离纯化。
关键词：黄连；总生物碱；AB一8树脂；分离纯化
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)08—1167—04
Separationandpurificationof otaIlkaloidfromRhizomaCoptidis
bymacroreticularadsorbentr sin
XUXiao—hon91，ZHANGTie—jun2，LIAOMao—lian92，LIUKe—yue3，WANGWen—fan94，WUYan—ji4
(1．TianjinUn versityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China；2．TianjinInstitute
ofPharmaceuticalResearch，Tianjin300193，China；3。JiujiangUniversity，Jiujiang
332005，China；4．TianjinUniversity，Tianjin300072，China)
Abstract：ObjectiveTostudythetechnologyforpurificationof otal kaloidsfromRhizomaCop—
tidisbymaeroreticularadsorbentsin．MethodsLD605，D101，DA201，NKA一9，andAB一8typesof
macroreticularadsorbentr sinswerreusedtoseparateandpurifythetotalkaloidfromRhizomaCoptidis．
Theyieldsandpuritiesoftheproductswerecomparedasindexes．ResultsAB一8Typemacroreticularad—
sorbentresinhadoptimumadsorptionandelutionparameterswithitsdynamicsaturateddsorptionratio
upto1．23mg／g．Afterelutedwith2BVofdistilledwaterand2BV40％ethanol，theyieldsoftotalka一
收稿日期：2006—10-08
作者简介：徐晓宏，女，在读硕士，主要方向为中药研究与开发。
*通讯作者张铁军Tel：(022)23006848
万方数据
梅花鹿鹿茸中促进海马神经细胞增殖蛋白的分离纯化
作者： 严铭铭， 曲晓波， 钟英杰， 赵大庆， 刘宁， 刘志强， 刘淑莹， YAN Ming-ming， QU
Xiao-bo， ZHONG Ying-jie， ZHAO Da-qing， LIU Ning， LIU Zhi-qiang， LIU Shu-
ying
作者单位： 严铭铭,曲晓波,钟英杰,赵大庆,YAN Ming-ming,QU Xiao-bo,ZHONG Ying-jie,ZHAO Da-
qing(长春中医药大学,研发中心,吉林,长春,130117)， 刘宁,刘志强,刘淑莹,LIU Ning,LIU
Zhi-qiang,LIU Shu-ying(中国科学院,长春应用化学研究所,吉林,长春,130023)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(8)
被引用次数： 5次

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LIU Dong-yan.YANG Fu-he 梅花鹿茸保健饮品抗疲劳作用机理初步探讨[期刊论文]-经济动物学报2009,13(4)
8. 高志光.Gao Zhiguang 梅花鹿鹿茸生长及骨化与碱性磷酸酶的关系[期刊论文]-吉林林学院学报1999,15(4)
9. 魏海军.常忠娟.吴建新.张学文.王晓伟.张宇.赵伟刚.赵蒙.WEI Hai-jun.CHANG Zhong-juan.WU Jian-xin.
ZHANG Xue-wen.WANG Xiao-wei.ZHANG Yu.ZHAO Wei-gang.ZHAO Meng 生长抑素耗竭剂CS57对生茸后期梅花鹿血清
IGF-1浓度和再生茸生长的影响[期刊论文]-特产研究2005,27(3)
10. 陈志强.张洁.章建群 梅花鹿茸片、马鹿茸片及其伪劣品的经验鉴别[期刊论文]-海峡药学2002,14(2)
引证文献(5条)
1.万志强.严铭铭.展月.邵帅.于雷.于红威.赵大庆 五味子蛋白的提取纯化及含量测定[期刊论文]-中国实验方剂学
杂志 2011(17)
2.顾鹏毅.宋琳.孙晋民.梁再赋 鹿茸中促神经生长物质的研究进展[期刊论文]-中国老年学杂志 2010(4)
3.何忠梅.王铁成.赵文杰.王怀生 鹿茸多肽生长因子研究进展[期刊论文]-经济动物学报 2011(3)
4.张郑瑶.尚禹东.牟凤辉.陆成伟.郑清川.周秋丽 鹿茸多肽及其生长因子制备工艺的研究进展[期刊论文]-特产研
究 2011(3)
5.侯召华.张宇.金春爱.赵昌德.孙晓东.崔松焕 鹿茸化学成分及提取方法研究进展[期刊论文]-特产研究 2012(2)


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