全 文 ：中革蒋 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月·1409·
量高时，植株体内磷量相应提高，根细胞膜磷脂成分
随之增加，根细胞膜透性降低，宿主向根外分泌的菌
根菌赖以生存的光合产物数量减少，导致侵染率降
低。在高磷条件下，植物根系无需菌根帮助就可吸收
所需的全部磷素，而菌根菌则需相当数量的光合产
物维持其生长发育。同时，菌根化的根比非菌根化的
根消耗更多能量[8]。因此，AM真菌与宿主对光合产
物的竞争导致了植株生长量的降低。因此可见，过高
施磷量不利于AM真菌生长发育及对宿主植物的侵
染，甚至对宿主植物生长有抑制作用。本试验结果也
证明了这一点。
柴胡接种AM真菌后，提高了植株叶片光合色
素和植株可溶性糖的量，并且同一施磷水平下接种
株各指标明显优于非接种株。这可能缘于AM真菌
促进了柴胡根系对土壤矿质元素(特别是磷素)的吸
收，提高了柴胡体内磷素等营养元素的量，而柴胡磷
量的提高，不仅有利于光合磷酸化等许多与光合作
用有关的环节正常运行，也可促进光合产物的运输
和分配[9]，光合产物向根的运输和分配又促进了
AM真菌的生长发育和对宿主根系的侵染[10。，如在
本试验中，由于AM真菌的旺盛生长依赖于宿主根
系光合产物的供应，造成接种混合菌剂的柴胡根系
可溶性糖的量始终低于对照株。
试验结果表明，不仅施磷量与AM真菌对柴胡生
长有明显的交互作用，而且不同菌种对柴胡的接种效果
也不同，即宿主植物和AM真菌之间存在一定的选择
性。总体而言，施磷与AM真菌两者组合比不接种相应
施磷水平的组合提高了柴胡根干质量和各生理指标量。
不论是柴胡根干质量，还是各生理指标的量，接种株在
低磷条件下的测定值都接近或超过高磷水平下未接种
株的测定值，并且施磷量与AM真菌之间存在最佳组
合关系。因此，接种AM真菌不仅对优质柴胡生产有积
极效应，而且在促进柴胡生长的同时，能够提高磷肥利
用率，减少磷肥用量。
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桔梗试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生
艾鹏飞1，卢利平2
(1．河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2．河北科技大学图书馆，河北石家庄050018)
摘 要：目的 为桔梗Platycodongrandifl071zm种质资源的保存提供一条新途径。方法采用玻璃化法研究了桔
梗试管苗茎尖超低温保存及植株再生。结果桔梗嫩梢在培养基(MS+50ADMSO+103g／L蔗糖)上培养3d，切
取2～3miTt茎尖，室温(20℃)下装载液(60％PVS：)过渡20min，0℃下玻璃化液(PVSz)处理90min，投入液氮保
存1d后，40℃水浴化冻，含410g／L蔗糖的MS培养基洗涤20min，接种于含0．6mg／LKT、0．2mg／LBA、0．05
rng／LNAA的MS培养基表面的滤纸上，暗处理1d后转移到新鲜的上述再生培养基中，暗培养1周后转到正常光
下，80％以上成活，植株生长正常。结论桔梗种质资源的玻璃化法超低温保存操作简单、成活率高、再生植株正
收稿日期：2005—12—16
荐喜蓄界：萎蔫专蔫翕銎号(，Q男D，2湖OO北30浠9水)人，副教授，博士，从事植物细胞工程与分子生物学教学、科研工作，在该领域已发表论文10余作者筒介 艾鹏飞(1974一)，男，湖北浠水人，副教授，博士，从事植物细胞工程与分子生物学教学、科研工作，在该领域已发表论文10余
篇。Tel：(0311)88632163Fax：(0311)88632642E—mail：apf2002@sina．com
万方数据
·14lO· 中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月
常，可用于生产实践。
关键词：超低温保存}玻璃化法；试管苗茎尖；桔梗
中图分类号：R282．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)09—1409—04
Cryopreservationofinvitroshoot—tipsofjV口tycodongra diflorum
byvitrificationandplantregeneration
AIPeng—feil．LULi—pin92
(1．CollegeofBiologicalS ienceandTechnology，HebeiUnivers tyofScienceandTechnology，Shijiazhuang
050018，China；2．Library，HebeiUniversityofSci nceandTechnology，Shijiazhuang050018，China)
Abstract：ObjectiveTogetanewapproachto onservethegermplasmofPlatycodongrandiflol^zAm．
MethodsAmethodofvitrificationw studiedtocryopreserveinvitroshoot-tipsofP．grandiflorum，
andtheregeneratedplantletsw reobservedsubsequently．ResultsShoot—tips，2—3mmlength，gotten
frominvitroshootsofP．grandiflorumpreculturedonMSmediums pplementedwith5％DMSOand103
g／Lsucrosefor3d，were10adedwiththe60％PVS2for20minat20℃，andincubatedinPVS2for90min
at0℃priort adirectplungingintoliquidnitrogen(LN)andkeepingfor1d．Afterrapidthawingin
waterat40℃，theshoot—tipswererinsedintheMSmediumsupplementedwith410g／Lsucrosefor20
min，andplatedonthefilterpapersustainedbytheMSregenerationmediumsupplementedwitho．6mg／
LKT，0．2mg／LBA，and0．05mg／LNAAfor1dindarkandsubculturedontheabover generation
mediumforoneweekindarkpriortoexposuretothelight．Thesurvivalofshoot—tipswaupto80％，arid
theygrewnormally．ConclusionThemethodofvitrificationtocryopreservethegermplasmofP．
grandiflorumissimpleinhandlingwithhighinsurvivalandnormalinregenerationandcabeappliedn
practice．
Keywords：cryopreservation；vitrification；shoop—tips；Platycodongrandiflorum(Jacq．)A．DC．
桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq．)A．
DC．为桔梗科桔梗属多年生草本植物，其根是我国
名贵药材之一[1]。近年来，由于肆意采伐，造成其野
生资源濒危灭绝。其种子保存有效期一般为一年，当
年的发芽率也只有70％左右；且种子繁殖易导致种
性退化和混杂现象，限制了生产的发展[1’2]。桔梗的
组织离体培养已见报道[2]。常规的离体保存需经常
继代，耗费大量人力、物力，且易污染和变异。玻璃化
法超低温保存是当前植物种质资源长期保存的理想
途径，已成功地应用于柑橘‘3|、柿‘4|、地黄‘引、马铃
薯嘲和芒果‘71等茎尖的保存。本研究以桔梗试管苗
为试材，研究影响其茎尖玻璃化法超低温保存的一
些因素，以期为桔梗茎尖超低温保存提供理论依据
和实践借鉴。
1材料和方法
1．1材料：以桔梗栽培品种腋芽为外植体，参照文
献方法[23建立桔梗茎尖试管苗无性系。
1．2方法
1．2．1茎尖的预培养：切取继代4周龄的桔梗试管
苗嫩梢(8--10mm)，接种到添加有5％二甲基亚砜
(DMSO)和不同质量浓度蔗糖的MS培养基中，于
低温(6±1)℃和弱光照800lx(12h／d)下培养
1～5d。
1．2．2装载与脱水：切取不同大小的茎尖，转移到
1．8mL冻存管中(每管不少于10个茎尖)，加入装
载液60％PVS。(含51g／L蔗糖的MS液体培养基
与PVS。溶液体积比为40：60)，室温(20℃)过渡
10～60min，玻璃化液PVS2(30％甘油+15％乙二
醇+15％DMSO+137g／L蔗糖)于室温或0℃下
脱水处理不同时间后，换成新鲜的PVS。后迅速投
入液氮保存。每次处理2管，重复3次。
1．2．3化冻、恢复培养与植株再生：保存1d后，从
液氮中取出冻存管，分别于0～80℃水浴解冻(冻存
管中的PVS。刚好全部呈液态状)后吸去PVS。，410
g／L蔗糖的MS培养液洗涤2次，每次10min。取出
茎尖，无菌滤纸吸去残留在其表面上的洗液，接种到
恢复培养基(MS+0．6mg／LKT+0．2mg／LBA+
0．05mg／LNAA+30g／L蔗糖)的滤纸上暗处理1
d，转接到新鲜的恢复培养基中，暗培养1周后转入
光下E(25±2)℃，1500x]，1周后统计成活率[成
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月·1411·
活率一(长芽+长愈伤的茎尖数)／总茎尖数×
100％]。再生植株和对照(未冻存植株)在增殖培养
基MS+0．5mg／LBA+0．05mg／LNAA+30g／L
蔗糖和生根培养基1／2MS+0．8mg／LNAA+20
g／L蔗糖中进行比较实验。
2结果与分析
2．1 蔗糖浓度和预培养时间对茎尖保存后成活率
的影响：8～10mm桔梗试管苗嫩梢接种到添加有
不同质量浓度蔗糖的MS培养基(含5％DMSO)
中，低温培养1～5d，切取2mm茎尖于室温60％
PVS2装载20min、0℃下PVS。处理90rain，液氮
保存后的结果见表1，较高的蔗糖质量浓度(171g／
L)下培养1d和适中的蔗糖质量浓度(103g／L)下
培养3d，两种组合处理都能获得较高的成活率
(75％以上)。但较高的蔗糖质量浓度(171g／L)下培
养1d的处理出现了不同重复间的试验结果一致性
较差。故以蔗糖103g／L，预培养时间3d更可取。
2．2装载时间对茎尖保存后成活率的影响：桔梗试
管苗茎尖2mm，室温下60％PVS。中装载0～60
表1蔗糖质量浓度和预培养时间对茎尖
超低温保存后成活率的影响
Table1 Effectofsucroseconcentrationandpreculture
timeonsurvivalrateofshoop—tipsafter
cryOpreservation预培养时间，a——百ii——堕塑萼嚣爹兰里塑塑写翟雩箬}‰
图1 装载时间对茎尖超低温保存后成活率的影响
Fig．1Effectofloadingtimewith60％PVS2onsurvival
rateofshoot-tipsafterc yopreservation
min，O℃下PVS。处理90min后液氮保存，结果如
图1所示，o～20min内，茎尖成活率随装载时间的
延长在增高，20～60min内，茎尖成活率基本保持
不变，故桔梗试管苗茎尖于室温下60％PVS。中装
载20min即可。
2．3 PVS。处理温度和时间对茎尖保存后成活率的
影响：玻璃化液保护性处理是玻璃化法超低温保存
最关键的步骤之一。本试验采用桔梗预培养后的2
mm茎尖，60％PVS。预处理20min，分别于0、20℃
下PVS。处理o～120min后液氮保存，结果见表2。
没有经过PVS。处理的材料不能成活，经PVS。处理
后材料的成活率随处理温度和时间而变化，0oC相
对20℃，处理效果普遍要好，其中0℃下90min的
处理成活率最高(81％左右)。这可能是PVS。对茎
尖组织保护性脱水的同时引起了其化学毒害作用，
而0℃条件下化学毒害作用比在20℃下要小得多
的缘故。因此，0℃下PVS。保护性脱水90min更
可取。
表2 PVS：处理温度和时间对茎尖超低温保存后成活率的影响
Table2 Effectof emperaturendtimeofexposingwithPVSzonsurvivalrateofshoot—tipsafterc yopreserVation
2．4茎尖大小对茎尖保存后成活率的影响：材料大
小对保护性脱水程度影响较大。材料大，不易脱水；
材料小，易于脱水，但冷冻保护剂对其毒害作用加
大。本试验采用预培养后的约1、2、3、4．5mm4种长
度桔梗试管苗茎尖，60％PVS。20min，0℃下PVSz
90min后液氮保存，结果如图2所示，1、4．5mm左
右的茎尖成活率相对较低，2、3mm左右的较高，二
者都在80％以上。故茎尖大小宜在2～3mm。
2．5化冻温度对茎尖保存后成活率的影响：化冻温
度是影响材料超低温保存效果的重要环节。本试验
IOO
80
《60
曩40
餐20
O
l 2 3 4．5
茎尖大小／m
图2茎尖大小对茎尖超低温保存后成活率的影响
Fig．2Effectofsizeofshoot_tipsonsurvivalrate
ofshoot—tipsafterc yopreserVatiOn
万方数据
·1412· 中草115 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月
设计了4个化冻温度，结果表明，液氮超低温保存后
的桔梗试管苗茎尖，随着化冻温度的升高，其成活率
相应增高，但过高的化冻温度(80℃)导致试验的重
复性差(表3)。这可能是因为茎尖化冻是一个瞬间
过程，化冻温度过低引起组织的次生结冰，而过高又
难以掌握，加剧化学性的生理毒害。故选择40℃的
化冻温度更理想。
表3化冻温度对茎尖超低温保存后成活率的影晌
Table3 Effectof hawingtemperatureonsurvival
rateofshoot—tipsafterc yopreservation
处理 至旦些壅塑壅!塑堕堡皇!墅
0℃ 20℃40℃80℃
1 1l·23 35·11 81·58 91·98
2 12．11 37．24 82．37 75．23
3 10．05 33．98 80．96 85．35
±塑墼 !!：!i圭!：!ii!：!!圭!：!!!!：!!圭!：!!!!：!!圭!：!1
2．6再生植株的扩增、生根：液氮超低温保存后的
桔梗试管苗茎尖转接到恢复培养基MS+0．6mg／L
KT+0．2mg／LBA+0．05mg／LNAA+30g／L蔗
糖，暗培养1周后转入正常光照下培养，2～3d后茎
尖转变为绿色；1周后，茎尖的叶原基发育成新叶
(图3-A)；4周后，茎尖直接发育成植株。再生植株
转接到增殖培养基MS+0．5mg／LBA+0．05mg／
LNAA+30g／L蔗糖中进行扩繁。4周后，增殖倍
数达到16～20倍(图3一B)。再生植株与对照植株转
接到生根培养基1／2MS+0．8mg／LNAA+20g／L
蔗糖诱导生根，2周后，二者均能正常生根，生根率
都在95％以上(图3一C)。目前，再生植株生长和分化
正常，进一步遗传稳定性检测在进行中。
图3桔梗试管苗茎尖超低温保存后的再生
Fig．3Regenerationofcryopreservedinvitroshoot。
tipsofP．grandiflorumbyvitrification
3讨论
材料预培养是超低温保存的重要环节[8]。不同
的植物材料，预培养方式也不相同。柑橘[3]试管苗茎
尖超低温保存中，5％DMSO预培养3d成活率最
高；柿啪茎尖超低温保存中，103、171、2399／L蔗糖
各1d的效果最好。而本试验中，在预备试验时单独
添加DMSO、甘油或蔗糖预培养，均没有提高保存
后材料的成活率，而用5％DMSO和103g／L蔗糖
的组合处理中成活率得到了大幅度提高，且与培养
温度也有较大相关性。其原因可能是不同的植物材
料对预培养保护性脱水的“敏感度”不尽一样。
DMSO属于渗透性的保护剂，易渗透到细胞内使其
脱水不彻底；蔗糖是非渗透大分子物质，能让细胞胁
迫脱水，二者组合处理更能达到保护性脱水的目的。
具体原因有待探讨。
植物茎尖超低温保存中，不同材料、不同方法最
适PVS。处理时间也不相同[8。。一般来讲，较低温度
下(o℃左右)处理时间长些；较高温度下(20℃左
右)处理时间短些，但较高温度下加剧了对材料的化
学毒害作用。柑橘‘引、柿Ⅲ、地黄[引、马铃薯‘63和芒
果口3等茎尖的超低温保存中，选用的PVS：处理时
间各不一样。本试验结果也证实了这一点。
本试验采用玻璃化法超低温保存桔梗试管苗茎
尖，不仅成活率高，且保存后的再生植株生长和分化
正常，快速繁殖效率也高。其原因可能是低温保存过
程本身的筛选效应和低温处理的后滞效应共同导致
的结果。相关研究有待开展和深入。
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万方数据
桔梗试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生
作者： 艾鹏飞， 卢利平， AI Peng-Fei， LU Li-ping
作者单位： 艾鹏飞,AI Peng-Fei(河北科技大学生物科学与工程学院,河北,石家庄,050018)， 卢利平
,LU Li-ping(河北科技大学,图书馆,河北,石家庄,050018)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(9)
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